工业微生物育种诱变剂
第五章 工业微生物诱变育种
株时，应选择多种遗传类型的菌株作为出发菌株比较
稳妥，容易在较短时期内达到育种目的。
8. 菌种代谢特点
了解菌种代谢特点有助于选择有效的出发菌株。 有人曾研究过肌苷酸产生菌的代谢特性，发现肌苷 酸的生物合成过程与肌苷、肌苷酸及核苷酸、磷酸 化酶的活性有关，如果从产生肌苷酸野生型的枯草 杆菌中筛选到降解酶活性低而磷酸化酶活性强的作 为诱变出发菌株，一般都能得到良好的诱变效果。
6. 药品和原材料质量
药品规格和原材料来源不同，都会影响菌种的质量。
四、了解菌种有效产物中的 各种组分在代谢 合成过程中与培养条件的关系
由棘孢小单孢菌(Micromonospora echinopora) 产生的庆大霉素，其中C1是有效的组分； C2是无效
的。在发酵过程中加入适量的磷或蛋白胨以及加大 通 风量都有利于C1的合成；反之，C2的比例就上升。
菌悬液由出发菌株的孢子或菌体细胞与生理盐水或 缓冲液制备而成。对菌悬液的制备有如下的要求：
1、供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮。
细胞要新培养的，细胞生理活性方面既要同步， 又要处在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也 好。 霉菌孢子浓度约为：106ml-1，放线菌孢子浓度约 为：106~107ml-1。菌悬液通常采用生理盐水制备。如 果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制， 以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。
1. 对一般出发菌株的要求
（1）从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽 然产量较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，
正突变率高；
（2）在生产中使用的，具有一定生产能力，并且在 生产过程经过自然选育的菌株； （3）采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营 养要求低以及产生孢子早而多的菌株；
工业微生物遗传育种作业
工业微生物遗传育种作业第一章1 何谓工业微生物；2. 工业微生物菌种的生产要求是什么？3.工业微生物育种的基础是什么？迄今为止大约经历了几个发展阶段？第二章1.细菌的细胞壁有何功能？青霉素和溶菌酶怎样杀死菌？2.酵母菌、霉菌可用什么酶制成原生质体？为什么？3.细胞膜最大的特点是什么？4.根据细胞里面的结构试分析为什么高等动物的蛋白质不能在原核微生物中表达的主要原因。
5.细菌的繁殖方式有哪几种？第三章1.试述真核生物与原核生物遗传物质的主要区别。
2.DNA的构型有哪几种？3.真核微生物中含有遗传物质的细胞器存在哪些共性？4.什么是遗传密码？有什么特征？5.何谓基因，基因组？基因可以分为哪几类？其精细结构是什么？基因是怎样表达的？第四章1.何谓突变，突变型，基因突变？按分子机制突变可以分为哪几类？2.根据表型，突变可以分为几种？基因突变的特点有哪些？3.微生物抗性的来源有几种？怎么区分？4.何谓正向突变，回复突变，抑制突变，增变基因，突变热点，染色体畸变，条件致死突变，沉默突变，突变率，光复活作用？5.突变后，细胞内有哪些修复机制可以阻止DNA发生损伤？6.突变一定会引起表型变化吗？为什么？7.突变有何规律？8.何谓表型延迟？为什么会有这种现象的出现？9.移码突变后，基因编码的蛋白质一般是变短了还是更长，为什么？第五章1.诱变剂有哪几种？分别列出几种常用的诱变剂。
2.影响辐射生物效应的因素有哪些？3.UV诱变的机制是怎样的，其有效光谱是多少，剂量一般可以用哪些方法表示？4.利用UV设计一方案，将野生型E.coli诱变成营养缺陷型。
5.怎样提高UV诱变的诱变率？6.碱基类似物中的5-Bu是怎样引起正突变和回复突变的？利用其诱变育种时可以采用哪些处理办法？7.利用NTG诱变育种时其诱变机制怎样，可以怎样进行诱变？用HNO2呢？8.DNA链上的损伤是否一定发生表型的改变，尽你所能说出理由。
9.突变后基因型是否会很快出现，为什么？第六章1.从土壤中采微生物样时，应注意哪些？2.何谓富集培养？可采用一些什么办法富集？3.利用平皿生化反应分离Bac时可以用哪些方法？4.厌氧菌分离时主要用哪些方法除氧？第七章1.何谓诱变育种，其目的是什么？诱变育种有哪些显著特点？2.影响菌种在同一平皿上出现不同菌落类型的因素有哪些？3.影响诱变育种时的突变率的因素主要有哪些？4.用于诱变育种的出发株应具备哪些特点，为什么要将其纯化？诱变时为什么要制备单细胞悬液？对用于诱变时的菌又有何要求？5.确定诱变剂的种类后，怎样选择一个菌株的最适诱变剂量？6.何谓营养突变型，在营养缺陷型突变株选育过程中，有哪些方法可以淘汰野生型，简述每种方法的原理及适应对象。
第五章工业微生物育种诱变剂
亚硝酸诱发的突变
HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T
A:T
G┆C
19
亚硝酸的处理方法
1. 试剂的配制
（1）1mol/LpH4.5醋酸缓冲液
（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 （3）0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液
2.处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）
第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容：
