园艺植物生物技术

《园艺植物生物技术》实验教案

实验一现代生物技术实验室与实验仪器

一、实验目的

实验室和实验仪器是开展现代生物技术研究的基础平台，对实验室布局和仪器配置的掌握程度是学生知识结构完整性的重要体现。华中农业大学国家农作物分子技术育种中心和国家柑橘育种中心的生物技术研究在国内一直处于领先地位并有重要国际知名度，其实验室布局和仪器配置能代表目前国内外生物技术实验室的整体情况，通过现场参观和老师讲解加深同学们对现代生物技术实验室的认识。

二、实验场所选择及实验内容

作物遗传改良国家重点实验室与开展现代生物技术研究直接相关的实验室分工与布局和主要仪器：如与组织培养有关的超净工作台、高压灭锅、接种至、培养室等；与分子生物学有关的如高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等。

三、实验方法与步骤

1、相关背景知识回顾：对课堂讲述的各种生物技术如分子标记、细胞和组织培养等操作过程进行回顾，重要指出每个环节要用到的必备仪器的作用、性能指标、操作注意事项及仪器选购中应注意的问题等。

2、每班分为两小组简要介绍现代生物技术实验室的布局，及功能分区情况；针对每个分区的重要仪器进行讲述，结束时对所有参观内容进行简要总结，并回答同学们的提问

四、实验注意事项

实验有很多易损仪器或有毒试剂，参观时要求同学们认真记录，不要随意动手，以保证仪器和人身安全。

五、思考题

1、根据参观内容，描述本次参观有了解到的主要仪器的名称、用途及使用中的注意事项。

2、一个现代化生物技术实验室应具备的基本功能的必备仪器有哪些？

《园艺植物生物技术》实验教案

实验二植物组织培养

一、实验目的

植物组织培养是现代生物技术研究的重要技术手段，在原生质体融合、病毒脱除、离体快繁及遗传转化等领域发挥着不可替代的作用。胡萝卜以其培养体系成熟、再生容易而被视为组织培养的理想外植体材料，本实验通过胡萝卜的组织培养使同学们掌握基本培养基的配制、灭菌及培养的基本技能。

二、实验原理

基于1902年德国科学家哈勃兰特(HabrlMdt)提出植物细胞的全能性理论，即指已分化的细胞仍然具有分化发育成新个体的潜能。在适宜的培养条件下，植物的细胞、组织或器官都具备再生成完整植物的能力。

三、主要仪器及试材

仪器：PH计、微波炉、高压灭菌锅、超净工作台、培养室、三角瓶、封口膜、无菌滤纸、手术刀片、镊子、酒精灯、记号笔等

试材：新鲜胡萝卜，培养基配制所需相关试剂

四、实验方法与步骤

1、培养基的配制（小规模实验应按比例减少，避免造成很大的浪费）：

大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。

KNO395 g

NH4NO382.5 g

KH2PO48.5 g

MgSO4•7H2O 18.5 g

CaCl2•2H2O 22.0 g

注意事项：

1、配置母液前要仔细清洗存储容器

2、应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；

3、溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；

4、夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；

5、沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的（浑浊型沉淀），所以配置时一定

不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。

●微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一

种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：

KI 0.083 g

H3BO30.62 g

ZnSO4*7H2O 0.86 g

NaMoO4*2H2O 0.025 g

CuSO4*5H2O 0.0025 g

CoCl2*6H2O 0.0025 g

MnSO4*4H2O 2.23 g (MnSO4*H2O 1.69 g)

注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1. 前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2. 蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。

●甘氨酸和肌醇的配制(100倍):

甘氨酸: 0.2 g溶解定容到一升; 肌醇: 10 g溶解定容到一升。

●铁盐的配制（100倍）:

称取EDTA 3.73 g，FeSO4·7H2O 2.78 g，分别溶解后混合定容到1L，放入棕色细口瓶中，室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

●维生素B的配制（100倍）：

改良MT：VB1（盐酸硫氨素）1g, MS：10 mg

VB6 (盐酸吡哆素) 1g, 50 mg

VB5 (烟酸) 0.5g, 50 mg

分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1升。

注: 需要溶解完一个再加另一个。VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。

●Vc的配制（100倍）：

称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1升即可。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。

2、配好母液后，按以下体种（或质量）量取，最后用蒸馏水定溶到1升,调节pH 至5.8，用塑料烧杯放入微波炉中充分溶解后分装灭菌。

大量元素(10倍液) 100 ml

微量元素母液的配制(100倍) 10 ml

甘氨酸和肌醇的配制(100倍) 10 ml

铁盐的配制（100倍） 10 ml

维生素B的配制（100倍） 10 ml

Vc的配制（100倍） 10 ml

蔗糖 20 g

琼脂 7.5 g

3、接种与培养，在超净台上接种后，用记号笔做好标签，放置到光照培养室中进行培养。

五、实验注意事项

1、实验中涉及到酒精及砷汞等危险品，注意人身安全的环境安全，废液不要随意乱倒。

2、外植体消毒及接种操作要规范，注意超净台的卫生，养成良好的实验习惯。

六、实验结果处理

一星期后，统计污染率，并对未污染材料的生长状况进行观察，并分析产生污染的可能原因。

七、思考题

影响植物组织培养的因素有哪些？

主要参考文献

1.张娅，曾君祉，周志勇，陈毓荃，黄华樑。胡萝卜组织培养和高效遗传转化体系的

建立。植物学通报, 2005，22:37-42

2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室柑橘课题组。实验手册，2002，武汉（课

题组内部资料）