第二章酶法分析
第二章 蛋白质分离纯化技术(2)
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
温度
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
7.8 93.8
101
1）硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类
29
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫 酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂 蛋白，纯度提高了四倍。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白 质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降 解作用。
15
5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
1) 盐浓度（即离子强度）：
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋 白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在 纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增 加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的 活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了 溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
不稳定蛋白颗粒
酶学分析技术范文
酶学分析技术范文酶学分析技术（Enzyme Assay Techniques）是一种用于测定生物样品中酶活性的方法。
酶是生物体内广泛存在的催化剂，可以加速化学反应的速率。
酶学分析技术在生物化学、医学、农业等领域都有重要的应用。
首先，酶学分析技术中最常用的方法之一是光度法。
光度法基于酶催化反应产生物质的颜色变化，并通过测量吸光度来确定酶活性的方法。
典型的酶学分析技术中，一种常用的测量指标是酶促反应后产生的NADH或NADPH的浓度。
通过比较反应前后的吸光度差异，可以计算出酶的催化速率。
其次，酶学分析技术中常用的另一种方法是荧光法。
荧光法基于酶催化反应后产生荧光分子的原理，通过测量荧光信号来确定酶活性的方法。
荧光法具有高灵敏度和高选择性的特点，适用于检测低浓度的酶活性。
常用的荧光剂包括荧光底物和荧光探针，可以通过酶催化反应后的荧光信号强度或颜色变化来确定酶活性。
此外，酶学分析技术中还有其他一些常用的方法，例如比色法、电化学法和质谱法等。
比色法通过测量反应物质的颜色变化来确定酶活性，常用的比色剂有碘化钠、邻联二硝基苯胺等。
电化学法基于酶催化反应过程中产生的电流变化来确定酶活性，常用的电极包括氧化还原电极、工作电极和对比电极等。
质谱法利用质谱仪分析酶催化反应产物的质荷比来确定酶活性，可以用于分析复杂的代谢途径和检测微量物质。
总的来说，酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中有着广泛的应用。
通过研究酶的活性和底物/产物之间的关系，可以了解酶的催化机制和生理功能。
酶学分析技术不仅可以用于检测酶的活性、底物和产物的含量，还可以用于筛选和优化酶的性质，例如通过变异酶突变、构建重组酶等方法。
此外，酶学分析技术还可以用于药物研发、生物工程和环境监测等领域。
总结起来，酶学分析技术是一种用于测定生物样品中酶活性的重要方法。
其原理和实验步骤多种多样，常用的方法包括光度法、荧光法、比色法、电化学法和质谱法等。
酶学分析技术在生物科学研究和应用实验中具有广泛的应用，可以了解酶的催化机制、优化酶的性质，以及在药物研发、生物工程和环境监测等领域中的应用。
生物药物分析与检验(山东联盟)智慧树知到课后章节答案2023年下潍坊医学院
生物药物分析与检验（山东联盟）智慧树知到课后章节答案2023年下潍坊医学院潍坊医学院第一章测试1.生物药物分析是药物分析的一个分支，是运用运用化学、物理化学或生物化学的方法和技术研究生物药物及其制剂质量控制方法的学科。
A:错 B:对答案:对2.药典是国家对药物质量标准及其检验方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。
A:对 B:错答案:对3.2015版《中国药典》分为三部，首次将通则、药用辅料单独作为《中国药典》第三部。
A:错 B:对答案:错4.为了保证药品临床试验资料的科学性、可靠性和重现性，涉及新药临床研究的所有人员都必须执行哪一项规定？A:GSPB:GCPC:GLPD:GMP答案:GCP5.天然生化药物指的是从生物体中获得的天然存在的生化活性物质。