化学诱变剂
物理诱变剂
生物诱变剂
•诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。
诱发突变(induced mutation)的发现
1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。
在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变
5-BU掺入后的复制错误
A:T
G ≡ BUe G≡ C
G≡ C
A: BUk
A:T
A:T
G ≡ BUe
A=BUk
A=T
G ≡ C→A=T
G ≡ BUe
G ≡C A: T → G ≡ C
G ≡ BUe
10
•由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的，因
此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。
•细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子，
处理浓度为25—40μg/ml,混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液
加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。
真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）， 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离
第七章工业微生物诱变育种
丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。 或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。
（三）环境条件的影响
1、诱变前预培养和诱变后培养
预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、
吖啶黄、b－重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。
后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是
立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是 让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟 现象。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
4、浓度梯度法
合成抗生素的水平与其耐自身产物能力相关。
5、应用复印技术快速筛选变株
产脂野生株、具有高脂含量的突变株。 方法：筛选培养基→ 复印→ 苏丹黑染色→洗去 多余染料→酒精脱色→干燥显色→选择深蓝色或紫 色的菌落。
6、琼脂块大通量筛选变株
适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
第四章 工业微生物育种诱变剂
（三）紫外线诱变的步骤与方法： （1）出发菌株 细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子 刚成熟。 （2）前培养 对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏 等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质， 如咖啡碱或异烟肼等。 （3）制备菌悬液 单细胞：细菌约108 ml-1；放线菌约107～108ml-1， 霉菌约106 ml-1。 （4）紫外线照射 3-5ml，搅拌；避光，提前20min预热紫外灯。结 束时冰浴1-2h。
2．甲基磺酸乙酯（简称EMS） 甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一 种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于 水，不稳定，易水解成无活性物质。 EMS的诱变处理方法： ①EMS母液的配制：为了安全和防上失效，配制前将 需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配 制。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸缓 冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中 易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。
2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种 类不同有所差异。 3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与 每种微生物修复系统的强弱有关。
二、辐射引起生物效应的影响因素
1．微生物的遗传背景 ：G+C% 2．微生物的生理状态 3．可见光 4．细胞水分 5．温度 尤其对于电离辐射，较高温度能促进氧与自由基之间的相互作 用、加速与DNA发生的化学反应。在氧气充足的条件下要比在缺 氧条件下的电离辐射的生物学效应显著。
烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及 磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起 突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟 嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂 起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是 鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主 要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2， 腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占 烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起 的突变仅是少数。 烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂， 而造成突变。
工业微生物育种
1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？工业微生物育种建立在：（1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上；（2）物理和化学诱变剂的发现和应用；（3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。
工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。
2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？1)自然选育阶段2)人工诱变选育阶段3)杂交育种阶段4)代谢控制育种阶段5)基因工程育种阶段3.工业微生物育种的核心指标有哪些？1)在遗传上必须是稳定的。
稳定性。
2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。
3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。
4)种子的生长必须旺盛、迅速。
5)产生所需要的产物时间短。
转化率。
6)比较容易分离提纯。
7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。
8)能保持较长的良好经济性能。
产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。
10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。
4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理；球状体：G-菌，残留部分细胞壁。
是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。
L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株；6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。
酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。
酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。
霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。
藻类的细胞壁：主要成分有纤维素构成结构骨架。
7.基因组、基因、密码子、简并、同义密码子的概念是什么？一、基因组1. 原核生物就是它的整个染色体，原核生物的基因组较小，DNA的含量低，如E.coli的DNA分子质量为2.4×109Da，相当于4.2×106bp，含有3000-4000个基因，SV40病毒仅5个基因。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
关于微生物育种中化学诱变技术的综述
关于微生物育种中化学诱变技术的综述姓名：周旭班级;11生工1 学号：20110801120摘要：化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且近来还用于改造野生菌株代谢功能，以发现新产活性产物。
本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。
关键词：微生物育种；化学诱变剂；诱变机制；应用1前言菌种优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义。
野生菌株往往因产率低而不能直接用于工业生产，而需要通过菌种改良，选育高产优良菌株。
微生物药物的工业化生产对菌株的这种需求带动了各种育种技术的蓬勃发展，而育种技术则通过不断提供优良菌株又促进了微生物药物产业的持续发展。
在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。
微生物人工诱变育种技术按诱导突变类型可分为物理诱变、化学诱变和生物诱变三大类［1］。
化学诱变是一种传统而经典的微生物育种技术，不仅在高产工业菌株选育中得到广泛应用，而且还用于改造野生菌株的代谢功能，从而发现新产活性产物。
在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。
