微生物学课件-

(四）昆虫DNA病毒作为真核生物基因工程的载体：
昆虫病毒杀虫剂的特点：
（1）优点 致病力强，使用量少 专一性强，安全可靠 抗逆性强，作用持久 生产简便，成本低廉
• （2）缺点：
• 工业化大量生产比较困难 • 不易保存
• 作用速度慢
• 抗药性的产生
• 杀虫谱窄
• 国内外研究进展：
• 目前，国际上昆虫病毒杀虫剂正式登记注册仅11种，而我国正式登记 的仅有包括斜纹夜蛾核型多角体病毒（虫瘟1号）在内的5种。在我国 每年28万t杀虫剂市场中影响甚微，未形成优势和规模。
第二节 亚病毒
概念与分类
• 凡在核酸和蛋白质两种成分中，只含有其中之一的分子病 原体，称为亚病毒。 • 亚病毒可以分为三类： • 类病毒 • 拟病毒 • 朊病毒
一、类病毒
• 类病毒(Viroid)是一类只含RNA • 类病毒又称感染性RNA、病原 RNA；壳病毒，是一种和病毒 一种成分、专寄生在活细胞内 的分子病原体。 (virus)相似的感染性颗粒的基因 组为单股闭合环状的RNA分子， • 最早是在1970年代在马铃薯纺 分子量约105Da（“真病毒” 锤形块茎病（potato spindle 为106～108Da） 。 tuber, PSTD）中发现的。现已 经在很多植物的病害中找到它 • 类病毒迄今已发现的类病毒已 有18种，其中多为植物类病毒。 的足迹。在电镜下可见到这 RNA分子呈50nm长的杆状分子， 共有359个碱基对，并证实是游 离的RNA，为此正式命名为类 病毒。
致病机制
• 一种说法认为合成朊病毒所需 的信息，有可能是存在于寄主 细胞之中的，而朊病毒的作用， 仅在于激活在寄主细胞中为朊 病毒的编码的基因，使得朊病 毒得以复制繁殖。 • 另一种学说认为朊病毒的蛋白 质能为自己编码遗传信息。这 种假说与传统的分子生物学中 的“中心法则”是相违背的， 因为朊病毒没有核酸。于是人 们假设朊病毒的复制可能的方 法，一认为是通过逆转译过程 产生为朊病毒编码的RNA或 DNA（如后者情况还需要逆转 录）必须存在逆转译酶，甚至 还要有逆转录酶。二为蛋白质 指导下的蛋白质合成，即蛋白 质本身可作为遗传信息。
研究意义
• 从理论上讲，“中心法则”认为 DNA复制是“自我复制”，即 DNA～DNA，而朊病毒蛋白是 PrP→PrP，是为“自他复制”。这 对遗传学理论有一定的补充作用。 但也有矛盾，即”DNA→蛋白质” 与“蛋白质→蛋白质”之间的矛盾。 对这一问题的研究会丰富生物学有 关领域的内容；对病理学、分子生 物学、分子病毒学、分子遗传学等 学科的发展至关重要，对探索生命 起源与生命现象的本质有重要意义。 从实践上讲，其对人畜健康；为揭 示与痴呆有关的疾病（如老年性痴 呆症、帕金森病）的生物学机制、 诊断与防治提供了信息，并为今后 的药物开发和新的治疗方法的研究 奠定了基础 。
朊病毒的特点
• 朊病毒在某些方面与常规病毒一样，都有可滤过性、传染性、致病性、 对宿主范围的特异性。 • 朊病毒是一类小型蛋白质颗粒，约由250个氨基酸组成，大小仅为最 小常规病毒的1%，且在电镜下观察不到病毒粒子的结构负染后才见 到聚集而成的棒状体 。 • 朊病毒对多种因素的灭活作用表现出抗性 ： 对物理因素：如紫外线照射、电离辐射、超声波以及80～100℃高 温，均有相当的耐受能力。 对化学试剂与生化试剂：如甲醛、羟胺、核酸酶类等表现出强抗 性。对蛋白酶K、尿素、氯仿等不具抗性。 对生物学特性上：朊病毒能造成慢病毒性感染而不表现出免疫原 性，巨噬细胞能降低甚至灭活朊病毒的感染性，但使用免疫学技术又 不能检测出有特异性抗体存在，不诱发干扰素的产生，也不受干扰素 作用。
第三节 病毒与实践
----噬菌体与发酵工业 ----昆虫病毒用于生物防治 ----病毒在基因工程中的应用
一、噬菌体与发酵工业
• 在发酵工业中常应用细菌、 真菌等菌种作为发酵菌种。 这些菌种常受到细菌噬菌 体、真菌病毒的损害，是 发酵工业的一大公害。酵 母菌如酿酒酵母、红酵母 中都有类似噬菌体的病毒， 其他真菌也有类似病毒的 存在，但不如细菌噬菌体 普遍。
• （一）噬菌体作为原核生物基因工程的载体
• λ-噬菌体，是一种含线状dsDN的温和噬菌体。 • 在λ-噬菌体的基因组中，约有一半是对生命自身生命活动十分必要的 “必要基因”，另一半则是对其自身生命活动无重大影响的“非必要 基因”，因此可以被外源基因取代而建成良好的基因工程载体。 • 优点有： 遗传背景清楚 载有外源基因时认可与宿主的核染色体合并同步复制。 宿主范围狭窄，使用安全 由于其两端各具12个核苷酸组成的粘性末端，故可组成科斯质粒。 感染率极高，比一般治质粒载体高出千倍。
