植物遗传转化中选择标记基因的研究进展
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（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ｐＳＲ １质粒的Ｒ—Ｒｓ系统，
哚．３．乙酰胺水解酶等。与常规标记基因不同，这些 标记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生 物是安全的，因此被称为生物安全标记基因１９１。
３．２．１
绿色荧光蛋白基因
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ
ｆｌｕｏ．ｒｅｓｃｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是从维多利亚水母（Ａｅｑｕ．
ｒ．
作选择剂。在筛选过程中ＢＡＤＨ可以把有毒性的甜 菜碱醛（ｂｅｔａｉｎｅ～ｄｅｈｙｄｅ．ＢＡ）转化为没有毒性的甘 氨酸甜菜碱（ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ，ＧＡ）。ＧＡ作为一种渗 透保护剂，还可以提高转基因植株的再生率。
３．２．３
与糖代谢途径相关的基因
离体培养的细
胞不能进行光合作用。必须在培养基中添加一定浓 度的碳源（如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等）后细胞才能 进行正常的生长分化。近年来，利用这一点研究开 发了３种非抗生素标记基因．即６．磷酸甘露糖异构
万方数据
２Biblioteka Baidu０９年第２期
王彩芬：植物遗传转化中选择标记基因的研究进展 的再定位。 ３．１．１共转化（ｃｏ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
７
中的标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移 至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性；除草剂 抗性标记基因通过花粉和种子等途径在种群之间 扩散。可能转移到杂草，产生抗除草剂的“超级杂 草”：或者向其它植物中转移，从而对生态环境和生 物多样性产生潜在的危害：转基因食品的标记基因 及其产物可能对人或动物健康有害。尽管风险评估 报告对一些筛选标记基因提供了安全保证，有的抗 生素抗性基因如ｎｐｔ １Ｉ已通过安全性评价ｆ２Ｊ，但还是 不能彻底消除人们对转基因植物的担忧。 ２．２影响转化细胞再生 当植物细胞被转化后．筛选标记基因同目的基 因共同转入植物细胞。需要从含有抗生素或除草剂 的培养基上鉴别并分离出转化细胞。最终转化细胞 能够存活并生长，而非转化细胞不能生长而死亡。 非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生 长抑制剂。阻碍营养物质向转化细胞的运输，进而 影响转化细胞的增殖及分化【３】。 ２．３影响多重转化 从理论上讲。通过转基因技术可以根据育种学 家的需要将多个外源目的基因导人植物体内，获得 综合性状优良的作物品种。但是在细胞第一次转化 中使用了某一种标记基因，在随后的转化中就要使 用不同的标记基因。这就给多基因转化造成困难。 另外。通过含不同外源基因的转基因植株杂交。可 以获得具有多个优良性状的转基因植株．同时植株 中筛选标记基因的拷贝数也随之增加，多个同源基 因的堆积会大大增加基因沉默的可能性１４１。
ｗｅｌｌ
ｔｈｅ
ｔｈａｔ
ｃｏｕｌｄ ｈｅｌｐ
ｓｏｌｖｅ
ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｐｒｏｂｌｅｍ。ｗｅｒｅ ｓｕｍｍｘａｉｓｅｄ． Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：Ｍａｒｋｅｒ
ｇｅｎｅ
Ｓｅｃｕｒｉｔｙ
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
