噬菌体效价的测定
噬菌体的效价测定
裂解 成熟
增殖
侵入 吸附
⑤
★烈性噬菌体与温和噬菌体旳生活史比较：
裂解性循环 屡次循环
溶原性循环
自发或诱导
同步复制 整合
⑥★溶源性菌株旳检验：
措施：在合适旳培养基中培养待测菌样→→在对 数期进行紫外线照射，诱导原噬菌体复制→→进 一步培养→→过滤培养物，去处活菌体→→滤液 与指示菌混合、倒平板（或将滤液加到敏感性指 示菌旳液体培养物中）→→观察是否有噬菌斑出 现（或使菌液变清）.
★一步生长（One-step growth)
成 熟 的 噬 菌 体 粒 子 ， 除 M13 等 少 数 噬 菌 体 外 ，均 借宿主细胞裂解而释放。细菌的裂解导致一种肉眼可 见 的培养物溶解。 噬菌体的这种生长 (繁 殖 )方 式 称 为 一步生长。
如果只观察一个被感染的细胞，噬菌体数目的增 殖过程将是一条垂直于时间的直线：
A mob of bacteriophage attacking E. coli
The oval object that stretches diagonally across the micrograph top-to-bottom is a single bacterium. The much smaller and far more numerous round guys, practically paving the surface of the bacterium, are the bacteriophage heads.
●敏感性指示菌——遇溶源菌裂解后所释放旳温和噬菌体 会裂解性生活周期旳非溶源性菌株，这些菌株能够从自然 界或菌种库中取得。
⑦★溶源菌有下列特征：
☆可稳定遗传，即溶源菌旳子细胞一般也是溶原性 旳。 ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体旳潜在能 力） ☆具有抗同原噬菌体感染旳“免疫性” ☆溶源性细菌旳复愈 ☆取得新旳生理特征（溶源性转变） ☆不足转导
噬菌体效价的测定
（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？
七.实验关键问题，注意事项及实验要求
1.关键问题：稀释，温度，倒板
2.注意事项：移液器使用及登记，
3.实验要求
4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。
5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）
6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。
八.物品准备
1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）
2.M13KE：每组一只（1ml）
3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）
4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）
5.EP管，Tip头用量
噬菌体效价的测定
一.目的要求
1.学习噬菌体效价测定的基本方法。
2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。
二、基本原理:
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间
5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体裂解液的制备、噬菌体效价测定及转导
4、转导频率的测定
向一支空试管中加入 0.5mL E. coli K12S，在 37℃恒温培养箱中培养 10min。用牛肉膏 蛋白胨液体培养基将原液稀释至 10-3、10-4，每个稀释度用 0.2mL 裂解液涂两个平板，在 37℃恒温箱中培养 48h，观察结果并计算转导频率： 转导子/mL = 每皿平均转导子数 ∗ 稀释度 ∗ 2 0.2mL
2、噬菌体效价的测定 将噬菌体裂解液活化后，取 0.5mL，用 4.5mL/管的牛肉膏蛋白胨液体培养基进行 10 倍 系列稀释至稀释到原液的 10-4。 将素琼脂培养基融化后向每个试管中加入 4mL50℃的素琼脂 液体，并向每支试管中加入 0.5mL E. coli K12S，振荡使之混合均匀，再分别取 10-2、10-3、 10-4 三个稀释度的噬菌体菌悬液 0.5mL 介入素琼脂试管中。前后揉搓，使之混匀，立即倒在 含有牛肉膏蛋白胨固体培养基的平板上。 倒置与 37℃恒温培养箱中培养 24h。 噬菌体效价计
噬菌体裂解液经紫外线照射诱导后，使得原噬菌体从细菌染色体上脱离而进入裂解周期， 在宿主细菌细胞内进行复制和组装，形成大量完整的噬菌体粒子。细菌被裂解，释放出游离 的噬菌体粒子，通过离心获得噬菌体裂解液。噬菌体的效价是指 1ml 噬菌体裂解液中所含 噬菌体的数目。在含有敏感宿主菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，根据噬菌 斑形成单位，进行噬菌体效价测定。 转导分为两种类型，即为普遍性转导和局限性转导。本实验为局限性转导，以双重溶源 性细菌 E.coli K12F(λ )gal+为供体，经紫外线（UV）诱导，在噬菌体裂解液中，将含有两种 类型的噬菌体， （λ 和λ dg） ，λ dg 是缺陷噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的 基因（gal） ，当缺陷性噬菌体λ dg 再次侵染敏感菌大肠杆菌 K12S 时，会将发酵半乳糖的基 因转移到 S 菌，使 S 菌获得 gal 基因，从而使得 S 菌获得发酵半乳糖的能力，利用转导子在 EMB 培养基上发酵半乳糖的特征进行转导频率的计算和分析。