A:错 B:对答案:对6.抗生素属于哪一类药物？A:天然生化药物B:微生物药物C:多糖类药物D:核酸类药物答案:微生物药物7.生物药物检验工作的基本程序一般为取样、鉴别、检查、含量测定，最后完成检验报告。
A:错 B:对答案:对8.分析任何药品，首先是取样，要从大量的样品中取出少量样品进行分析，可以由检验人员随意抽取。
A:对 B:错答案:错9.药品检验过程及结果必须要有完整的原始记录，实验数据也必须真实，不得涂改。
A:对 B:错答案:对10.生物药物对酸、碱、重金属、热等理化因素的变化较为敏感，各种理化因素的变化容易对其生物活性产生影响。
A:对 B:错答案:对第二章测试1.酶分析法包括酶法分析和酶活力测定两种类型。
A:错 B:对答案:对2.在通常的酶活力测定时总要先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线两条曲线。
A:对 B:错答案:对3.在实际酶活测定中一般以测定底物的减少量为准。
A:错 B:对答案:错4.酶活力测定过程中，检验酶反应和测定系统是否正确的标准是测得的反应速度必须和反应时间有线性的比例关系。
A:对 B:错答案:错5.酶活力的测定方法有单酶定量反应法和指示酶反应偶联的定量法两种。
酶学与酶工程重点总结
酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。
2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。
（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。
（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。
（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。
（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。
5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。
如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。
因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。
4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。
生物药分
1.生物药物：指的是生物体生命活动中产生的，或通过生物技术加工的，用作疾病的诊断、预防、治疗的初级和次级代谢产物，包括微生物药物、基因工程药物、动植物细胞组织制备的生化药物。
2.酶循环放大分析法：利用酶循环设计的一种超微分析法。
包括三个步骤：转换反应、循环反应和指示反应。
注意点：1）进行循环反应之前，必须设法出去转换反应中剩余的辅酶2）在循环反应中，底物需够量3）已知量的循环底物平行做循环反应和指示反应以求得循环数n特点：1）灵敏度高，远超比色法、荧光法和放射性同位素法2）特异性强，不许分离纯化，可直接测定。
3）循环率极高3.迁移率(mobility) ：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.4.影响电泳速度的因素：1）颗粒性质:直径、形状、静电荷。
2）电场强度:电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm3）溶液性质:电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度(最适:0.02-0.2)、溶液黏度。
4）电渗:液体对固体支持物的相对移动。
颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率，反之亦然。
5）焦耳热6）筛孔5.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理：以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。
6.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应使样品分离效果好，分辨率高：1）样品的浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生：凝胶孔径不连续性、缓冲液离子成份的不连续性、PH的不连续性2）凝胶的分子筛效应：分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。
3）电荷效应。
7.SDS-PAGE测定蛋白质分子量：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
酶学分析ALT分析Km值
一、酶的分离
1．材料的选取
