生物分离工程三版孙彦
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目录
生物亲和作用 亲和色谱原理 亲和色谱介质 亲和吸附平衡 亲和色谱的应用 亲和膜色谱 其它亲和分离技术
生物亲和作用-学习要点
识记：生物亲和作用的概念 理解：生物亲和作用的本质，影响
亲和作用的因素 应用：了解常用的亲和作用体系
亲和作用的由来
Affinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结 婚或亲缘关系
利用清洗液清洗再生色谱柱
亲和色谱介质－学习要点
理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类 应用：了解亲和配基的固定方法，应用实
例以及亲和吸附介质的要求
亲和配基－酶、抗体和蛋白
酶的抑制剂
蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布 很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数 为109 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为
种力的相互作用
亲和作用中的静电作用
中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨 酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷
N末端氨基酸α-氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基 带负电荷
近距离上产生强烈的静电引力
亲和作用中的氢键作用
亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原 子，结合部位之间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用
生物亲和作用
-亲和作用中的相互作用力
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
静电作用
氢键
亲和作用
弱共价键 疏水性相互作用 配 位 键
除具备“钥匙”和“锁孔”的关系外，生物亲和作用还需存在 特殊的相互作用力，这也是亲和作用特异性高的主要原因
生物亲和作用
-影响亲和作用的因素
离子强度 pH 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂
如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH 值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲 和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合 作用减弱直至消失；
其它因素对亲和作用的影响
抑制氢键形成的物质
如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲 和作用。
温度
温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键 和配位键；增强疏水性相互作用
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和 吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似， 多采用断通式前端分析 法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理
料液进料（feedstock loading）
E L EL
Kd
Байду номын сангаас
EL E L
结合常数 Keq
E L Keq EL
结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。 一般亲和体系的结合常数为104～108L/mol，最高可达到1015 L/mol，此时的亲和结合基本上不可逆的。
亲和色谱原理-学习要点
理解：亲和色谱的原理与操作
亲和色谱定义
含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产 物在色谱柱出口穿透
杂质清洗(contaminant washing)
利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；
产物洗脱(target product elution)
利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物
柱再生（column regeneration)
氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直 线上，且原子之间的距离达到一定程度
氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格 制约
亲和作用中的疏水性相互作用
如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳 香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位 上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性 相互作用
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸和脯氨酸
4×104 L/mol）。 抗体
抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107 ~1012 L/mol
蛋白A（或称A蛋白）
A蛋白为分子量42 kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细 胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。
亲和配基－凝集素和色素
凝集素
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上 具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的 配基。
辅酶和磷酸酰苷
离液离子 螯合剂
如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入 乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失
常见的亲和作用体系
特异性 高特异性
群特异性
亲和体系
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
离子强度对亲和作用的影响
亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度 会减弱或完全破坏亲和作用；
提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用，
增大离子强度则可提高亲和结合作用；
pH值对亲和作用的影响
作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 不同解离基团具有不同的解离常数；
生物亲和作用-定义
生物分子能够区分结构 和性质非常接近的其他 分子，选择性地与其中 某一种分子相结合。生 物分子间的这种特异性 相互作用称为亲和作用
生物亲和作用-本质
亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理 尚不清楚
蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构 上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，
形成构象上的钥匙-锁关系 亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多
亲和纯化定义
将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固 体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸 附或结合另一种分子，使另一种分子从混合 物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和纯 化。
在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固 定的分子称为亲和结合对象的配基。
亲和分配平衡
在亲和作用体系中，如果用L表示配基，E表示蛋白 质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为
生物亲和作用 亲和色谱原理 亲和色谱介质 亲和吸附平衡 亲和色谱的应用 亲和膜色谱 其它亲和分离技术
生物亲和作用-学习要点
识记：生物亲和作用的概念 理解：生物亲和作用的本质，影响
亲和作用的因素 应用：了解常用的亲和作用体系
亲和作用的由来
Affinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结 婚或亲缘关系
利用清洗液清洗再生色谱柱
亲和色谱介质－学习要点
理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类 应用：了解亲和配基的固定方法，应用实
例以及亲和吸附介质的要求
亲和配基－酶、抗体和蛋白
酶的抑制剂
蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布 很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数 为109 L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为
种力的相互作用
亲和作用中的静电作用
中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和 半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨 酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷
N末端氨基酸α-氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基 带负电荷
近距离上产生强烈的静电引力
亲和作用中的氢键作用
亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原 子，结合部位之间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用
生物亲和作用
-亲和作用中的相互作用力
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
静电作用
氢键
亲和作用
弱共价键 疏水性相互作用 配 位 键
除具备“钥匙”和“锁孔”的关系外，生物亲和作用还需存在 特殊的相互作用力，这也是亲和作用特异性高的主要原因
生物亲和作用
-影响亲和作用的因素
离子强度 pH 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂
如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH 值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲 和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合 作用减弱直至消失；
其它因素对亲和作用的影响
抑制氢键形成的物质
如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲 和作用。
温度
温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键 和配位键；增强疏水性相互作用
亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物 物质的液相色谱法。
亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和 吸附介质（亲和吸附剂）
亲和色谱原理
亲和色谱操作与一般的固 定床吸附操作方式相似， 多采用断通式前端分析 法，分为进料、杂质清 洗、目标产物洗脱合层 析柱再生四步。
亲和色谱原理
料液进料（feedstock loading）
E L EL
Kd
Байду номын сангаас
EL E L
结合常数 Keq
E L Keq EL
结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。 一般亲和体系的结合常数为104～108L/mol，最高可达到1015 L/mol，此时的亲和结合基本上不可逆的。
亲和色谱原理-学习要点
理解：亲和色谱的原理与操作
亲和色谱定义
含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产 物在色谱柱出口穿透
杂质清洗(contaminant washing)
利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液， 清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；
产物洗脱(target product elution)
利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物
柱再生（column regeneration)
氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直 线上，且原子之间的距离达到一定程度
氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格 制约
亲和作用中的疏水性相互作用
如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳 香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位 上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性 相互作用
苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸和脯氨酸
4×104 L/mol）。 抗体
抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107 ~1012 L/mol
蛋白A（或称A蛋白）
A蛋白为分子量42 kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细 胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。
亲和配基－凝集素和色素
凝集素
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上 具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的 配基。
辅酶和磷酸酰苷
离液离子 螯合剂
如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入 乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失
常见的亲和作用体系
特异性 高特异性
群特异性
亲和体系
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
离子强度对亲和作用的影响
亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度 会减弱或完全破坏亲和作用；
提高离子强度也会降低或消除氢键作用； 当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用，
增大离子强度则可提高亲和结合作用；
pH值对亲和作用的影响
作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团， 不同解离基团具有不同的解离常数；
生物亲和作用-定义
生物分子能够区分结构 和性质非常接近的其他 分子，选择性地与其中 某一种分子相结合。生 物分子间的这种特异性 相互作用称为亲和作用
生物亲和作用-本质
亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理 尚不清楚
蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构 上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，
形成构象上的钥匙-锁关系 亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多
亲和纯化定义
将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固 体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸 附或结合另一种分子，使另一种分子从混合 物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和纯 化。
在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固 定的分子称为亲和结合对象的配基。
亲和分配平衡
在亲和作用体系中，如果用L表示配基，E表示蛋白 质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为