噬菌体效价的测定
实验器材
• 菌种
大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体裂解液原液
• 培养基
LB培养基，素琼脂
• 试剂仪器
Eppendorf管，移液器，水浴锅 振荡器，煤气灯等
实验步骤
• 稀释噬菌体原液 取0.1ml噬菌体原 液于0.9mlLB液体 培养基，得到10-1噬 菌体稀释液。依此类 推，稀释到10-7。
• 噬菌体与菌液混合: 取0.5ml大肠杆菌液 至50℃保温素琼脂培 养基中， 另取0.5ml 噬菌体稀释液混合。 做10-5，10-6，10-7 梯度。 。
• 手搓快速混合。
• 将已接种的上层培养基倒入底层培养基上 • 静置凝固后37℃培养24小时 • 观察噬菌斑并计数
实验结果
• 记录平板中每稀释浓度的PFU数于下表中： • 计算噬菌体效价
噬菌体稀释度 PFU数 10-2 10-3 10-4 10-5 对照
思考题
• 什么因素决定噬菌斑的大小？ • 测定噬菌体的效价，操作时要注意什么才能测定 准确？ • 计算噬菌体效价时，选择30～300个PFU的平板 计数较好，为什么？ • 在测定平板上出现其它细菌的菌落是否影响你的 效价测定？
实验 7 噬菌体效价的测定
实验目的
• 学习噬菌体效价测定的基本方法
实验原理
• 噬菌体的效价就是1ml培养液中所含活噬菌体的数量。 • 效价的测定方法一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特 异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能进行噬菌体的计数。 • 噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100％（一般偏低， 因为有少数菌体可能未引起感染），所以为了准确地表达 病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌斑形成单位（Plague-Formin
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定
1 目的
1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规 微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出 大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性，快速 检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体 数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需 12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。根据正常发酵（培养） 液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养） 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
噬菌体效价的测定
3、稀释噬菌体
取1mL含噬菌体液加入到 9mL牛肉 膏蛋白胨培养液中，采用10倍稀释法， 分别制备噬菌体稀释液（10-5、 10-6 、 10-7 ）。
4、噬菌体与大肠杆菌敏感菌混合
将已加有大肠杆菌敏感菌9皿平板 （ 10-5 、 10-6 、 10-7各3皿）中，分别 加入0.1mL噬菌体稀释液，混合后放置5 分钟。
混匀（动作？）
37℃培养5小时或 室温培养12小时
观察结果计数
教科书介绍方法的操作步骤
噬菌体稀释液 大肠杆菌培养液
0.1ml
0.9ml
混匀吸附5min
45~48℃溶化好牛肉膏 蛋白胨半固体培养基
4ml
搓动混匀后倒于 有底层的平板中
铺平
37 ℃培养5~6 小时，观察计数
思考题
1、记录结果，并进行统计分析。
实验内容三 噬菌体效价的测定
一、噬菌体效价测定的方法 （梯度稀释）
▪ 斑点试验法 ▪ 液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清） ▪ 双层平板法——最常用，优点较多 ▪ 单层平板法 ▪ 载玻片法——快速 ▪ 其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、
电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝 集、ELISA——酶标仪）
实验内容二 噬菌体知识介绍
一、几个重要概念
1、噬菌体： ▪ 是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等
微生物的病毒，分布极广，个体很小， 在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。 ▪ 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌 蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈 蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。