在酶的分离过程中，首先应该考虑的一个问题是如何选择材料。同 一种酶在不同组织细胞中的含量可能相差千倍或上万倍，因此，如果不 是对某种酶在各组织中的含量进行比较分析或是某些特殊需要，一般选 择含量丰富的材料进行提纯。
2．细胞的破碎
常用的细胞破碎方法有：(1)绞碎、匀浆、高速组织捣碎机捣碎等； (2)对于细胞壁较厚的微生物材料，通常采用加石英砂研磨、超声波破碎、 反复冻融等方法；(3)对于细胞膜上的酶还可以采用有机溶剂处理、去垢 剂处理等。
第四节
酶法分析
酶法分析是指应用酶作为工具的分析方 法，可以对酶的底物、辅酶、激活剂或抑制 剂进行定量分析。常用的方法有动力学分析 法、终点测定法和酶标免疫测定法。其中终 点测定法的应用最为普遍。所谓终点测定法
就是借助某种酶的作用，使被测物质定量地
进行转变。在转化完成后，测定底物、产物 或辅酶等物质的变化量。它可分为单酶反应 定量法和偶联酶反应定量法。
二、酶浓度对反应速度的影响
在酶促反应系统中，当底物浓度大大超过酶的浓度，使酶被底物饱 和时，反应速度与酶的浓度成正比例关系。
三、温度对反应速度的影响
酶是生物催化剂，温度对酶促反应速度具有双重影响。温度升高时， 一方面可加快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。综合这两种因素，酶 促反应速度最快时的环境温度称为酶促反应的最适温度。温血动物中酶的 最适温度多在35～40℃之间。温度高于最适温度时，反应速度则因酶变性 而降低。
第四章
酶学分析
酶(Enzyme)是生物体内具有催化功能的蛋白质，又叫生物催 化剂。生物体内的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，因此 酶学的研究，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质以 及指导有关的医学实践和工农业生产都有重要意义。
酶分析法
张晓静 2009.09
三、测定过程中应注意的问题
1、分析产物比分析底物准确度高。 2、反应初始阶段的速度才能反应酶的真正活力。 3、测得的反应速度必须和酶浓度之间有线性比例关系。
张晓静 2009.09
第二节 酶法分析
根据测定原理，酶法分析可分为终点法和反应速度法两大 类。
张晓静 2009.09
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时,
用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖
氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
5.其他方法
除上述方法外，还有一些测定酶活力的方
法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法
等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差,
2.荧光法
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。
该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
一、酶活力 二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力
1.概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。
酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。
酶分析法
第一节 概述
二、酶促反应条件 选择酶反应条件的基本要求是：所有待测定的酶分子都应 该能够正常发挥它的作用。这就是说，反应系统中除了待测定 的酶浓度是影响速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶 发挥作用的水平。确定反应条件时应该考虑以下因素： 1.底物 2.pH 3.温度 4.辅助因子 5.空白和对照
化学工业出版社
—适用于制药类专业
第一章 绪论 第二章 药物分析基本知识 第三章 生物药物的检查法 第四章 生物检定法 第五章 免疫分析法 第六章 电泳分析法 第七章 色谱法 第八章 酶分析法
化学工业出版社
第九章 氨基酸、肽类、蛋白质类药物的分析 第十章 抗生素类药物的分析 第十一章 维生素类药物的分析 第十二章 核酸类药物的分析 第十三章 甾体激素类药物的分析 第十四章 药物制剂及工艺用水的分析 第十五章 基因工程药物分析 第十六章 体内药物分析常用方法与应用
（8-2） 式中，V为测定时的反应速度，VMAX为最大反应速度，[S]为底物浓度。按 反应速度定义：
（8-3） 式中，t为反应时间，k为正反应的速度常数。
第一节 概述
将上式进行积分得：
（8-4）
（8-5）
式中 为初始底物浓度，在半对数坐标纸上， 与t之间呈直线关系，已知t与 ， 即可求得 ，并可计算速度常数k。 酶促反应接近完全反应所需时间为：
第一节 概述
一、基本概念
酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶催化反应的速 度，可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
酶活力的大小，可用酶活力单位来表示。1961年国际生物化学与分 子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值诸条件均 采用最适条件），1min催化1μmol的底物转化产物的酶量定义为1个酶 活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
第二章 酶类
按照催化反应的类型，国际酶学委员会将酶分为六大类。在这六大类里，又各自分为若干亚类，亚类下又分小组。亚类的划分标准：氧化还原酶是电子供体类型，移换酶是被转移基团的形状，水解酶是被水解的键的类型，裂合酶是被裂解的键的类型，异构酶是异构作用的类型，合成酶是生成的键的类型。
（1）氧化还原酶 催化氧化还原反应，如葡萄糖氧化酶，各种脱氢酶等。是已发现的量最大的一类酶，其氧化、产能、解毒功能，在生产中的应用仅次于水解酶。需要辅因子，可根据反应时辅因子的光电性质变化来测定。按系统命名可分为19亚类，习惯上可分为4个亚类：
2.单体酶、寡聚酶和多酶体系
由一条肽链构成的酶称为单体酶，由多条肽链以非共价键结合而成的酶称为寡聚酶，属于寡聚蛋白。有时在生物体内一些功能相关的酶被组织起来，构成多酶体系，依次催化有关的反应。构成多酶体系是代谢的需要，可以降低底物和产物的扩散限制，提高总反应的速度和效率。
有时一条肽链上有多种酶活性，称为多酶融合体。如糖原分解中的脱支酶在一条肽链上有淀粉-1，6-葡萄糖苷酶和4-α-D-葡聚糖转移酶活性；来自樟树种子的克木毒蛋白（camphorin）由一条肽链组成，有三种活性：① RNA N-糖苷酶活性，可水解大鼠28S rRNA中第4324位腺苷酸的糖苷键，释放一个腺嘌呤；② 依赖于超螺旋DNA构型的核酸内切酶活性，专一解旋并切割超螺旋环状DNA形成缺口环状和线状DNA；③ 超氧化物歧化酶活性。来自红色链孢霉的AROM多酶融合体是二聚体，每条肽链含五种酶活性，可催化莽草酸途径的第二至第六步反应，由于有中间产物的传递通道，使催化效率大为提高。
2一碳基转移酶：转移一碳单位，与核酸、蛋白质甲基化有关。
2磷酸基转移酶：常称为激酶，多以ATP为供体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）。
酶的结构与功能
如下：一 每小时催化1克底物 定 每小时催化1ml某浓度溶液
条
件 每分钟催化1ug底物
一定时间 一定量底物
精选可编辑ppt
50
（1）国际单位（IU）
在标准条件下（25 ℃ ，最适pH和最适底 物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化 为产物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min
——酶活力单位标准化
第二章 酶的结构与功能
主要内容 主要介绍酶的概念、催化特性及其化学本质，讨论酶的 结构特征和催化功能以及酶的作用机理，进而讨论影响 酶作用的主要因素。
重点 酶促反应动力学（影响酶反应的因素）；酶的作用机理
难点
激活剂、抑制剂的影响；别构调节
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1
第一节 酶引论
酶的发现及研究历史
• 人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 • 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 • 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 • 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 • 酶者，酒母也
• 异构酶催化各种同分异构体的相互转化， 即底物分子内基团或原子的重排过程。
• 例如，6-磷酸A 葡萄糖异B 构酶催化的反应
CH2OH P O OH
OH OH
OH
CH2OH P
CH2OH
O OH
OH OH
精选可编辑ppt
37
6、合成酶 Ligase or Synthetase
• 合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、 C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类 反应必须与ATP分解反应相互偶联。
每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。 U/mg酶蛋白、 U/ml酶蛋白
酶产品质量评价中常使用，一定程 度上代表酶的纯度。
第2章酶反应的基本原理
用量少，催化效率高 不改变反应平衡点 可降低反应活化能
（2）酶的特性
高效性：以酶的转换数Kcat表示，mol底 物/mol酶.min 酶的Kcat为103-107 mol底物/mol酶.min， 比非酶催化效率高107-1013 倍。