在植物遗传转化所构建的表达载体中．除含有 目的基因和各种表达调控元件外，一般情况下还插 入了便于筛选用的标记基因。经过遗传转化，表达 载体上所有的插入序列一起整合到受体植物染色 体基因组中。选择标记基因的产物能使转化细胞产 生一种选择压力．致使未转化的细胞在施加选择剂 条件下不能生长、发育和分化。而转化细胞对该选 择剂具有抗性，可以继续存活。因而此方法有利于 从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株，是 一种较为方便、快捷的转基因植物鉴定方法。
收稿日期：２００８—１０－０６
安全性 筛选标记基因的安全性包括对生态环境的安
全性和对人类健康的安全性。例如，抗生素抗性标 记基因的转移可导致其在环境中传播；转基因植物
基金项目：国家支撑计划子课题“北方梗稻育种技术与新品种选育”（２００６ＢＡＤＯｌＡ．６） 作者简介：王彩芬（１９６８．），女，硕士学位，副研究员，从事水稻生物技术育种工作
ｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）
３解决选择标记基因安全性的策略
转基因植物的安全性问题是决定转基因植物 能否商业化利用的主要因素之一，而标记基因的安 全性是近年来国际上关注的热点，许多研究人员正 在致力于这方面的研究。目前．解决转基因植物安 全性的主要策略有３种：利用传统的抗性标记基因 获得转基因植株后再消除标记基因：开发利用无争 议的生物安全标记基因；研究开发无标记基因的转 化系统。 ３．１标记基因的消除 从转基因植物中消除标记基因的方法有４种： 共转化、位点特异性重组、同源重组和转座子介导
酸转移酶，抗潮霉素）、ｃａｔ基因（产生氯霉素乙酰转 移酶，抗氯霉素）、ｓｐｔ基因（产生链霉素磷酸转移 酶，抗链霉素）和ｇｅｎｔ基因（产生庆大霉素乙酰转移 酶，抗庆大霉素）等。常用的抗除草剂基因有ｅｐｓｐ 基因（产生５．烯醇式丙酮酸莽草酸．３．磷酸合酶，抗 草甘膦）、ｇｏｘ基因（产生草甘膦氧化酶，降解草甘 膦）、ｂａｒ基因（产生草丁膦乙酰转移酶，抗草丁膦或 草甘膦）等【ｌｌ。
３．２．２
链霉菌属噬菌体西Ｃ３１的位点特异性重组系统和 Ｍｕ噬菌体的Ｇｉｎ重组系统。 ３．１．３多元自主转化（ｍｕｌｔｉ—ａｕｔｏ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＭＡＴ） 载体系统该系统将由诱导型启动子调控的重组 酶基因与克隆于两段同源序列之间的标记基因连 接到同一载体上．构建成双元载体导入植物中。对 转基因植株进行化学诱导．表达重组酶．促使同源 序列发生重组，从而将标记基因去除。该系统不需 要对初级转化体进行有性杂交，从发生分离的后代 中筛选出不含选择标记基因的植株。 目前ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ系统主要有２类，包括咖ｆ型 和ｒ０Ｚ型。Ｅｂｉｎｕｍａ等（１９９７）用／ｐｔ．ｔｙｐｅ Ｅｎｄｏ等（２００２）也利用／ｐｔ．ｔｙｐｅ
２标记基因存在的问题
利用选择标记基因筛选转化细胞及植株为植 物的遗传转化提供了便利。但是，得到所需要的转 化植株之后，选择标记基因成为多余的，甚至是有 害的。选择标记基因的潜在危险性主要包括以下几 个方面。
２．１
１常用的选择标记基因
目前常用的筛选标记基因主要有２大类：抗生 素抗性酶基因和抗除草剂抗性酶基因。前者可产生 对某种抗生素的抗性．后者可产生对除草剂的抗 性。转化细胞可以在含有抗生素或除草剂的培养基 上正常生长。使用最多的抗生素抗性酶基因有ｎｐｔ Ⅱ基因（产生新霉素磷酸转移酶。抗卡那霉素、 Ｇ４１８、巴龙霉素、新霉素）、ｈｐｔ基因（产生潮霉素磷
共转化是将标
记基因和目的基因分别构建在不同载体或同一载 体的不同Ｔ．ＤＮＡ区域，共同转化受体细胞，通过筛 选和分子鉴定获得共整合植株。在后代分离中选择 只含有目的基因而不含有标记基因的转化植株。农 杆菌介导的转化方法比基因枪转化方法更能有效 地将目的基因与标记基因分离。共转化根据所使用 的方法不同可以分为以下３种。 ２个质粒２个菌株法：２个菌株含２个不同的 双元质粒，其中一个含选择标记基因，另一个含有 目的基因。通过选择标记基因筛选转化植株．再通 过杂交后代分离获得无选择标记基因的转基因植 株。例如，Ｋｏｍａｒｉ等【５】用含有ｎｐｔⅡ和ＧＵＳ的双元质 粒的根癌农杆菌混合浸染烟草和水稻。很大部分的 共转化体携带非连锁基因．自交分离后７ｌ％的烟草 和１００％的水稻只含有ＧＵＳ。这表明不同细菌来源 的Ｔ．ＤＮＡ通常整合于同一位点。但是至少存在非 连锁整合位点。 ２个质粒１个菌株法：该菌株含有２个不同的 双元质粒，分别含有一个选择标记基因及一个目的 基因。Ｄａｌｅｙ等１６Ｊ用含有ｎｐｔ Ｈ和ＧＵＳ不同质粒的根 癌农杆菌浸染油菜和烟草．共转化效率分别为６２％ 和５２％。后代分离植株分别有４０％和５８％只含有 单一基因。这种方式容易分离获得单一目的基因转 化植株，但是由于同一细菌中含有不同质粒，存在 质粒不相容性问题。 ２个Ｔ．ＤＮＡ １个质粒方法：该菌株含有一个双 元质粒，在其不同的Ｔ．ＤＮＡ上分别含有一个选择 标记基因及一个目的基因。Ｋｏｍａｒｉ等【５】将标记基因 ｈｐｔ或ｎｐｔ １１分别和目的基因ＧＵＳ构建在双元质粒 的两个相邻Ｔ．ＤＮＡ区域上。质粒导人根癌农杆菌 后转化烟草和水稻．共转化效率分别达５２％和 ４７％。随机选取共转化烟草和水稻自交，在分离后 代共转化烟草中有５６％只含有目的基因ＧＵＳ，共转 化水稻有６５％只含有ＧＵＳ。表明在半数以上共转化 植株中，双Ｔ—ＤＮＡ整合位点并不连锁。 ３．１．２位点特异性重组体系（ｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｅｏｍｂｉ．
ＭＡＴ ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ
甜菜碱醛脱氢酶基因
利用植物本身就具
有的基因作为选择标记基因。可以减轻大众对转基 因作物的担心。例如Ｄａｎｉｅｌｌ等【１０】用菠菜的甜菜碱 醛脱氢酶（ｂｅｔａｉｎｅ
ａｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＢＡＤＨ）基 因作为烟草叶绿体转化的筛选标记基因．甜菜碱醛
系统获得了无选择标记基因的转基因杂种杨树。 ｖｅｃｔｏｒ系统，仅 通过一次转化即获得了无选择标记的转基因水稻， 并且诱导无选择标记植株的频率高达２５．５％。 ３．１．４同源重组（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）把标 记基因放在２个ＤＮＡ同源序列之间．发生同源重 组后，标记基因即被去除，细胞经过再生，可得到无 标记基因的植株。Ｌａｍｔｈａｎ等【７】和Ｍａｌｉｇａ等【８１采用采 用同源重组的方法获得了只含有目的基因的转基 因烟草。 ３．１．５转座子介导的再定位（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ
酶（６一ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）基因（ｐｍ／）、木糖异
构酶（ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）基因（ｘｆｌＡ）和核糖醇操纵子
（ｒｉｂｉｔｏｌ ｏｐｅｒｏｎ）。分别能使转化细胞利用６．磷酸甘
ｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）是指一段可在染 色体组内移动的特定的ＤＮＡ序列，可将其从一个 位点切除下来．插入到一个新的位点上。同时转座 过程并不伴随再次插入而使该转座子丢失，基于这 一原理。采用转座子系统也可以将选择标记基因去
垡物技衣道摆
・综述与专论・ ＢｌｏＴＥｃＨＮｏＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ ２００９年第２期
植物遗传转化中选择标记基因的研究进展
王彩芬
（宁夏农林科学院农作物研究所，永宁７５０１０５） 摘要：标记基因在为植物遗传转化提供方便的同时也存在一些问题，综述了植物遗传转化中常用的选择标记基 因、标记基因存在的问题以及解决选择标记基因安全性的策略。 关键词：标记基因安全性策略
ｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离纯化出的一种可以发出绿色荧 光的物质。与其它选择标记相比。ＧＦＰ的检测具有 不需要添加任何底物或辅助因子．不使用同位素， 也不需要测定酶的活性等优点。同时，ＧＦＰ生色基 团的形成无种属特异性。在原核和真核细胞中都能 表达．其表达产物对细胞没有毒害作用。不影响细 胞的正常生长和功能。目前，ＧＦＰ已在烟草、水稻等 植物中得到了应用。
ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ
ｇｅｎｅ
７５０１０５）
ｓｔｉｌｌ
Ｍａｒｋｅｒ
ｇｅｎｅ
ｐｒｏｖｉｄｅ
ａ
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ｆｏｒ
ｐｌａｎｔ
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ｇｅｎｅｒｉｃ
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ｔｒａｎｓｆｏｒｍ。ｂｕｔ
ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
ｔｈｅｒｅ
ｅｘｉｓｔ ｔＯ
ｓｏｍｅ ｔｈｅ
ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ
ＣＯｌＴｌｍｏｎ ｍａｒｋｅｒ
ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｌｅｍｓ
除。
露糖、木糖和核糖醇为碳源，而非转化细胞由于不 含有这些基因，不能利用这些碳源，会产生碳饥饿 而不能正常生长，从而达到高效选择的目的。 目前．应用最多的是ｐｍ／基因．已广泛用于水 稻Ｉｌｌｌ、玉米［１２Ｉ、小麦【１３】甜菜【１４１、棉花１１５１和番茄１１６ｌ等植 物的转化系统。 许多植物细胞不能利用木糖。然而在木糖异构
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ
Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｗａｎｇ
Ｃａｉｆｅｎ
ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｙｏｎｇｎｉｎｇ
（‰Ｃｒｏｐ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｉｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｎｉｎｇ痂Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
该系统由重组酶及其识别位点组
成。同源重组是双向的，通过重组酶作用在ＤＮＡ专
万方数据
８
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００９年第２期
一性位点间实现同源交换．可以把外源基因整合到 染色体上，也可以从染色体上把外源基因切除。目 前应用于植物遗传转化的重组酶系统有大肠杆菌 噬菌体Ｐ１的Ｃｒｅ．１０ｘ系统，酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２斗ｍ质粒的ｎＰ．ＦＲＴ系统，接合酵母
哚．３．乙酰胺水解酶等。与常规标记基因不同，这些 标记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生 物是安全的，因此被称为生物安全标记基因１９１。
３．２．１
绿色荧光蛋白基因
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ
ｆｌｕｏ．ｒｅｓｃｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）是从维多利亚水母（Ａｅｑｕ．
ｒ．
作选择剂。在筛选过程中ＢＡＤＨ可以把有毒性的甜 菜碱醛（ｂｅｔａｉｎｅ～ｄｅｈｙｄｅ．ＢＡ）转化为没有毒性的甘 氨酸甜菜碱（ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ，ＧＡ）。ＧＡ作为一种渗 透保护剂，还可以提高转基因植株的再生率。
３．２．３
与糖代谢途径相关的基因
离体培养的细
胞不能进行光合作用。必须在培养基中添加一定浓 度的碳源（如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等）后细胞才能 进行正常的生长分化。近年来，利用这一点研究开 发了３种非抗生素标记基因．即６．磷酸甘露糖异构
万方数据
２Biblioteka Baidu０９年第２期
王彩芬：植物遗传转化中选择标记基因的研究进展 的再定位。 ３．１．１共转化（ｃｏ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