2、噬菌斑：
在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透 明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞 裂解形成的，其形状、大小不等。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
实验十二 噬菌体效价的测定
实验十二噬菌体效价的测定一、实验目的1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。
2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。
因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。
但由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞裂解死亡，并在琼脂培养基表面形成是菌斑，所以人们可以此来判断噬菌体的存在。
当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。
噬菌体的效价：１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高，计算准确。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
双层琼脂平板的配制：底层平板（1.5~2％琼脂的LB培养基10ml)，将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附，加入45°左右的半固体琼脂糖，迅速混匀铺平板作为上层。
计算公式：噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10；（这里的10为换算单位，即实验中用到100μl噬菌体原液，换算成1000μl，即1ml时，要乘以10）三、操作步骤流程图流程步骤目的1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入无菌培养皿，每皿约10~12ml.水平放置，凝固后做好稀释度标记。
1、提供细菌生长营养物质2、提供更加平整的平面2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到10-1稀释液。
再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml缓冲液中得到10-2稀释液。
同理再制备10-3稀释液，并在试管上标记备用。
（稀释过程应充分混匀）通过连续稀释使单个噬菌体吸附一个大肠杆菌细胞。
3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液，经过夜培养，离心收集菌体细胞，悬浮于20ml10mM MgSO4中备用。
双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本原理
双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本原理双层琼脂平板法的基本原理是将待测噬菌体样品与特定细菌菌株混合，然后将混合物均匀涂布在琼脂平板上。
其中，第一层琼脂是富含营养物质的培养基，用于细菌生长。
第二层琼脂富含琼脂和补充有适当浓度的缓冲液、碳源和试剂等，以保持细菌的活性。
接种后，平板需要在适宜的温度下孵育，以促进细菌的生长。
在平板上形成的细菌克隆将以菌落的形式可见。
每个菌落则代表着一次噬菌体感染。
而待测噬菌体样品所含有的噬菌体颗粒会感染和破坏部分细菌，导致细菌无法生长形成菌落，从而形成“清除”的区域。
这样的清除区域可以帮助我们确定噬菌体溶解单位（PFU）或细菌杀灭单位（TU）。
为了准确测定噬菌体效价，通常需要操作多个稀释度的样品。
我们从最初的噬菌体样品中制备一系列稀释度，通常采用十倍序列进行缩倍稀释。
对于每个稀释度，我们都需要重复菌落的计数，并计算每毫升待测噬菌体样品中的噬菌体个数。
根据稀释度和噬菌体个数的关系，我们可以计算出每毫升待测噬菌体样品中的噬菌体颗粒数。
然后，进一步根据测定得到的噬菌体溶解单位或细菌杀灭单位的数值，我们可以计算出待测噬菌体样品的噬菌体效价。
双层琼脂平板法具有操作简便、结果直观等优点，常常用于测定噬菌体效价。
它可以为噬菌体疗法的开发和应用提供重要的参考数据。
同时，该方法也具有一些局限性，如无法区分有效噬菌体和无效噬菌体、无法测定噬菌体的特异性等。
因此，在进行测定时需要综合考虑这些因素以获取可靠的结果。
总之，双层琼脂平板法是一种基于细菌生长和噬菌体感染原理的测定噬菌体效价的常用方法。
通过该方法，我们可以获得待测噬菌体样品的噬菌体溶解单位或细菌杀灭单位，为噬菌体疗法的开发和应用提供参考数据。
实验七 噬菌体效价的测定
实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定实验七噬菌体效价的测定杨明轩生物1111102040128一、实验目的1、自学并掌控噬菌体效价的含义及其测量原理。
2、自学并掌控双层琼脂平板法测定噬菌体效价。
二、实验原理噬菌体属细菌病毒，侵染细菌细胞后，可以引致宿主细胞熔化丧生，并在琼脂培养基表面构成空斑，即为噬菌斑。
人们可以根据噬菌斑去推论噬菌体的存有。
噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。