专一性：结构专一性（相对专一性/绝对专一 性）
立体异构专一性(几何异构/旋光异构)
中间产物存在的证据：
(1) 同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；
(2) 吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。
2、诱导契合假说（induced-fit hypothesis）
S
E-S复合物
S
ab E
c
a E
b
c
酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适 应，进而相互结合。
3、趋近效应与定向作用（ proximity effect & orientation
酶活性中心
结合部位:决定酶的专一性 催化部位:决定酶所催化反应 的性质。
酶活性中心示意图
部分酶活性中心的氨基酸残基
酶
牛胰核糖核酸酶
溶菌酶 牛胰凝乳蛋白酶 牛胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 弹性蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 碳酸酐酶
残基总数
活性中心残基
124
129 245 238 212 240 275 258
His12, His119, Lys41
酶 （简单蛋白质）
酶蛋白
酶等。
双成份酶 （apoenzyme）
（结合蛋白质） 辅因子
辅酶 （coenzyme)
（cofacter) 辅基(prosthetic group)
4、酶的结构层次
一级结构 二级结构
制药工艺学-元英进-课后答案
制药⼯艺学-元英进-课后答案第⼀章论绪第⼆章1-1：分析制药⼯艺在整个制药链中的地位与作⽤。
答：制药⼯艺学的⼯程性和实⽤性较强，加之药品种类繁多，⽣产⼯艺流程多样，过程复杂。
即使进⾏通⽤药物的⽣产，也必须避开已有专利保护，要有⾃主知识产权的⼯艺。
制药⼯艺作为把药物产品化的⼀种技术过程是现代医药⾏业的关键技术领域，在新药的产业化⽅⾯具有不可代替的作⽤；制药⼯艺学是研究药的⽣产过程的共性规律及其应⽤的⼀门学科，包括制配原理，⼯艺路线和质量控制，制药⼯艺是药物产业化的桥梁与瓶颈，对⼯艺的研究是加速产业化的⼀个重要⽅⾯。
1-2．提取制药、化学制药、⽣物技术制药的⼯艺特点是什么，应⽤的⼚品范围是什么？答：提取制药⼯艺的特点：以化⼯分离提取单元操作组合为主，直接从天然原料中⽤分离纯化等技术制配药物；应⽤的产品范围包括：氨基酸、维⽣素、酶、⾎液制品、激素糖类、脂类、⽣物碱。
化学制药⼯艺的特点:⽣产分⼦量较⼩的化学合成药物为主，连续多步化学合成反应，随即分离纯化过程；应⽤产品范围包括；全合成药物氯霉素，半合成药物多烯紫杉醇，头孢菌素C等。
⽣物技术制药⼯艺特点：⽣产⽣物技术制药、包括分⼦量较⼤的蛋⽩质、核酸等药物。
化学难以合成的或⾼成本的⼩分⼦量药物。
⽣物合成反应（反应器，⼀步）⽣成产物，随后⽣物分离纯化过程；应⽤的产品范围包括：重组蛋⽩质、单元隆抗体、多肽蛋⽩质、基因药物、核苷酸、多肽、抗⽣素等。
1-3化学制药产品⼀定申报化学制药吗？⽣物技术制药产品⼀定申报⽣物制药吗？为什么？举例说明。
答：化学制药产品和⽣物制药产品均不⼀定申报化学药物和⽣物制药制品：有些药物的⽣产⼯艺是由化学只要和⽣物技术制药相互链接有机组成的。
如两步法⽣产维⽣素C，⾸先是化学合成⼯艺，之后是发酵⼯艺，最后是化学合成⼯艺；有些药物经过化学合成⼯艺，最后是⽣物发酵⼯艺，如氢化可的松。
1-4从重磅炸弹药物出发，分析未来制药⼯艺的趋势。
答：重磅炸弹药物是指年销售收⼊达到⼀定标注，对医药产业具有特殊贡献的⼀类药物。
第二章 生物酶解技术
5. 激活剂对酶反应速度的影响
➢ 有机小分子： 一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨酸，
使含-SH的酶处于还原态 金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，
可络合一些重金属杂质，解除它们对酶 的抑制，从而使酶活升高。
6. 抑制剂对酶反应速度的影响
抑制作用：有些物质与酶结合后，引起酶的活性 中心或必需基团的化学性质发生改变，从 而使酶活力降低或丧失。
第二章 生物酶解技术
细胞壁的层次
生物酶解技术在中药提取 中的应用
胞间层（中层）(middle lamella):果胶类物质组成， 具强的亲水性和可塑性。
初生壁(primary wall)： 细胞生长过程中，原生质分 泌，有纤维素、半纤维素和 果胶，还含有酶和糖蛋白。
次生壁(secondary wall)： 细胞停止生长，原生质产生 的壁物质沉积在初生壁内侧。 由纤维素、半纤维素和木质 素构成。分内层(S3)、中层 (S2 )和外层S1 )。
多糖的酶及超声联合提取
采用正交试验,优化玉米须多糖的酶及超 声提取方案,并研究这两种方案的结合效果.结 果三种提取工艺中联合提取多糖得率最高,酶辅 助提取次之,超声提取最低.结论联合提取是一 条高效的提取路线.