• 最新动态
• 三、病毒在基因工程中的应用
• 基因工程（genetic engineering）：又称基因拼接技术和DNA重组技 术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方 法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品 种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有 力的手段。 • 基因载体：是一类能够自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除 而不影响其复制，可以置换或插入外源（目的）DNA而将目的DNA带 入宿主细胞。 • 常用的载体有质粒、噬菌体和病毒。
研究意义
• 类病毒的发现和研究室生命科学中的一个重大事件，因为它可以为生 物学家探索生命起源提供一个新的低层次上的好对象。 • 类病毒的研究科为分子生物学家研究功能生物大分子提供一个绝好的 材料。 • 类病毒的研究可为病理学家揭开人类和动、植物各种传染性疑难杂症 的病因带来一个新的视角。 • 也可谓哲学家对生命本质问题的认识提供一个新的革命性的例证。
传播途径
• 包括食用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤； • 医源性感染：如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和硬脑膜移植、角 膜移植、输血等。 • 朊病毒特点是耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，由于它不含核酸， 用常规的PCR技术还无法检测出来。 • 朊病毒存在变异和跨种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、 羊等反刍动物，未知的潜在宿主可能很广，传播的潜在危险性不明， 很难预测和推断。朊病毒可感染多个器官，已知的主要为脑髓，但在 潜伏期内除中枢神经系统外，各种组织器官均有感染，且感染多途径， 除消化道外，神经系统、血液均可感染，预防难度大，人畜一旦发病， 6个月至1年全部死亡，100%的死亡率。
• 附：卫星RNA是一种伴随植物病毒(如烟草环斑病毒)的小的自剪接RNA分子，
约350个碱基对，被病毒的壳体包裹。
朊病毒
• 朊病毒是美国学者S.B.Prusiner 在1982年研究羊瘙痒病毒时发 现的，由于它与以往任何病毒 有着完全不同的成分和致病机 制，它的发现是整个生命科学 界包括生物化学、病原学、病 理学和医学中的一件轰动的事 件而Prusiner也因此获得1997 年的诺贝尔奖。 朊病毒又称“普里昂”或蛋白 浸染子（prion，是protein infection的缩写），是一类 不含核酸的传染性蛋白质分子 发生与其相似的构象变化，从 而使宿主致病。
拟病毒的特点
• 拟病毒单独没有侵染性，必需依赖于辅助病毒才能进行侵染和复制， 其复制需要辅助病毒编码的 RNA 依赖性 RNA 聚合酶。 • 拟病毒的RNA不具有编码能力，需要利用辅助病毒的外壳蛋白，并与 辅助病毒基因组 RNA 一起包裹在同一病毒粒子内。 • 卫星 RNA 和拟病毒均可干扰辅助病毒的复制。 • 卫星 RNA 和拟病毒同辅助病毒基因组 RNA 比较，它们之间没有序 列同源性。根据卫星 RNA 和拟病毒的这些共同特性，现在也有许多 学者将它们统称为卫星 RNA 或卫星病毒。
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当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现： ①发酵周期明显延长 ②碳源消耗缓慢 ③发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现 ④发酵产物的形成缓慢或根本不形成 ⑤用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑 ⑥用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在