其测定常用双层琼脂平板法。
由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致，且清晰度高，计算准确。
该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层，最后倒置培养。
只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。
根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。
公式为：噬菌斑构成单位（pfu/ml）＝噬菌斑数×吸收倍数×10（注：需要说明的是，“×10”表示换算单位，根据本实验步骤，因为加入的是100ul噬菌体原液，换算成1000ul，即1ml，因此“×10”，如有变动更改则需另行计算）本实验挑选的就是λ噬菌体ea94，它就是一种被改建过的烈性噬菌体。
三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（escherichiacoli）le392；2、噬菌体：λ噬菌体ea94；3、培养基：300ml三角瓶中分装100mllb培养基，15×150mm试管分装4ml0.7%琼脂糖；4、杀菌物品：20%麦芽糖，1mol/lmgso4，10mmol/lmgso4，18×180mm试管灌装4.5ml和20ml噬菌体缓冲液，100ml离心管，500μl枪头，200μl枪头，微离心管，培养皿；5、仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。
四、实验方法1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备：将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液（内含0.5ml20%8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/l灭菌mgso47h20）中，经37℃过夜培养后，4000转/分，15min离心收集菌体细胞，然后悬于20ml10mmol/lmgso4中，备用。
双层平板法测定噬菌体效价的原理
双层平板法测定噬菌体效价的原理一、引言噬菌体是一种专门寄生于细菌体内的病毒，可以通过感染和杀死宿主细菌来控制细菌数量。
测定噬菌体效价是评估噬菌体活性和浓度的重要方法之一。
双层平板法是常用的测定噬菌体效价的方法之一，本文将详细介绍双层平板法测定噬菌体效价的原理。
二、仪器与试剂1. 噬菌体悬液：含有足够数量的噬菌体，用于感染宿主细胞。
2. 宿主细胞：适合噬菌体生长和复制的细胞。
3. 导管或微量移液器：用于移液。
4. 烧杯或容量瓶：用于配制琼脂。
5. 琼脂：用于制备双层平板。
6. 加热设备：用于消毒琼脂和灭活宿主细胞。
三、实验步骤1. 制备下层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
2. 制备上层琼脂：将适量琼脂加入烧杯或容量瓶中，加入适量培养基和宿主细胞悬液，加热至完全溶解，然后冷却至约50℃。
3. 取下层琼脂约1-2mL放入试管中，倒置试管使琼脂均匀附着于试管壁。
4. 等待下层琼脂凝固。
5. 将上层琼脂与宿主细胞悬液混合均匀后取出适量液体（通常为0.1-0.2mL），加入噬菌体悬液中并混合均匀。
6. 取出一定数量的上述混合液滴到已经凝固的下层琼脂表面上，并轻轻晃动试管使混合液均匀分布于下层琼脂表面上。
7. 等待双层平板凝固并在恰当的条件下培养宿主细胞和噬菌体。
通常在37℃、5%CO2、湿度100%的条件下培养16-20小时。
8. 观察双层平板上的细胞和噬菌体生长情况，记录噬菌体效价。
四、原理1. 下层琼脂：下层琼脂是一种固态培养基，用于支撑和定位上层琼脂。
下层琼脂通常不含任何添加物，以便于观察宿主细胞和噬菌体的生长情况。
2. 上层琼脂：上层琼脂是一种含有宿主细胞悬液的固态培养基，用于感染噬菌体并观察其效应。
在上层琼脂中加入宿主细胞悬液可以提供足够数量的宿主细胞，并为噬菌体复制提供必要的条件。
3. 噬菌体悬液：噬菌体悬液中含有足够数量的噬菌体，可以感染并杀死宿主细胞。
9噬菌体效价学习资料
噬菌体效价的测定一、实验目的1、了解温和噬菌体与宿主菌之间的溶原关系；2、学习利用溶原性细菌制备噬菌体裂解液方法；3、学习双层平板法测定噬菌体效价的方法；4、以局限性转导为例来，学习转导的基本原理；掌握转导实验的基本方法，测定转导率。
二、实验原理▪细菌转导：由噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。
▪转导可分为局限性转导和普遍性转导两大类。
普遍性转导：▪噬菌体能转导供体细菌的任何基因；如鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体、大肠杆菌的P1噬菌体、枯草杆菌的PBS1、PBS2、SP10噬菌体等；▪其机制在于这些噬菌体可以整合在供体菌染色体DNA的任何位置上。
P22噬菌体局限性转导：噬菌体只能转导供体菌染色体DNA上的某些特定基因；如λ噬菌体只能转导供体菌E.coli K12染色体上的半乳糖基因和生物素基因。
产生局限性转导的原因在于这些噬菌体仅能整合在供体菌染色体DNA的特定位置上。
λ(dgal +)λ(dbio +)λ原噬菌体▪转导实验中常用的是λ噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA 上的半乳糖基因（gal ）和生物素基因(bio) 之间，因此，它能转导gal 基因又能转导bio 基因。