方法
超声 酶法 酶法-超声
时间（min)
20
170
190
多糖含量 % 2.878 5.697 7.720
总黄酮的UV法测定法
标准曲线的制备:将芦丁于120℃烘箱中烘 于干燥器中冷,却后称至恒重，称取50mg用 70%乙醇溶解,定容至250mL,得0.200mg/mL 芦丁对照品溶液。准确吸取芦丁对照品溶液 0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL于50mL量 瓶中,加入5%NaNO2溶液15mL,摇匀,放置 6min后加入10%Al(NO3)3溶液15mL,摇匀,放 置6min后加入4%NaOH溶液20mL,再用70% 乙醇定容,摇匀,
第二章 酶的结构与功能2012
E+S
k1
ES
k3
P+E
k2
稳态时ES浓度不变
反应速度 V=k3[ES] ES的生成速度=消耗速度 k1[E][S]=k2[ES] + k3[ES] E的质量平衡方程 米氏方程
V=
V[S] Km + [S]
V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et] Km= k2 + k3 k1 米氏常数
[E]=[Et] - [ES]
S
2.1.1.2 动力学参数的意义 （1）米氏常数Km的意义
V Vmax Vmax/2
Vmax 2
Km
[S]
Vmax[S] ＝ Km + [S]
Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
①Km是酶的特性常数：
与pH 、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无 关，可以鉴定酶。
反相层析中的离子配对试剂的作用
反相层析中的离子配对试剂的作用
酶的提纯
双水相萃取法--Two-aqueous phase extraction
1.1%右旋糖苷+0.36%甲基纤维素
右旋糖苷0.39% 甲基纤维素0.65% 右旋糖苷1.58% 甲基纤维素0.15%
人生长激素提取
不均一相 用于分离的体系: PEG/Dextran PEG/Dextran 硫酸盐 PEG/硫酸盐 PEG/磷酸盐
酶的提纯
（1）膜分离技术： 微孔过滤，0.02-10um,分离完整细胞； 超滤技术，1-20nm,分离300KD以上蛋白质； 反渗析技术，1-10nm，分离100-300KD蛋白质。 （2）相分离技术： 膜蛋白分离采用水-有机溶剂混合物加非离子去垢剂； 可溶性蛋白采用聚乙二醇-葡聚糖或聚乙二醇-右旋糖酐等双 水相系统。 （3）层析技术：用酶的底物、底物类似物、抑制剂等与载 体共价连接制成亲和层吸柱；反相层析技术。 （4）萃取技术：双水相萃取技术；反胶束萃取技术。
酶化学
胰脏分泌出来的三种酶在氨基酸序列等方面表现出极大的相似性，反映 出他们起源于共同的祖先，但又表现出不同的专一性。这种来自共同祖 先，通过基因改变而得到不同专一性的结果，称为同源的“趋异进化”。
结构上：三种酶的氨基酸序列分析显示40％左右的氨基酸
序列相同，三者活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列则是完 全一样的，其序列均为：Gly—Asp—Ser—Gly—Gly—Pro
补匹配时，酶才作用于这个底物显示活性，催化S反应。该学说可
以很好的解释E的立体异构专一性。
二者都属于“刚性模板学说. 邻 近 效 应 （ proximity
（orientation effect） effect ）
酶催化的高效性
和定向效应
两种效应使酶具有高效率和专一性特点。
的结合体，此结合体称为多酶复合体(multienzyme complex)。 多酶体系：体内物质代谢的各条途径往往有许多酶共同参 与，依次完成反应过程，这些酶不同于多酶复合体，在结 构上无彼此关联，故称为多酶体系(multienzyme system)。 如参与糖酵解的11个酶均存在于胞液，组成一个多酶体系。
金属离子的作用
稳定构象：
构成酶的活性中心 连接作用：
稳定酶蛋白催化活性所必需的分子构象；
作为酶的活性中心的组成成分，参与构成酶的活性中心；
作为桥梁，将底物分子与酶蛋白螯合起来。
一、酶的分类
（二）根据酶蛋白分子的特点
单体酶
肽链
寡聚酶
多酶复合体(物理结合体) 多酶体系 多功能酶
多酶复合体：体内有些酶彼此聚合在一起，组成一个物理
可解析酶分子的三维结构，了解酶活性部位AA的相对位置
与实际状态和与活性部位有关的其他基团。
酶第二章酶作用基本原理第二节
3、酶制剂保存方法
（1）用饱和硫酸铵或NaCl溶液，4℃保存（如 酶活力下降，此法不行） （2）使用液氮冷冻后保存于低温冰箱。 （3）冻干法，先将酶制剂冻成冰块，然后在高 真空中将冰升华除去，剩下蛋白干粉。 （4）喷学研究可采用的实验方案
动力学实验方案 1、改变底物浓度的动力研究 2、改变底物结构的动力学研究 3、抑制剂动力学研究 4、改变pH条件动力学研究 5、前稳态动力学研究 预期解决的问题 含酶中间产物出现秩序 酶催化位点的特征 酶催化位点的特征 推测催化活性中心的组成 推测含酶中间产物
三个残基互相靠近，Ser伯醇基与His的咪 唑基以及Asp的β-COOH与His的咪唑基拉走， 结果使Ser195上的氧原子成为强烈的亲核基团， 易于供电子，这个系统叫电荷转接系统。
4、水解肽链的机理
• 胰凝乳蛋白酶水解多肽的过程分为两个阶段：
• （1）Ser195的氧原子对底物的羰基原子发起攻击， 形成一个不稳定的四面体过渡态，同时质子Ser195由 转移到His57。结果底物敏感键断裂，其中形成胺通过 氢键与His195的咪唑基连接，底物羰基部分酯化到 Ser195的羰基上。
根据“诱导契合”学说，酶在底物起反应前 后，酶活性中心原子或基团的构象发生变化，使之 与底和物互相契合，使底物分子在活性中心作“定 向”排布，使分子间反应近似分子内反应，同时为 分子轨道交叉提供了条件，使底物进入过渡态的熵 负值减少，反应活化能降低，从而大大提高了ES复合物进入过渡态的机率。
（二）、酶使底物产生形变和“电子张力”
• 活化态释放出一部分能量,调整分子中的一些组成,即 变为产物P,视为终态.