本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。
2常用化学诱变剂2.1碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。
其中，常用嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-氮杂尿嘧啶（6-NU）等；嘌呤类似物有2-氨基嘌呤（2-AP）、6-巯基嘌呤（6-MP）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）等［2］。
2.2烷化剂烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、乙撑亚胺类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类、亚硝基类等。
发酵工程(菌种选育)重点
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的 混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，在固体培 养基平板上获得单菌落。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和 加入的选择性抑制剂。 嗜中性放线菌分离培养基pH常在6.7~7.5， 嗜酸性放线菌pH降至4.5~5.0。 放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线 菌无作用。 分离放线菌分离平板通常在25~30℃培养。 嗜热菌45~55 ℃ ，嗜冷菌4~10 ℃ 。
当代并不表现出来, 在筛选时就会被淘汰; 若突变性状是显
性的, 那么, 在当代就表现出来, 但在进一步传代后, 就会
出现分离现象, 造成生产性状衰退, 因此，应尽可能选择孢
子或单倍体的细胞作为诱变对象。
即使如此, 有时也会出现表型延迟现象, 这是因为诱变
剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后,
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 →80℃、30min处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5、 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 采样（造纸 厂） 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型
工业微生物育种学5
介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
工业微生物育种复习题解析
工业微生物育种复习题解析第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
诸葛健工业微生物育种学复习思考题参考答案
2.在体外(如试管中)利用DNA聚合酶进行DNA合成时需要添加哪些成分。
四种脱氧核苷酸、引物、DNA聚合酶、模板链。
3.大肠杆菌的转录终止子有哪些种类，各有什么特点。
蛋白质翻译的终止密码子有哪几种?大肠杆菌存在两类终止子：(1)不依赖于ρ因子的终止子，或称为简单终止子。
能形成发夹结构外，在终点前还有一系列(6个)尿苷酸；回文对称区通常有一段富含G-C的序列寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板rU-dA组成的RNA-DNA杂交分子具有特别弱的碱基配对结构；当聚合酶暂停时，RNA-DNA杂交分子解开，转录终止。
(2)依赖于ρ因子的终止子。
回文结构不含富有G-C区；回文结构之后也没有寡聚U，必须在ρ因子存在时才发生终止作用，ρ因子结合在新合成的RNA上，借助水解NTP获得的能量沿RNA链移动。
RNA聚合酶遇到终止子时发生暂停，ρ因子追上酶，ρ因子与酶相互作用，造成RNA释放。
ρ因子与RNA聚合酶一起从DNA上脱落，转录终止。
蛋白质翻译的终止密码子有UAA、UAG、UGA4.用基因工程手段将一个大肠杆菌的乳糖操纵子的阻遏蛋白基因敲除后，这大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因是否在任何情况下都表现为高水平的转录。
不是，乳糖操纵子不仅有反式作用元件（乳糖阻遏子）还受顺时作用因子（DNA 序列如启动子等）的调控。
LAC子CAP是一个积极的乳糖阻遏蛋白的调节是一个负调节因子，两个调整机构调整的基础上存在的碳源性质和协调乳糖操纵子的表达水平。
5.基因发生移框突变后，基因编码的蛋白质一般是变得更短还是更长，为什么?移框突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。
因此这个不一定。
如果移码后，出现了新终止子，就变短了。
如果没有了终止子，就变长了。
无论变长或变短，都不一定有活性。
6.请设想一种利用转座子向工业微生物菌种中导人外源基因的方案.转座子(Transposon)，又名转位子、跳跃基因是一类DNA序列，它们能够在基因组中通过转录或逆转录，在内切酶的作用下，在其他基因座上出现。
[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)
![[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)](https://img.taocdn.com/s3/m/17b47030f8c75fbfc67db283.png)
