手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

王文娜　邓桂凤　张玲娣　姚彤炜

3

(浙江大学药学院药物分析和药物代谢研究室,杭州310031)

摘　要　采用Chiral pak AD 2H 手性柱(250mm ×416mm,5μm ),建立了正相高效液相色谱(NP 2HP LC )法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。经优化,以正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶0105∶0105,V /V )为流动相,流速

015mL /m in;检测波长261n m 。在此条件下,恩替卡韦与光学异构体分离度>412;光学异构体的检出限为0112mg/L ,在0125～410mg/L 浓度范围内有良好的线性关系;日内与日间精密度RS D <410%;按标准加入

法计算,加样回收率在8710%～10018%之间;RS D <310%;按外标法计算,加样回收率在9812%～11014%之间;RS D <310%。本方法可作为恩替卡韦原料药中光学异构体杂质限量的控制方法。关键词　恩替卡韦,光学异构体,高效液相色谱法,手性拆分

　2008212229收稿;2009204229接受3E 2mail:rethe m@

1　引　言

慢性乙肝病毒感染一直是全球公共卫生的难题,开发抗乙肝病毒药物也一直是个热点。目前,我国临床上应用的抗病毒治疗药物主要有两类:α2干扰素和核苷或核苷酸类似物,主要包括拉米夫定、阿德

福韦和阿昔洛韦[1,2]

。2005年3月美国F DA 批准了新一代抗HBV 核苷类似物恩替卡韦(entecavir,

　图1　恩替卡韦及其光学异构体的化学结构

Fig .1　Structures of entecavir and its op tical is omer

ET V,商品名Baraclude )上市[3]

。恩替卡韦是一种鸟嘌呤核苷类似物(图1),在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物,拮抗HBV 所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dGTP ),抑制HBV 2DNA 聚合酶和逆转录酶,阻断HBV 复制。细胞内作用

半衰期为15h,在人体内不被肝细胞代谢,主要从

肾脏排出体外。同时,其耐药性好,可有效治疗慢

性乙型肝炎,临床应用前景良好[4,5]

。

由于手性药物在合成过程中可能引入光学异构体杂质,故采用手性分离方法检查合成产品中光学异构体含量。恩替卡韦及其光学异构体手性分离方法未见报道。本研究采用直接手性HP LC 法拆分两光学异构体,建立恩替卡韦中光学异构体杂质限量检查方法。

2　实验部分

211　仪器、试剂及材料

LC 210A 型高效液相色谱仪、SP D 210A 型紫外可见光检测器(日本岛津公司);Chiral pak AD 2H 手性

柱(250mm ×416mm ,5μm ,日本D iacel 公司)。乙醇(TE D I A )、正己烷(Burdick &Jacks on )及异丙醇(TE D I A )均为色谱纯;三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司);三乙胺(分析纯,上海化学试剂采购供应五联化工厂);恩替卡韦及其光学异构体(99187%,浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。212　色谱条件

色谱柱:Chiral pakAD 2H 手性柱;流动相:正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶0105∶0105,V /V );流速015mL /m in;检测波长261nm;柱温:室温;灵敏度:01005AUFS;进样量20μL 。

第37卷

2009年8月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Chem istry

第8期

1206～1210

213　溶液制备

21311　恩替卡韦供试液及自身对照液的制备　准确称取适量恩替卡韦于50mL 容量瓶中,加乙醇超声

溶解,定容,作为储备液(500mg/L )。准确移取储备液2mL 于10mL 容量瓶中,加正己烷2异丙醇(50∶50,V /V )混合溶液(以下简称混合稀释液)定容,得恩替卡韦的供试品溶液(100mg/L )。取适量供

试品溶液,用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。21312　光学异构体对照品溶液的制备　准确称取适量异构体于100mL 容量瓶中,加乙醇超声溶解,定容,作为异构体的储备液(50mg/L )。准确移取储备液2mL 于10mL 容量瓶中,加混合稀释液定容,作为异构体的对照品溶液(10mg/L )。21313　恩替卡韦与异构体混合溶液的制备　取2mL 恩替卡韦供试品溶液和4mL 异构体的储备液于10mL 容量瓶中,加混合稀释液定容,即得浓度各为20mg/L 的混合溶液。

3　结果与讨论

311　不同极性调节剂对保留时间、柱效和分离度的影响

由表1可见,当流动相为正己烷和异丙醇时,调节比例,样品和异构体未达基线分离。加入三氟乙酸,保留时间随着三氟乙酸的增加有所减少,仍未达基线分离,但峰型好。加入三乙胺,两者未分开,但能使异构体的保留时间缩短。再改变正己烷和异丙醇比例,两者分离,但是分离度仅为1118,理论塔

表1　流动相的优化

Table 1　Op ti m izati on of mobile phases

流动相

Mobile phase

组成

Compositi on (V /V )分离度

Res oluti on

保留时间

Retenti on ti m e (m in )

t R1

t R2

理论塔板数

Theoretical p late

N 1N 2

正己烷2异丙醇

N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol 60∶40<11336174770∶30<119722787正己烷2异丙醇2三氟乙酸

N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶

trifluor oacetic acid

60∶40∶0105<11227155860∶40∶011<11114113174

正己烷2异丙醇2三氟乙酸2三乙胺N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶trifluor oacetic acid ∶triethyla m ine 60∶40∶011∶0105<1815680∶20∶011∶010511182213627106589639正己烷2异丙醇2乙醇2

三氟乙酸2三乙胺

N 2Hexane ∶is op r opyl alcohol ∶ethanol ∶trifluor oacetic acid ∶triethyla m ine

80∶15∶5∶011∶0105

21182911938194107782675∶15∶10∶011∶0105218123194311821768145270∶18∶12∶011∶0105119416156201201701141270∶15∶15∶011∶0105218018157241042045178370∶12∶18∶011∶0105

3175

21163

29174

2306

2198

板数都小于650。在流动相中加入乙醇后发现流动相中的乙醇含量明显影响保留时间、分离效果和理论塔板数。乙醇含量越高,理论板数越大。同时乙醇和异丙醇的比例也明显影响分离效果,乙醇比例增高,分离度和理论板数提高,保留时间也增加。当流动相为正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸2三乙胺(70∶12∶18∶011∶0105,V /V )时,分离效果理想(图2C )。312　酸碱性对柱效、分离度和保留时间的影响31211　三乙胺的影响　固定流动相中正己烷2异丙醇2乙醇2三氟乙酸(70∶12∶18∶011,V /V )的比例,改变三乙胺用量,考察三乙胺含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知,随着三乙胺含量增加,理论板数和分离度逐渐提高,保留时间稍有缩短。当流动相中三乙胺比例为0105%和011%时,理论板数、分离度和保留时间基本一致。考虑到碱性大对手性柱的损害大,故选择三乙胺用量为0105%。31212　三氟乙酸的影响　固定流动相中正己烷2异丙醇2乙醇2三乙胺(70∶12∶18∶0105,V /V )的比例,改变三氟乙酸用量,考察三氟乙酸含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知,随着三氟乙酸含量的增加,分离度逐渐降低,但均大于315。保留时间逐渐变小,理论板数变化不明显。综合考虑选择三氟乙酸含量为0105%。

7

021第8期王文娜等:手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量