• 在没有催化剂的情况下,由初态到终态,要越过活化态 这个能障,常常需要很高的活化能,所以常需要加温、 加压或进行光照以增加能量，才能发生反应，在有催 化剂的情部下，因催化剂能降低反应的自由能，只要 较小的能量就可以使反应物进入活化态，成为活化分 子，所以和非催化反应相比，活化分子数大大增加， 从而加快了反应速度。
第二章生物反应动力学1酶促反应
A B
k 1
dC A d C B k ( C A C B ) 或 k 1 ( C A C B ) 1 0 0 dt dt
式中：k1－一级反应速率常数 CA0－底物A的初始浓度 CB－t时刻产物B的浓度
1.2.1 酶促反应动力学基础
5 二级反应
k 2 A B D
1dn p dC p rp v dt dt
式中：rs—底物S的消耗速率，mol/(L•S)
rp—产物P的生成速率，mol/(L•S)
v—反应体系的体积，L ns ，np—分别为底物S和产物P的物质的量，mol Cs ，Cp—分别为底物S和产物P的浓度，mol /L t—时间，s
根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：
可忽 略由于生成中间复合物[ES]而消耗的底物。 （3）产物的抑制作用可以忽略。
P E [ ES ]
[ E 0 ] C [ E ] C [ ES ] （1）反应过程中，酶浓度保持恒定，即C
有两种推导反应速率方程的方法： 平衡假设法和拟稳态假设法。
1.2.2.1 平衡假设法—Michaelis-Menten方程 平衡假设：1913年， Michaelis-Menten认 为酶催化反应历程中，生成产物一步的反应 速率要慢于底物S和酶形成中间复合物的可 逆反应速率，因此生成产物一步的反应速率 决定整个酶催化反应的速率，生成复合物的 可逆反应则达到平衡状态。
第二章 生物反应动力学
生物反应动力学：是研究生物反应速率和各种 因素对反应速率影响的的科学。
������ 生物反 应 酶促反应 细胞培养
第二章 生物反应动力学
第一节 酶促反应动力学
第二节 细胞生长过程动力学
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➢ 对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度
➢ 对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH
➢ 设法除去产物
➢ 用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶
➢ 和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物
所谓酶分析法，包括两种：一是以酶作为分析工具 或分析试剂，测定样品中用一般化学方法难于检测的物 质，这些物质可以是酶的底物、酶的抑制剂或酶的辅助 因子。通常将这类分析方法称为“酶法分析”；另一类 是以酶作为分析对象，也就是根据需要对样品进行酶含 量或活力的测定，这类分析称为“酶活力测定”。
酶法分析与酶活力测定的异同
3．反应液中的酶量
对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同 的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力 学推算和分析，可以大致得到如下的结论：
❖ 对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当 于Km（mmol）
❖ 对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下： 第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol） 第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol ）
❖ 能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。 ❖ 反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改
变等可以借助某种简单的方法进行测定。 ❖ 在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶
反应就能进行定量检测。
一般采用的方法有： a.光吸收、荧光之类的分光光度法； b. 测 定 气 体 产 生 与 吸 收 的 测 压 量 气 法 （华勃氏呼吸仪检压法）； c.检知pH变化的滴定法 d.同位素跟踪测定法。
第二章 酶分析法
酶是生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质，由于 表现出特异的催化功能，因此酶被称为生物催化剂。目前 人们多将酶从生物体中抽提出来或利用现代生物技术进行 生产，然后在体外进行酶催化反应。