[给学生]《微生物遗传育种学》复习思考题(1)2021级生物技术专业微生物技术方向《微生物遗传育种》复习思考题《微生物遗传育种》复习思考题01 绪论1、工业微生物菌种应具有哪些基本特征？非致病性；适合大规模培养工艺要求；利于规模化产品加工工艺；具有相对稳定的遗传性能和生产性状；形成具有商业价值的产品或具有商业应用价值。
2、简述工业微生物遗传育种的分类。
天然菌种（native strain）：通过自然筛选和分离获得的工业菌种；诱变菌种（mutagenized strain）：通过物理、化学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌株所获得产量或/和性状改善的工业菌种；重组菌种（recombinant strain）是通过遗传重组技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种；遗传修饰生物体（genetic modification organisms, GMOs）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和性状改变的生物体。
3、试从微生物遗传学的不同角度阐述你对微生物多样性的认识。
一、微生物物种的多样性; 二、微生物遗传的多样性;三、微生物代谢的多样性 ;四、微生物的生态多样性;五、微生物利用的广泛性02 第四章工业微生物育种诱变剂1、什么是诱变剂？可分为哪几种类型？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质.可以分为三类：物理诱变剂；化学诱变剂：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异的化学物质；生物诱变剂：采用某些噬菌体来筛选抗噬菌体突变菌株时，常常发现伴随着出现抗生素产量明显提高的抗性突变株。
因此，可以认为这些溶源性噬菌体是一种生物诱变剂。
2、什么是突变？突变的表现型有哪些？基因突变的特点有哪些？突变，从广义上讲，除了转化、转导、接合等遗传物质的传递和重组引起生物变异以外，任何表型上可遗传的突变都属突变范围，如染色体整倍性和非整倍性的变化及染色体结构上的畸变等都包括在内。
04诱变育种
交流】抛砖引玉－－谈谈微生物诱变育种由于微生物自身的自然诱变几率非常低，所以我们在工业微生物育种时，会采用一些人工的诱变剂，物理类的象紫外线，X射线，快中子，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙线等，其中对微生物诱变效果较好的，应用较广的是紫外线，X射线，快中子。
近年来，诱变育种仍备受育种工作者的欢迎，而且还开发了一些新型诱变剂，用于工业微生物育种。
象微波，红外射线，激光，高能电子流，离子注入。
其中离子注入法做为一种新的生物诱变技术已经引起国内外学者的极大关注。
离子注入是20世纪80年代兴起的一种材料表面处理的高新技术，主要用于金属材料表面的改性。
1986年在中国科学院等离子体物理研究所被用于农作物育种，之后又被用于工业微生物的诱变育种，成果显著。
附上文章一篇－－－离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ离子束应用于生物品种改良的研究进展..CAJ (210.15k)这一段时间我正在思考这个问题，在这方面非常愿意和战友们讨论。
请教popstar 战友，有无近10年的关于诱变育种的国外文献。
谢谢国内有关微生物诱变方法的文献非常多。
大体包括：物理诱变剂方面：紫外线，X射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子，微波、红外射线、激光、高能电子流、离子注入等；化学诱变剂方面：碱基类似物、烷化剂、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂、金属盐类等。
生物诱变剂方面（其实这就是基因工程育种，在这里姑且叫作生物诱变剂）：噬菌体和基因诱变剂。
正如你所说国内关于诱变的文章很多，很可惜我现在还没有精力收集国外的文章，国内的文献已经足够我参考了，要是太分心大老板会有想法的，毕竟工厂还是讲效益的地方。
还是那句话“抛砖引玉”。
希望我这张帖子能够吸引更多的同行进来参加讨论，能分享到更多的好见解，微生物版更要越做越好。
现有的关于菌株诱变方法的文章，可以说都是报道了一个操作方法，实验结果中都会说产量提高了多少多少，而无机理的深入探讨。
这样的实验没有一点重复性，也许这种文章每天都可以编一篇，这样的文章有参考价值？！你说的很有道理，不排除有的文章一天可以编一篇，但你也不能完全否认国内文章的质量，毕竟不是每个人的文章都是编的；毕竟有的厂筛到了好的菌种，真的赚钱了。
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第一章工业微生物育种诱变剂1物理诱变剂的总类：物理辐射分为电离辐射和非电离辐射。
包括紫外线、X射线、r射线。
快中子。
微波，超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。
（X 射线、r射线属于电离辐射，紫外线属于非电离辐射）2物理诱变剂对微生物的影响实质：由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程。
3辐射作用的时相阶段：物理阶段——直接作用DNA或作用于水物理化学阶段——激发和电离DNA分子或激发电离水分子化学阶段——产生生物自由基生物学阶段——分子发生变化，变异或死亡4细菌中紫外线对DNA的影响：促使G:C A:T的转换； DNA链断裂，单链或双链；嘧啶或嘌呤被氧化脱去氨基；碱基分子结构中碳与碳之间的链断裂形成开环现象；辐射击中单个核苷酸后，使碱基或磷酸酯游离出来；交联作用5辐射引起的生物学效应的影响因素：微生物的遗传背景；微生物的生理状态；可见光；细胞水分；温度；空气或氧气。