噬菌体的溶原▪温和噬菌体侵染细胞后整合到宿主的染色体组中，使宿主细菌成为溶源性细菌。
▪溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解，释放出具有感染力的噬菌体。
可以用物理或化学的方法诱导，使其大部分或全部裂解。
▪检测时需要有对此温和噬菌体敏感的细胞，即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体，被称为受体菌。
λ(dgal +)λ裂解液中λ(dgal +)(转导噬菌体)占50%λ(正常噬菌体)占50%宿主菌染色体供体菌E.coli k 12(λ) gal+▪是一种双重溶源菌▪此菌中λ噬菌体与gal +基因紧密连锁，当其受紫外线照射后即产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有gal 基因的转导噬菌体和完整噬菌体。
实验十二 噬菌体效价的测定
4、将E. coli过夜菌摇匀，用吸管取菌液0.9ml分别加 入上面的10-4,10-5,10-6,10-7和对照试管中，摇匀；
5、将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5,106,10-7和对照，分别将4管混合液和对照管加入对应 的上层培养基试管中，每加入一管就要立即摇匀；
6、将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 放在台面上摇匀，使上层培养基布满平板，待平 板凝固后，置37℃培养过夜。
10-2
10-1
噬菌体原液
0.5ml 10-3 0.1ml
0.5ml 10-4
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A
稀释噬菌体 试管中装4.5ml水
0.1ml
0.1ml
灭菌后待用
B 空EP管中加入： 大肠杆菌0.9ml
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
噬菌体0.1ml 对照中换成0.1ml水 C 将全部混合液 （1ml）加入上层 培养基内
10-4
10-5
10-6
7
对照
D
倒板，37℃培养
E 观察并记数噬菌斑
噬菌体效价测定流程图
五 实验结果
1、观测平板中的噬菌斑,将每一个噬菌斑形成单位 (pfu),记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板 记数每ml未稀释的原液的噬菌体的效价. 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数
2、实验数据
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌噬菌体原液，大肠杆菌；
2、培养基：上层培养基（5管/组），LB平板（5个/ 组）；
3、4.5mL无菌水（7管/组）；
4、EP管（5管/组）。
四、实验步骤
1、过夜培养物出现澄清，用无菌滤头过滤纯化获得噬 菌体滤液；
噬菌体效价
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1 菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2 培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体效价的测定方法
噬菌体效价的测定方法噬菌体效价的测定方法1. 引言噬菌体效价的测定方法是研究噬菌体杀菌能力的重要手段。
本文将详细介绍几种常用的噬菌体效价测定方法。
2. 噬菌体效价测定方法斑点法斑点法是最常用的测定噬菌体效价的方法之一。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.在琼脂平板上均匀涂敷被测细菌悬浮液。
3.取一定体积的已知浓度的噬菌体溶液滴在已涂敷的平板上，静置一段时间。
4.观察液滴周围是否出现菌落溶解区，根据出现溶解区的数量和大小，推断噬菌体的效价。
流式细胞术法流式细胞术法是一种快速测定噬菌体效价的方法，适合大规模实验。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将被测细菌悬浮液加入流式细胞仪中，通过光散射和荧光信号检测细菌的状态。
3.依据细菌的状态判断噬菌体的效价。
确定感染能力的法确定感染能力的法是一种精确测定噬菌体效价的方法，可以测定细菌在固定时间内被噬菌体感染的能力。
具体步骤如下：1.准备一系列浓度递减的噬菌体溶液。
2.将细菌与噬菌体溶液接触一定时间后，离心沉淀细菌。
3.通过对沉淀细菌进行计数或直接培养识别，确定细菌被感染的数量。
4.根据感染数量和噬菌体浓度计算噬菌体的效价。
3. 结论本文介绍了斑点法、流式细胞术法和确定感染能力的法三种常用的噬菌体效价测定方法。
这些方法各有优缺点，研究者可以根据实际需求选择合适的方法进行噬菌体效价的测定。
4. 斑点法的优点和缺点优点•斑点法操作简单，易于掌握。
•可以同时测定多个噬菌体效价，提高效率。
•结果直观，通过观察菌落溶解区可以准确判断噬菌体效价。
缺点•斑点法需要较长的时间来观察菌落溶解区的形成，耗时较长。
•结果的定量分析相对不准确，只能通过观察溶解区数量和大小来推测效价。
•受到环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
5. 流式细胞术法的优点和缺点优点•流式细胞术法速度快，可对大量样本进行高通量分析。