７
中的标记基因是否会通过食物在肠道中水平转移 至微生物，从而影响抗生素治疗的有效性；除草剂 抗性标记基因通过花粉和种子等途径在种群之间 扩散。可能转移到杂草，产生抗除草剂的“超级杂 草”：或者向其它植物中转移，从而对生态环境和生 物多样性产生潜在的危害：转基因食品的标记基因 及其产物可能对人或动物健康有害。尽管风险评估 报告对一些筛选标记基因提供了安全保证，有的抗 生素抗性基因如ｎｐｔ １Ｉ已通过安全性评价ｆ２Ｊ，但还是 不能彻底消除人们对转基因植物的担忧。 ２．２影响转化细胞再生 当植物细胞被转化后．筛选标记基因同目的基 因共同转入植物细胞。需要从含有抗生素或除草剂 的培养基上鉴别并分离出转化细胞。最终转化细胞 能够存活并生长，而非转化细胞不能生长而死亡。 非转化细胞在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生 长抑制剂。阻碍营养物质向转化细胞的运输，进而 影响转化细胞的增殖及分化【３】。 ２．３影响多重转化 从理论上讲。通过转基因技术可以根据育种学 家的需要将多个外源目的基因导人植物体内，获得 综合性状优良的作物品种。但是在细胞第一次转化 中使用了某一种标记基因，在随后的转化中就要使 用不同的标记基因。这就给多基因转化造成困难。 另外。通过含不同外源基因的转基因植株杂交。可 以获得具有多个优良性状的转基因植株．同时植株 中筛选标记基因的拷贝数也随之增加，多个同源基 因的堆积会大大增加基因沉默的可能性１４１。
ｗｅｌｌ
ｔｈｅ
ｔｈａｔ
ｃｏｕｌｄ ｈｅｌｐ
ｓｏｌｖｅ
ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｐｒｏｂｌｅｍ。ｗｅｒｅ ｓｕｍｍｘａｉｓｅｄ． Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：Ｍａｒｋｅｒ
ｇｅｎｅ
Ｓｅｃｕｒｉｔｙ
Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ
在植物遗传转化所构建的表达载体中．除含有 目的基因和各种表达调控元件外，一般情况下还插 入了便于筛选用的标记基因。经过遗传转化，表达 载体上所有的插入序列一起整合到受体植物染色 体基因组中。选择标记基因的产物能使转化细胞产 生一种选择压力．致使未转化的细胞在施加选择剂 条件下不能生长、发育和分化。而转化细胞对该选 择剂具有抗性，可以继续存活。因而此方法有利于 从大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株，是 一种较为方便、快捷的转基因植物鉴定方法。
收稿日期：２００８—１０－０６
安全性 筛选标记基因的安全性包括对生态环境的安
全性和对人类健康的安全性。例如，抗生素抗性标 记基因的转移可导致其在环境中传播；转基因植物
基金项目：国家支撑计划子课题“北方梗稻育种技术与新品种选育”（２００６ＢＡＤＯｌＡ．６） 作者简介：王彩芬（１９６８．），女，硕士学位，副研究员，从事水稻生物技术育种工作
ｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）
３解决选择标记基因安全性的策略
转基因植物的安全性问题是决定转基因植物 能否商业化利用的主要因素之一，而标记基因的安 全性是近年来国际上关注的热点，许多研究人员正 在致力于这方面的研究。目前．解决转基因植物安 全性的主要策略有３种：利用传统的抗性标记基因 获得转基因植株后再消除标记基因：开发利用无争 议的生物安全标记基因；研究开发无标记基因的转 化系统。 ３．１标记基因的消除 从转基因植物中消除标记基因的方法有４种： 共转化、位点特异性重组、同源重组和转座子介导
酸转移酶，抗潮霉素）、ｃａｔ基因（产生氯霉素乙酰转 移酶，抗氯霉素）、ｓｐｔ基因（产生链霉素磷酸转移 酶，抗链霉素）和ｇｅｎｔ基因（产生庆大霉素乙酰转移 酶，抗庆大霉素）等。常用的抗除草剂基因有ｅｐｓｐ 基因（产生５．烯醇式丙酮酸莽草酸．３．磷酸合酶，抗 草甘膦）、ｇｏｘ基因（产生草甘膦氧化酶，降解草甘 膦）、ｂａｒ基因（产生草丁膦乙酰转移酶，抗草丁膦或 草甘膦）等【ｌｌ。
３．２．２
