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大肠埃希菌检查法

ESCheriChia COliTeSt MethOd

1. 目的

建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。

2. 范围

适用于大肠埃希菌检查的操作。

3. 责任者

QC化验员。

4. 程序：

4.1. 简述

4.1.1. 大肠埃希菌(ESCheriChia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属

的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠

埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大

肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-MethylumbelliferyI- β

-D-glucuronide , MUG和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应

作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase ，GUD) 约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUGS GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUGf靛基质试验结合，比单用MU可提高大肠埃希菌的检出率。如MUGf Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。

如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。

4.2. 仪器、设备及用具

4.2.1. 无菌室

4.2.2. 净化工作台

4.2.3. 培养箱(36 ± 1C )

4.2.4. 高压蒸汽灭菌器

4.2.

5. 显微镜(1500X)

426. 微波炉

427. 恒温水浴（45± 1C）

4.2.8. 离心机（500 〜4000r∕min）

4.2.9. 0.45 μm± 0.02 μm薄膜及过滤器

4.2.10. 电冰箱

4.2.11. 匀浆仪

4.2.12. 366nm 紫外灯

4.2.13. 玻璃器皿、器具

4.3.试液、指示液

4.3.1. 0.9 %无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g ,加水使溶解成1000ml, 121 C

灭菌20分钟。

4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛

5.0g ,加入戊醇（或丁醇）75ml ,

充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛 1.0g ,加入95%乙醇95ml,充分振

摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。

4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g ,加95%乙醇300ml,使溶解后加水至500ml ,即得。

4.3.4. V-P 试液

α-萘酚乙醇试液：取α—萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解使成100ml。

氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。

4.3.

5. 革兰染色液

4.3.

5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95%乙醇20ml、1 %草酸铵[（NH4）2C2O4] 溶液80ml。将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h,置密闭棕色瓶，可存放数月。

4.3.

5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml ,置棕色瓶备用。

4.3.

5.3. 脱色液95 %乙醇

4.3.

5.4. 沙黄（番红）染液沙黄（SafranineO）0.25g、95%乙醇10ml、蒸馏水

适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。

4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g ,加水溶解使成100ml。

4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g ,加1mol∕L氢氧化钠溶液

0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。变色范围pH6.0〜7.6（黄→红）

4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g ,加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L

氢氧化钠溶液16ml ,每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。变色范围pH6.0〜7.4（黄→红）。

4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g ,加水溶解使成100ml。

4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9 %氯化钠溶液使成100ml, 121C灭菌20分钟。

4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）取磷酸氢二钠2

5.8g与磷酸二氢钠4.4g , 加水稀释至1000ml, 121C灭菌20分钟。

4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g ,加入含10ml水的具塞试管中，121 C灭菌20分钟。