• 当出现以上现象时，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重 则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。这种情况在谷氨酸发酵、细菌淀粉 酶或蛋白酶发酵、丙酮丁醇发酵以及各种抗生素发酵中是司空见惯的， 应严加防范。
类病毒的特点
• 类病毒能耐受紫外线 和作用于蛋白质的各 种理化因素 • 类病毒现仅在高等植 物中发现。 • 类病类病毒仅为一裸 露的RNA分子，无衣 壳蛋白。 • 类病毒是目前已知的 最小的可传染性的致 病因子。
一种典型的类病毒:PSTD
• PSTD是一种典型的类病毒。它是一裸露的闭合环状ss RNA分子，其 相对分子质量为1.2×e5.整个环由两个互补的半体组成，其中一含 179个核苷酸，另一个含180个核苷酸，两者间有70%的碱基以氢键 的方式结合，共形成122个碱基对，整个结构中形成了27个内环。
二、源自文库虫病毒用于生物防治
• 在动物界中，昆虫是种类 最多、数量最大、分布最 大和与人类关系及其密切 的一个大群。其中一部分 对人类有益，而大量的则 对人类有害。
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长期以来，治虫方法有： （1）物理治虫 （2）化学治虫 （3）绝育治虫 （4）性激素引诱治虫 （5）生物治虫——动物治虫、以虫治虫、细菌治虫、真菌治虫、 病毒治虫
（二）动物DNA病毒作为动物基因工程的载体：
• 可作为基因工程载体的动物病毒很多，主要为SV40（simain virus， 猴病毒40），其次为人的腺病毒、牛乳头瘤病毒、痘苗病毒以及RNA 病毒等。 • 其生活周期包括引起宿主细胞裂解和转化成癌细胞两个阶段。其ccc DNA（共价闭环DNA）的相对分子质量为3000000。SV-DNA是一个 复制子，当侵染宿主细胞后，既能自我复制，也能整合在宿主的染色 体上。若在野生型SV-DNA直接接一个外源DNA，会因其相对分子质 量太大而无法正常包装，故需要使用缺失了编码衣壳蛋白后期基因的 突变株作为载体。为了补偿这一功能缺陷，这种突变株还须与其辅助 病毒一起感染，才能在宿主细胞内正常繁殖。利用这一系统，已将家 兔或小鼠的β-珠蛋白或人生长激素的基因在猴肾细胞中获得了表达。
（三）植物DNA病毒唑为植物基因工程的载体：
• 因含有DNA的植物病毒种类较少，故病毒载体在植物基因 工程中应用的起步较晚。 • 花椰菜花叶病毒（ CaMV）是一种由昆虫传播的浸染十字 花科植物的病毒，含有8kb的环状重组体任然具有浸染性。 但由于它不能与宿主核染色体发生整合，因此还无法获得 遗传性稳定的转基因植株。 • 此外，一些真核藻类的DNA病毒也有发展前景。
二、 拟病毒
• 拟病毒（Virusoid）又称类类病 毒（Viroid-like）、壳内类病毒 或病毒卫星（satellite），是指 一类包裹在真病毒粒中的有缺 陷的类病毒。 • 拟病毒首次于1981年在绒毛烟 的斑驳病毒中分离到。目前已 经在许多植物如茛菪斑驳病毒 （SNMV）、地下三叶草斑驳 病毒（ SCMoV）等病毒中发现 了拟病毒。 • 近几年来，在动物病毒中夜发 现了拟病毒，如定性肝炎病毒。
• 预防噬菌体污染的措施主要有：
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（1）决不使用可疑菌种，认真检查斜面、摇瓶及种子罐所使用的菌 种，坚决废弃任何可疑菌种。 （2）严格保持环境卫生。 （3）决不排放或随便丢弃活菌液 环境中存在活菌，就意味着存在 噬菌体赖以增殖的大量宿主，其后果将是极其严重的。为此，摇瓶菌 液、种子液、检验液和发酵后的菌液绝对不能随便丢弃或排放；正常 发酵液或污染噬菌体后的发酵液均应严格灭菌后才能排放；发酵罐的 排气或逃液均须经消毒、灭菌后才能排放。 （4）注意通气质量 空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌， 空气压缩机的取风口应设在30～40米高空。 （5）加强管道及发酵罐的灭菌。 （6）不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种。 （7）严格执行会客制度。