酶催化反应的应用大体上可分为四个方面：(1)用以 制造某些产品;(2)用以去除某些物质；(3)用以识别某种 化合物；(4)用以测定某种物质。___属于“酶分析法”的 范围。
相同点：二者均使用了酶促反应 不同点： 测定的目的物不同，实验设计不同
❖ 酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须是限速因素，而底
物和辅酶等必须过量； ❖ 酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶或抑制剂或激
动剂等等。因而必须使待测物成为该反应的限速因素。
因此二者是不相同的，不能混为一谈。
酶法分析
是利用酶作为工具对特定物质（底物 、辅酶、抑制剂和激动剂等）进行定量分 析的方法。
丙酮 酸 丙酮 酸 激 酶 磷 酸 烯醇 或丙酮酸
终点法的种类
（一）单酶反应定量法：
S
酶
P
S'
P'
在这种单酶反应中，不需指示反应，可以直接 测定S的减少量或P的增加量和辅酶的变化量。
1、底物减少量的测定
可定量的物质有：胞嘧啶（280nm）、腺嘌呤 （280nm）和尿酸（293nm或297nm）。
尿尿酸 酸的的定定量量
终点法(总变量法 )
终点法是以下述原理为基础的：
先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的 偶联酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在 转变完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底 物）等的变化量，因此称为终点测定法。终点法是 酶法分析中最普遍，最广泛的定量法。
终点法的条件
❖ 必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它 的制品。
酶法分析的特征
适用范围 专一性（选择性） 灵敏度精确度迅速来自度简便程度经济方面
底物、辅酶、激动剂、抑制剂（较窄） 很高，原则上容许类似物同时存在 很高，可达到 10－7 克分子以下，如果和荧 光法组合在一起，也可达 10－9 克分子左右 一般，根据微量吸管误差决定；也取决于 组合的方法 一般，酶反应本身多在 30 分钟以下；通 常不需要进行处理 较差，必须有酶的操作训练（温度、pH 等的确定很重要） 一般，由于酶用量很微，故不会太贵
2.产物增加量的测定
此法可定量的物质有： （1）各种氨基酸和草酸 （2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA
3.辅酶变化量的测定
条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶的底 物的量，此法适用范围很广。
原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大吸收峰 ，而NAD和NADP在340nm却无这一吸收带，故可应 用于NAD或NADP为辅酶的脱氢酶反应，通过测定 340nm吸光度的变化，就可以对作用相应脱氢酶底 物的物质进行定量分析。
尿酸＋2H2O＋O2 尿酸酶 尿囊酶＋CO2＋H2O2
293nm or 297nm
有特征吸收
方法：取试管3支 1
酶对照 尿酸酶溶液
室温放15min A1
2 底物对照
硼酸Buff ＋
待测样品液
3
反应
硼酸Buff ＋
待测样品液 ＋
尿酸酶溶液
A2
A3
通过测 A293 or A297定量 A=A1+ A2-A3
在很多情况下即使有能够特异地作用被测物质的酶存 在，由于底物和产物在物理化学性质上不易区别，因此 仅用单酶反应却无法进行定量，这时候解决的办法大多 数是再借助另一种酶反应来测定产物。这里偶联的第二 种酶由于是要用来起定量指示剂的作用，因而这个酶反 应必须能够以简便的方法测定。有时如果作为指示剂的 酶不能和待测反应直接进行偶联，那么还需要插入第三 种酶组成三种（或更多种酶）的偶联体系。
使用终点法应注意的问题
1．酶的底物专一性： »绝对专一性 »相对专一性 »立体异构专一性
对于酶法分析来说，最理想的酶是具 有绝对专一性的酶。
2．反应的平衡
对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故 对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接 近完全。
❖ 若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进 行检测，不需进行任何处理。
4.反应产物抑制
4.反应产物抑制
若产物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行，在这种情 况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决。 如：激酶反应生成的 ADP 往往能抑制该反应，但此时若在和丙酮酸激 酶（E.C.2.7.1.40）偶联，使 ATP 再生。
（－）
S + ATP S激 酶 P＋ ADP