稀释平板计数

稀释平板计数操作方法

实验器材LB 液体、固体培养基1ml移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。

实验步骤

1.无菌器材的准备

1）无菌培养皿:取培养皿9套，包扎、灭菌。

2）无菌水:取6支试管，分别装入4.5m1 蒸馏水，加棉塞，灭菌。

2.样品稀释液的制备

1）编号取无菌平皿9 套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2)稀释

用1m1移液器吸取0.5m1已充分混匀的悬浮液（待测样品），至10-1的试管中，此即为10倍稀释。

将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。混匀后吸取0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图所示。

3.平板接种培养

平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。

（1）浇注平板培养法

1）取样

用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。

不要用1ml 吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

2）倒平板

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15 ml/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

（2）涂布平板计数法:

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20-30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24-48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开;过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

实验结果

将培养后菌落计数结果填入下表: 10-4、10-5、10-6平均cfu数/平板每ml

计数和报告

1.操作方法:培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克(或每ml)中的菌落数，进行报告。

2.到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0-4℃，但不得超过24h。

3.计数时应选取菌落数在30~300之间的平板，若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字(有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告)。

4.若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。

5.不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比(同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近)，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。

6.当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

7.当计数平板内的菌落数过多(即所有稀释度均大于300时)，但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

8.菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克(g)为单位报告，液体检样以毫升(ml)为单位报告，表面涂擦则以平方厘米(cm)报告。每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数*稀释倍数*5。

芽孢染色方法

【实验器材】

1 菌种 产气荚膜梭菌。

2 染色剂 5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液

3 仪器、材料 二甲苯、香柏油、蒸馏水、95%乙醇、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。

【实验目的】

1 学习并掌握细菌的芽胞染色法，初步了解芽孢杆菌的形态特征。

2 巩固显微操作技术及无菌操作技术。

【基本原理】

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子(endospore)，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽孢及

芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦被着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料，如孔雀绿或石碳酸复红在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进如芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。

【操作步骤】

1 制片。按常规方法涂片、干燥及固定。

2 加热染色。

向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。

3 脱色。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

4 复染。用0.5%番红水溶液复染2min。

5 水洗。用缓流自来水冲洗至流出水无色为止。

6 镜检。将载玻片晾干后油镜镜检。

【实验结果】

梭状芽孢杆菌圆形或卵圆形位于菌体中央、极端或次极端膨大

测生长曲线

一、材料

产气荚膜梭菌、平板、TSC培养基、试管、培养箱、离心管、枪头、

1.挑取一株磁珠，接入TSC上，静止培养20h。

2。标记：取盛有9mL无菌FTG的试管12个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24h。

3。用移液枪吸取0.1菌种适量于实验组试管中，在37℃恒温箱中厌氧培养。按标记的时间定期取出测菌落数。

1.将配置好的含9mLFTG培养基的试管随机分为实验组和对照组，用移液枪吸取菌种适量于实验组试管中（对照组加入等量无菌水），在37℃恒温箱中培养，每