6紫外线的诱变机理及原因？机理：(1)DNA与蛋白质交联(2)胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用(3)DNA链断裂，形成嘧啶二聚体原因：形成嘧啶二聚体7DNA损伤修复中光修复与暗修复的主要机理？光修复：嘧啶二聚体被一种光激活酶结合形成复合物，这种复合物在可见光下由于光激活酶获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。
暗修复：嘧啶二聚体的5’端限制性内切酶和外切酶的作用下，造成单链断裂，接着在外切核酸酶的作用下，切除嘧啶二聚体。
然后再DNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的作用下，并以另一条完整的单链做模板合成正确的碱基对序列，最后由连接酶完成双链结构。
8紫外线有效波长（诱变）范围是：200~300nm9紫外线的剂量以什么计算？绝对剂量：erg/mm2；相对剂量：照射时间、杀菌率表示10紫外线诱变的步骤方法（以及应用，包括如何计数、致死率的计算）步骤：（1）出发菌株的选择将细菌斜面培养至对数期，霉菌或放线菌培养至孢子刚成熟（2）前培养培养基中可添加咖啡碱或异烟肼等抗修复物质。
将菌体培养至最佳状态（对数期）。
（3）制备菌悬液离心去除培养基，用生理盐水制备菌悬液，要求菌体浓度108，107， 106 mL-1等（4）紫外线照射紫外灯预热20min；避免光修复。
（5）后培养将照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。
（6）稀释涂皿后培养结束后，从中取一定量培养物，经不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液做对照皿，培养后，挑取菌落，以待筛选。
11化学诱变剂的概念：一类能够对DNA起作用、引起遗传变异的化学物质。
12以5-BU为例，详述碱基类似物的诱变机理：（见书43页）答：诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。
1）争产掺入错误复制碱基对———— BU掺入————_错配——————突变AT AT,ABU（酮式） AT,GBU（烯醇式） GC2)错误掺入正常复制碱基对————BU掺入————错配——————突变GC GC,GBU（烯醇式） GC,ABU(酮式) AT13烷化剂的诱变机制：答：烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。
烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。
14烷化剂的使用为什么要溶解在缓冲液中？答：溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。
它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。
因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。
配制烷化剂时，要采用合适的出缓冲液。
15常用烷化剂亚硝基胍（NTG）的处理方法：答：○1取新鲜斜面，用一定pH值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。
②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液：NTG丙酮溶液=9:1，一般配置母液浓度为1mg/ml；使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG终浓度为100ug/ ml。
③将以上菌悬液和NTG溶液盛于一试管内，把该菌放在生长适宜的温度下保温处理若干时间，一般细菌20-60min,孢子90-120 min④终止反应：在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。
16以亚硝酸为例详述脱氨剂的作用机制：答：脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。
A→H， C→U, G→X, A：T→G:C和 G:C→A:T亚硝酸的诱变也可以发生回复突变。
要硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，阻碍双链分开，影响DNA复制，从而导致突变。
+H+→HNO2+Na+；2HNO2→N2O3+N2O；N2O3→NO+NO2NaNO217羟化剂的诱变机制：答：当羟胺浓度为0.1～1.0mol／L pH6.0时，主要与胞嘧啶反应，使羟化的C与A配对，在0.1～1.0mol／L pH9.0，羟胺可以与鸟嘧啶反应，10-3mol／L时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。
但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。
此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氢，也具有诱变作用。
（羟胺是专一性诱变剂：GC→AT）18秋水仙素的作用机理：破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。
导致多倍体的产生。
