两面针根水提物化学成分及氯化两面针碱抗肝癌的分子机制研究

两面针根水提物化学成分及氯化两面针碱抗肝癌的分子机制研

究

两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.来源于芸香科花椒属植物,广泛分布于广西、广东、福建等地,是我国民间常用的传统中药材之一,具有行气止痛,活血化瘀,通络祛风等功效。现代药理学研究表明,两面针根部提取物有抗炎、抗菌、抗肿瘤等活性,两面针根化学成分的研究有待进一步深入。

两面针根中主要含有生物碱类、香豆素类、木脂素类和萜类等成分,文献报道生物碱为主要活性成分。氯化两面针碱（nitidine chloride,NC）是从两面针根中分离得到的生物碱类主要活性成分之一,大量研究表明,NC具有良好的广谱抗肿瘤活性,可诱导包括胃癌、结直肠癌在内的多种肿瘤细胞凋亡。

本课题组前期研究已证实,NC能显著抑制肝癌细胞增殖,但是其作用机理有待进一步深入研究。目的:本文对两面针根水提物的化学成分开展研究,寻找具有抗肿瘤活性化学成分,为进一步活性评价及机理研究提供化学基础及实验依据;提取分离得到NC用于后续药理学实验研究;采用定量蛋白质组学技术、生物信息学分析技术与分子生物学技术从整体和全局的角度研究NC对肝癌细胞蛋白表达的影响,探讨NC发挥抗肝癌的分子机制。

方法:1.采用溶剂法与色谱法对两面针根水提取物进行分离。运用

¹H NMR,¹³C NMR,ESI-MS,HMBC等谱学分析技术对分离得到的化合物进行结构鉴定。

应用HPLC分析技术,面积归一化法分析NC的纯度。采用MTT法检测化合物对肝癌细胞Bel-7402的增殖抑制率。

2.应用流式细胞术检测NC诱导肝癌细胞Bel-7402的凋亡作用。免疫印迹技

术检测NC处理后细胞内Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3等与凋亡相关蛋白的表达水平。

3.采用半数抑制浓度的NC与Bel-7402共孵育24 h后,应用基于同位素标记相对和绝对定量（Isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）的蛋白质组学技术寻找经NC处理前后Bel-7402差异表达蛋白群,通过生物信息学分析技术寻找NC作用的潜在靶点。运用免疫印迹技术及JC-1染色法验证蛋白质组学结果。

运用免疫印迹技术和实时荧光定量PCR技术检测NC对Bel-7402肝癌细胞中JNK、ERK、p38的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.从两面针根水提部位中共分离纯化得到12个化合物,目前鉴定了其中的9个化合物的结构,其中7-羟基香豆素和芹菜素为首次从本植物中分离得到。

富集NC样品并应用HPLC技术,采用面积归一化法分析其纯度大于98%,说明药物纯度可用于药理研究。MTT实验结果显示氯化两面针作用于肝癌细胞

Bel-7402后,对细胞生长有显著增殖抑制作用（p<0.05）,NC作用24 h的IC₅₀为5.058±0.438μg/ml。

2.与空白对照组相比,NC处理后Bel-7402凋亡率显著上升

（p<0.05）,Bax,Bcl-2,cleaved-caspase-3等凋亡相关蛋白的表达显著升高（p<0.05）。3.iTRAQ定量结果显示,NC处理后肝癌细胞线粒体相关蛋白表达升高;诱导c-Jun蛋白表达上调,变化倍数（Fold change,FC）为4.36±0.23倍;诱导c-Jun上游JNK蛋白表达上调,FC=1.22±0.19;JC-1染色实验表明NC处理后细胞线粒体膜电位下降,线粒体受损严重;免疫印迹法证明NC处理后细胞内

c-Jun、p-c-Jun、LC3-B蛋白表达上调,HO-1、p62蛋白表达下调（p<0.05）,

结果与iTRAQ定量结果一致,说明iTRAQ定量结果可靠;与空白对照组相比,NC作用后JNK的mRNA和蛋白表达均显著提高（p<0.05）。

结论:1.从两面针根水提部位中提取分离并鉴定得到9个化合物,包括2个香豆素类化合物,1个黄酮类化合物和6个生物碱类化合物。其中7-羟基香豆素和芹菜素为首次从本植物中分离得到;MTT结果表明NC能显著抑制肝癌细胞

Bel-7402的增殖,24 h的IC₅₀为5.058±0.438μg/ml。

2.NC能诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡,采用5μg/ml浓度NC处理细胞24 h 后,观察到促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2的表达比值达到最大,以5μg/ml NC浓度为蛋白质组学实验浓度。

3.NC处理后c-Jun蛋白及其上游JNK蛋白表达增高,NC发挥抗肝癌活性与JNK和c-Jun信号级联激活有关。