•结果定量准确，可以精确地获得细菌的状态信息。
噬菌体裂解液的制备和菌种的保藏、噬菌体效价的测定、细菌转导测定、凝聚反应、沉淀反应
2.取0.5mL裂解液,37C预热10分钟
3.把上述S菌和裂解液混合均匀，37C预热10分钟
4.用牛液把混合液稀释至10-3及10-4
5.取10-3及10-4稀释度0.2mL涂布EMB平板,于37C培养至少48hr,观察结果
3、凝集反应
按图加抗原和抗体及对照，静置5~10min，先用肉眼观察，后用显微镜在低倍镜下观察。
2.按右图所示在皿底用记号笔画好标记。
3.接种无菌操作，取矢量培养活化的K12 S gal-菌一环，涂于S标记处；取适量活化的K12 F gal+菌液，划线接种于F标记处；取适量噬菌体裂解液，涂于λ标记处。
4.将接好的平板静置，所有菌液被培养皿吸收后再倒置，放37℃培养48~72h，观察结果。
（2）转导频率的测定
在光下观察，4个培养皿中均未发现深紫色带有金属光泽的菌落存在。
三、凝聚反应
右侧为对照组，滴加磷酸盐缓冲液（代替生理盐水）与E. coli，无明显反应。
左侧为实验组，滴加抗血清与E. coli，在室温下静置数分钟后形成肉眼可见的凝集块。
四、沉淀反应
两个载玻片菌没有观察到明显现象，没有白色沉淀线生成。
注：理想条件下，应出现如下图所示现象。
5）培养
待平板凝固后于37 ℃，培养12~16h；
根据噬菌斑数量计算噬菌体效价。
（因所测噬菌体裂解液中λdg不能形成噬菌斑，且其数量与λ数相等，故计算时乘2.）
2、细菌转导的测定
（1）点滴法
1.倒EMB平板取已灭菌的EMB培养基熔化并冷却至不烫手（约50℃），然后倒平板，冷却后翻转平板，温箱放置使表面干燥。
4、沉淀反应
将琼脂糖凝胶融化后滴加到干净的载玻片上，凝固后按下图位置打孔并在孔中滴加相应的抗原和抗体。
噬菌体效价及转导实验
噬菌体效价测定及转导姓名学号：系别：生命科学学院生物科学专业班号：实验日期：4月26日、5月3日同组同学：实验目的1.学习噬菌体效价测定的方法2.了解转导原理、学习转导实验方法实验材料菌种：E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基实验原理1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。
效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。
由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌（内含一个λ及一个λdg两种噬菌体）裂解而来的，因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。
3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解，因此能够形成噬菌斑；λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解，因此不能够形成噬菌斑4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 （λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等，因此计算时乘以2）5. λdg是缺陷型噬菌体，其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。
当λdg侵染S菌的时候，就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力，因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征（菌落有金属光泽）。
6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 （因为裂解液为0.5ml，所以要乘以2）；转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100%实验步骤一、噬菌体效价的测定1）熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红3）用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。
编号EMB1-EMB64）用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。
编号牛固1-牛固5）水浴加热5管素琼脂，溶解后置于50摄氏度下保温。
6）稀释裂解液：取0.5ml裂解液，加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，稀释成了10^-1的稀释液，以此方法，再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。
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噬菌体原液
10-2 10-1
0.5ml 10-3 0.1ml 0.1ml
0.5ml 10-4 0.1ml
0.5ml 10-5 0.1ml 10-6
A：稀释噬菌体——试 ：稀释噬菌体 试 管中装4.5ml水灭菌后 管中装 水灭菌后 待用 B：空试管中加入大肠 ： 杆菌菌液0.9ml+噬菌体 杆菌菌液 噬菌体 0.1ml ，对照中换成 0.1ml水 0.1ml水 C：将全部混合液 ： （1ml）加入融化的 ） 48℃上层培养基内 ℃
