小麦叶片中细胞器中重金属含量测定

小麦叶片中细胞器中重金属含量测定

一实验目的

1了解生物毒性的一般方法。

2掌握匀浆器、原子吸收仪的使用。

3掌握生物样品的处理方法。

二实验原理

湿法消化：使用具有强氧化性酸混合液（如HNO3、HCl、HClO4等），式样共同加热消化，使细胞器中的金属元素锌、铜、镉以离子态溶解在消解液中。

差速离心法：细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同，在均匀密度介质中不同离心力下沉降的细胞器组成不同或在梯度介质中离心后分布于不同密度层，根据这一原理，差速离心法或密度梯度离心法就可将细胞内各种组分分离出来。分离流程：

破碎组织（匀浆或研磨）－差速离心或密度梯度离心分离细胞器－结果检验分析

原子吸收分光光度计一般由四大部分组成，即光源（单色锐线辐射源）、试样原子化器、单色仪和数据处理系统（包括光电转换器及相应的检测装置）。

原子化器主要有两大类，即火焰原子化器和电热原子化器。火焰有多种火焰，目前普遍应用的是空气—乙炔火焰。电热原子化器普遍应用的是石墨炉原子化器，因而原子吸收分光光度计，就有火焰原子吸收分光光度计和带石墨炉的原子吸收分光光度计。前者原子化的温度在2100℃～2400℃之间，后者在2900℃～3000℃之间。

火焰原子吸收分光光度计，利用空气—乙炔测定的元素可达30多种，若使用氧化亚氮—乙炔火焰，测定的元素可达70多种。但氧化亚氮—乙炔火焰安全性较差，应用不普遍。空气—乙炔火焰原子吸收分光光度法，一般可检测到PPm 级（10-6），精密度1%左右。国产的火焰原子吸收分光光度计，都可配备各种

型号的氢化物发生器（属电加热原子化器），利用氢化物发生器，可测定砷（As）、锑（Sb）、锗（Ge）、碲（Te）等元素。一般灵敏度在ng/ml级（10－9），相对标准偏差2%左右。汞(Hg)可用冷原子吸收法测定。

石墨炉原子吸收分光光度计，可以测定近50种元素。石墨炉法，进样量少，灵敏度高，有的元素也可以分析到pg/mL级。

三实验内容

1 实验液的预处理。

2 小麦叶片中细胞器中的重金属含量。

四实验仪器设备和材料清单

1 仪器设备：25ml匀浆器，电热板，原子吸收仪，石墨炉原子吸收分光光度计，电子分析天平，离心机；25ml、50ml比色管，离心管，50ml烧杯，50ml、500ml容量瓶，玻璃珠若干，剪刀，镊子。1ml、2ml、5ml、10ml、25ml移液

管，洗瓶，纱布。

2 溶液：匀浆液（组成为: 蔗糖250mmol/L，Trie-Hcl pH7.5 50mmol/L，二硫赤藓糖醇1mmol/L），浓硝酸，高氯酸，浓盐酸，蒸馏水，浓硫酸，硫酸铜，铜。

五实验步骤

1 匀浆：用电子分析天平准确称取小麦叶片，称量完放入匀浆器，加入5ml上述匀浆液，将小麦匀浆，匀浆液放于50ml烧杯中待用。

2细胞器的分离：用高速冷冻离心机在不同转速下分离细胞器。(差速离心法)

3 消化：将每次分离的细胞器溶液倒入50ml小烧杯中，放于电加热板上，加入几粒玻璃珠后，加入浓硝酸：高氯酸=3:1的溶液，慢慢升温至160摄氏度，加热至近干，如仍有颜色，再以1:3的比例加入高氯酸和浓硝酸直至颜色消失得到澄清透明的溶液。

每次分离的细胞器都重复这个步骤。

4定容：将以上消化完全的溶液转移至50ml容量瓶中，用蒸馏水定容。

5铜含量的测定

铜标准曲线的绘制：

（1）铜标准储备液：称取0.5000g金属铜，加入10m硝酸（1:1），低温加热溶解并蒸干至近干，再加入5ml硫酸（1:1），小心继续蒸发至冒白

烟，冷却后加水浸取，待盐类全部溶解，冷却后移入500ml容量瓶中，

用水稀释至刻度，摇匀。此溶液1ml含有1mg铜。

（2）铜混合标准使用液：取铜标准贮备液2.5ml，用0.2%硝酸稀释至50ml，得到50mg/L的铜溶液。

（3）铜标准曲线的配制：吸取混合标准使用液0、0.5、1.5、2.5和5ml，分别放入五个50ml比色管中，用0.2%硝酸稀释定容。

（4）用火焰原子吸收分光光度法在324.7nm条件下测定以上梯度铜溶液，并绘制铜标准曲线，求得吸光度和铜浓度的比例关系。

（5）通过铜标准曲线，计算出小麦中各细胞器中的铜含量。

（6）计算：以BCF值做指标：BCF是生物组织（干重）中化合物的浓度和溶解在水中的浓度之比，也可以认为是生物对化合物的吸收速率与生物

体内化合物净化速率之比，用来表示有机化合物在生物体内的生物富

集作用的大小。生物富集系数是描述化学物质在生物体内累积趋势之

重要指标。

,6 镉含量的测定

按上述方法，差速离心法下得到各种细胞器，细胞壁、细胞器组分用1:4 ( v/v) 的HNO3-HClO4 混合消煮, 消煮完全后, 定容、过滤, 用石墨炉原子吸收分光光度计测定各组分镉含量。细胞质组分和可溶部分的各流分无需消化, 直接用石墨炉原子吸收分光光度计测定镉含量。

7锌的测量

（1）标准曲线的绘制

取6个25ml容量瓶，分别加入5滴1:1盐酸，依次加入

0.00,0.50,1.00,2.00，3.00，4.00ml的浓度为10mg/L的锌标准溶液，用去离子

水稀释至刻度，摇匀，配成含0.00,0.20,0.40,0.80,1.20,1.60mg/L的锌标准系列，然后用带有锌空心阴极灯（213.9nm）的原子吸收分光光度计测定其吸光值，绘制标准曲线。

（2）消化：同上述消化步骤。

（3）测定：将消化液在与标准系列相同的条件下，直接喷入原子吸收分光光度计空气—乙炔火焰中，测定吸手值。

（4）计算：植物锌含量（mg/kg）=（M*V）*1000/m

M----标准曲线上得到锌的相应浓度，mg/mL;

V----定容体积，ml;

m----式样质量，g.