19生物诱变剂有哪三类？ 1）转导诱发突变 2）转化诱发突变 3）转座诱发突变20 吖啶黄的性质和使用方法？答：性质：淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，见光易分解。
使用方法：使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。
通常处理方法是特它们加入培养基中，使最后浓度为10～50ug/ml，混合后制成平板，适温培养，在生长过程中处理。
另外还可将吖啶黄加人到培养液中，浓度为10～20 ug/ml ，在适温条件下，振荡培养过程中处理。
第二章1土壤的酸碱性怎样影响细菌，放线菌，霉菌，酵母菌的分布;pH值的控制偏碱性的土壤：（pH 7.0～7.5）环境:适合细菌、放线菌的生长偏酸性的土壤（pH 4.5～6.0）环境：酵母菌、真菌、霉菌生长旺盛2微生物的营养类型与分布特点：一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。
如森林的枯枝和腐烂的木头有纤维素酶，肉类加工厂和饭店排水沟有蛋白酶和脂肪酶，在面粉厂和糕点厂，及淀粉加工厂有淀粉酶和糖化酶，柑橘，草莓，山芋有果胶酶3 抑制细菌在培养基中使用四环素的抗生素，使霉菌在样品中的比较提高。
抑制霉菌和细菌在悬浮液中加10滴1%的酚或加青霉素（抑制G+菌），链霉素（抑制G-菌）个30~50U/ml，以及丙酸钠10微克/ml （抑制酶类），使的放线菌的比例提高4什么是透明圈法，变色菌圈法，生长圈法，抑菌圈法并分别一个具体的事例说明答：透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。
如可溶性淀粉、碳酸钙等。
变色圈法：直接用显色剂或指示剂。
生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。
抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，便会在菌落周围形成工具菌不能生长的抑制圈。
5 实验室培养过程中除去氧气的方法：加还原剂；焦性没食子酸法；平皿厌气培养法；玻璃板隔绝空气培养法；生物吸氧法。
焦性没食子酸法的步骤：先将焦性没食子酸放在容器中，把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内，然后加入NaOH溶液，立刻盖上盖子，并用石蜡或者凡士林密封，放到室温下培养。
第三章1.选育的工作基础是什么？微生物菌种选育是建立在遗传和变异的基础上的。
2.工业微生物育种的三个阶段：（1）菌种基因型改变（2）筛选菌种，确认并分离出具有目的基因型或表型的变异菌株（3）产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性3.工业诱变育种指在哪些方面进行改进？答：（1）提高有效产物的含量；（2）改善菌种特性，提高产品质量（3）简化工艺条件（4）开发新品种4.诱变后出现不同菌落类型的原因？（1）遗传因素（主要因素，内因）；（2）培养条件的影响（外因）5.诱变前对突发菌株哪些方面应当重点了解？（1）区分不同菌落的类型（2）出现不同菌落类型的原因6.影响菌种生长发育的主要因素？答：培养基；培养基斜面制备技术；移种的密度；温度；湿度；药品和原材料质量7．简述培养基斜面制备技术对菌种生长发育如何影响？（93）答:培养基蒸汽消毒时，压力、时间要适宜，不能超压、超时灭菌，否则不仅破话营养成分，造成养分之间因受热过高而发生反应，使原有成分减少，影响生长和代谢，而且还会产生对菌体生长代谢有毒的物质。
加入的琼脂数量因条件不同灵活变动，当琼脂质量较差或培养基中碳源多、pH值呈酸性是，琼脂量要略为增加。
培养基加入到试管中的量不能过多，琼脂不能过厚，否则仅有利于菌丝生长，而无益于孢子形成。
8．简述接种的密度对菌种的生长发育的影响？答:接种过密，不同菌落间的菌丝交织在一起，容易吻合产生异核体，变异菌株增多，菌种发生退化，生产能力下降。
9.连续诱变育种过程中如何选择突发菌株？答：因挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，以利于突变率的增加10.为什么微生物选育之前的菌株和新变种获得后都要进行纯化?因为微生物容易发生变异和染菌。
一般丝状菌的野生菌株多数为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触，吻合后，易产生异核体，部分结合子，杂合二倍体及自然突变产生菌株等，这些都会造成细胞内遗传物质异质化，使遗传性状不稳定。
11．对供试细胞需要培养的在生理活性和生长期方面有何需要？（98）答：细胞生理活性方面既要同步，又要处在最旺盛的对数期。
12．诱变剂常用的相对计量方法是什么？答：致死率和变异率13.诱变处理方式：单因子处理；复合因子处理具体可分：（1）两个以上因子同时处理；（2）不同诱变剂交替处理（3）同一诱变剂连续重复使用（4）紫外光复活交替处理（5）诱变剂处理时间与诱变效应的关系14．影响突变率的因素：（1）菌种的遗传特性；（2）菌体细胞壁结构；（3）环境条件的影响：a诱变前预培养和诱变后培养b培养条件（温度、pH、氧气等）；c平皿密度15.简述浓度梯度法的筛选：利用培养皿的一侧至另一侧铺有药物浓度呈梯度分布的琼脂培养基，以筛选相应抗药性突变株的方法。
一般先将培养皿一侧搁高约5mm，倒入约10ml融化的琼脂培养基，待凝固后放回水平位置，再倒上等体积含适当浓度药物的相同培养基，放置一天后，即成梯度平板。
培养基内的药物浓度呈线性梯度，一端浓度高，另一端浓度低。
若在梯度平板上涂布经过诱变的菌悬液，经培养后，某些突变的菌株就可以在适当药物浓度的培养基表面生长，然后选择在较高药物浓度下生长的菌株，分离培养即可得到抗药性突变株。