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
10-4
10-5
10-6
10-7
对照
D：倒板，37℃培养 ：倒板， ℃ E：观察并记数噬菌斑 ：
噬菌体效价测定流程图
五、实验结果 1、观测平板中的噬菌斑,计数噬菌斑形成单位(pfu), 、观测平板中的噬菌斑,计数噬菌斑形成单位(pfu), 记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板计算每 记录实验数据,并选取30-300个pfu数的平板计算每 ml未稀释的原液的噬菌体的效价： ml未稀释的原液的噬菌体的效价： 噬菌体效价=pfu数 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数 =pfu 2、结果分析
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液 。 、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体 的稀释液)。 2、培养基： 、培养基： 液体培养基的小试管4支 含0.9ml液体培养基的小试管 支; 液体培养基的小试管 牛肉膏蛋白胨琼脂平板(10ml培养基 培养基,2%琼脂 作底层培养 琼脂,作底层培养 牛肉膏蛋白胨琼脂平板 培养基 琼脂 基用)5个 基用 个; 琼脂培养基的试管(0.7%琼脂 作上层培养基用 支。 琼脂,作上层培养基用 含4ml琼脂培养基的试管 琼脂培养基的试管 琼脂 作上层培养基用)5支 3、仪器与其他用具： 、仪器与其他用具： 灭菌小试管5支 灭菌小试管 支， 灭菌1ml吸管 支， 吸管10支 灭菌 吸管 48℃水浴箱。 ℃水浴箱。
3、混合液加入到上层培养基中 、 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上 -4,10-5, 10-6,10-7和对照。 管上层培养基溶化， 和对照。 管上层培养基溶化 分别标上10 放置于48℃的水浴锅内。 放置于 ℃的水浴锅内。 (2) 分别将 管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中 管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 每加入一管就要立即摇匀。 每加入一管就要立即摇匀。 4、上层培养基倒入底层平板上 、 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面 将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上， 将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上 上摇匀，使上层培养基布满平板。 上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。 凝固后， 凝固后 ℃培养过夜。
四、实验操作步骤
1、稀释噬菌体 、 管含4.5ml水的试管分别标上 -3,10-4,10-5和10-6，用1ml 水的试管分别标上10 将4管含 管含 水的试管分别标上 无菌吸管吸0.5ml 10-2的大肠杆菌噬菌体，加入到 -3的试管中， 的大肠杆菌噬菌体，加入到10 的试管中， 无菌吸管吸 摇匀。依次类推，稀释至10 摇匀。依次类推，稀释至 -6管。 2、噬菌体与菌液混合 、 (1) 将5支灭菌的空试管分别标上 -4,10-5,10-6,10-7和对照。 支灭菌的空试管分别标上10 和对照。 支灭菌的空试管分别标上 (2)用吸管从 -3噬菌体稀释管中吸 用吸管从10 噬菌体稀释管中吸0.1ml加入 -4空管中，再用另 加入10 空管中， 用吸管从 加入 外一支灭菌试管从10 的噬菌体稀释管中吸0.1ml加入 -5的空 加入10 外一支灭菌试管从 -4的噬菌体稀释管中吸 加入 试管中，依次类推，直至10 的试管。 试管中，依次类推，直至 -7的试管。 (3) 将大肠杆菌摇匀 用吸管取菌液 将大肠杆菌摇匀,用吸管取菌液 用吸管取菌液0.9ml分别加入上面的 -4,10分别加入上面的10 分别加入上面的 5,10-6,10-7和对照试管中 分别将上面的试管摇匀。 和对照试管中.分别将上面的试管摇匀 分别将上面的试管摇匀10年11月
一、目的要求
学习噬菌体的效价的测定。 学习噬菌体的效价的测定。
二、基本原理
噬菌体效价：是指 液体中所含的活噬菌体的数量。 噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体的数量。 液体中所含的活噬菌体的数量 效价测定的方法：一般是应用双层琼脂平板法。 双层琼脂平板法 效价测定的方法：一般是应用双层琼脂平板法。由于含 有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑， 因此能够进行噬菌体的记数。 因此能够进行噬菌体的记数。 因为噬菌体斑记数方法其实际效率难以接近100%（一般 （ 因为噬菌体斑记数方法其实际效率难以接近 偏低，因为少数活噬菌体可能未引起感染）， ），所以为了准确的 偏低，因为少数活噬菌体可能未引起感染），所以为了准确的 表达病毒悬液的浓度（效价或滴度） 表达病毒悬液的浓度（效价或滴度）一般不用病毒粒子的绝对 数量而是用噬菌体形成单位（ 数量而是用噬菌体形成单位（plague-forming units，简写成 ， pfu）表示。 ）表示。