链霉菌属噬菌体西Ｃ３１的位点特异性重组系统和 Ｍｕ噬菌体的Ｇｉｎ重组系统。 ３．１．３多元自主转化（ｍｕｌｔｉ—ａｕｔｏ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＭＡＴ） 载体系统该系统将由诱导型启动子调控的重组 酶基因与克隆于两段同源序列之间的标记基因连 接到同一载体上．构建成双元载体导入植物中。对 转基因植株进行化学诱导．表达重组酶．促使同源 序列发生重组，从而将标记基因去除。该系统不需 要对初级转化体进行有性杂交，从发生分离的后代 中筛选出不含选择标记基因的植株。 目前ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ系统主要有２类，包括咖ｆ型 和ｒ０Ｚ型。Ｅｂｉｎｕｍａ等（１９９７）用／ｐｔ．ｔｙｐｅ Ｅｎｄｏ等（２００２）也利用／ｐｔ．ｔｙｐｅ
２标记基因存在的问题
利用选择标记基因筛选转化细胞及植株为植 物的遗传转化提供了便利。但是，得到所需要的转 化植株之后，选择标记基因成为多余的，甚至是有 害的。选择标记基因的潜在危险性主要包括以下几 个方面。
２．１
１常用的选择标记基因
目前常用的筛选标记基因主要有２大类：抗生 素抗性酶基因和抗除草剂抗性酶基因。前者可产生 对某种抗生素的抗性．后者可产生对除草剂的抗 性。转化细胞可以在含有抗生素或除草剂的培养基 上正常生长。使用最多的抗生素抗性酶基因有ｎｐｔ Ⅱ基因（产生新霉素磷酸转移酶。抗卡那霉素、 Ｇ４１８、巴龙霉素、新霉素）、ｈｐｔ基因（产生潮霉素磷
共转化是将标
记基因和目的基因分别构建在不同载体或同一载 体的不同Ｔ．ＤＮＡ区域，共同转化受体细胞，通过筛 选和分子鉴定获得共整合植株。在后代分离中选择 只含有目的基因而不含有标记基因的转化植株。农 杆菌介导的转化方法比基因枪转化方法更能有效 地将目的基因与标记基因分离。共转化根据所使用 的方法不同可以分为以下３种。 ２个质粒２个菌株法：２个菌株含２个不同的 双元质粒，其中一个含选择标记基因，另一个含有 目的基因。通过选择标记基因筛选转化植株．再通 过杂交后代分离获得无选择标记基因的转基因植 株。例如，Ｋｏｍａｒｉ等【５】用含有ｎｐｔⅡ和ＧＵＳ的双元质 粒的根癌农杆菌混合浸染烟草和水稻。很大部分的 共转化体携带非连锁基因．自交分离后７ｌ％的烟草 和１００％的水稻只含有ＧＵＳ。这表明不同细菌来源 的Ｔ．ＤＮＡ通常整合于同一位点。但是至少存在非 连锁整合位点。 ２个质粒１个菌株法：该菌株含有２个不同的 双元质粒，分别含有一个选择标记基因及一个目的 基因。Ｄａｌｅｙ等１６Ｊ用含有ｎｐｔ Ｈ和ＧＵＳ不同质粒的根 癌农杆菌浸染油菜和烟草．共转化效率分别为６２％ 和５２％。后代分离植株分别有４０％和５８％只含有 单一基因。这种方式容易分离获得单一目的基因转 化植株，但是由于同一细菌中含有不同质粒，存在 质粒不相容性问题。 ２个Ｔ．ＤＮＡ １个质粒方法：该菌株含有一个双 元质粒，在其不同的Ｔ．ＤＮＡ上分别含有一个选择 标记基因及一个目的基因。Ｋｏｍａｒｉ等【５】将标记基因 ｈｐｔ或ｎｐｔ １１分别和目的基因ＧＵＳ构建在双元质粒 的两个相邻Ｔ．ＤＮＡ区域上。质粒导人根癌农杆菌 后转化烟草和水稻．共转化效率分别达５２％和 ４７％。随机选取共转化烟草和水稻自交，在分离后 代共转化烟草中有５６％只含有目的基因ＧＵＳ，共转 化水稻有６５％只含有ＧＵＳ。表明在半数以上共转化 植株中，双Ｔ—ＤＮＡ整合位点并不连锁。 ３．１．２位点特异性重组体系（ｓｉｔｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｅｏｍｂｉ．
ＭＡＴ ＭＡＴ ｖｅｃｔｏｒ
甜菜碱醛脱氢酶基因
利用植物本身就具
有的基因作为选择标记基因。可以减轻大众对转基 因作物的担心。例如Ｄａｎｉｅｌｌ等【１０】用菠菜的甜菜碱 醛脱氢酶（ｂｅｔａｉｎｅ
ａｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＢＡＤＨ）基 因作为烟草叶绿体转化的筛选标记基因．甜菜碱醛
系统获得了无选择标记基因的转基因杂种杨树。 ｖｅｃｔｏｒ系统，仅 通过一次转化即获得了无选择标记的转基因水稻， 并且诱导无选择标记植株的频率高达２５．５％。 ３．１．４同源重组（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）把标 记基因放在２个ＤＮＡ同源序列之间．发生同源重 组后，标记基因即被去除，细胞经过再生，可得到无 标记基因的植株。Ｌａｍｔｈａｎ等【７】和Ｍａｌｉｇａ等【８１采用采 用同源重组的方法获得了只含有目的基因的转基 因烟草。 ３．１．５转座子介导的再定位（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ
酶（６一ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）基因（ｐｍ／）、木糖异
构酶（ｘｙｌｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）基因（ｘｆｌＡ）和核糖醇操纵子
（ｒｉｂｉｔｏｌ ｏｐｅｒｏｎ）。分别能使转化细胞利用６．磷酸甘
ｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）转座子（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）是指一段可在染 色体组内移动的特定的ＤＮＡ序列，可将其从一个 位点切除下来．插入到一个新的位点上。同时转座 过程并不伴随再次插入而使该转座子丢失，基于这 一原理。采用转座子系统也可以将选择标记基因去
垡物技衣道摆
・综述与专论・ ＢｌｏＴＥｃＨＮｏＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ ２００９年第２期
植物遗传转化中选择标记基因的研究进展
王彩芬
（宁夏农林科学院农作物研究所，永宁７５０１０５） 摘要：标记基因在为植物遗传转化提供方便的同时也存在一些问题，综述了植物遗传转化中常用的选择标记基 因、标记基因存在的问题以及解决选择标记基因安全性的策略。 关键词：标记基因安全性策略
ｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离纯化出的一种可以发出绿色荧 光的物质。与其它选择标记相比。ＧＦＰ的检测具有 不需要添加任何底物或辅助因子．不使用同位素， 也不需要测定酶的活性等优点。同时，ＧＦＰ生色基 团的形成无种属特异性。在原核和真核细胞中都能 表达．其表达产物对细胞没有毒害作用。不影响细 胞的正常生长和功能。目前，ＧＦＰ已在烟草、水稻等 植物中得到了应用。
ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ
ｇｅｎｅ
７５０１０５）
ｓｔｉｌｌ
Ｍａｒｋｅｒ
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ｔｈｅｒｅ
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ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ
ＣＯｌＴｌｍｏｎ ｍａｒｋｅｒ
ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｌｅｍｓ
除。
露糖、木糖和核糖醇为碳源，而非转化细胞由于不 含有这些基因，不能利用这些碳源，会产生碳饥饿 而不能正常生长，从而达到高效选择的目的。 目前．应用最多的是ｐｍ／基因．已广泛用于水 稻Ｉｌｌｌ、玉米［１２Ｉ、小麦【１３】甜菜【１４１、棉花１１５１和番茄１１６ｌ等植 物的转化系统。 许多植物细胞不能利用木糖。然而在木糖异构
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ
Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｗａｎｇ
Ｃａｉｆｅｎ
ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｙｏｎｇｎｉｎｇ
（‰Ｃｒｏｐ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｉｎ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｎｉｎｇ痂Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
该系统由重组酶及其识别位点组
成。同源重组是双向的，通过重组酶作用在ＤＮＡ专
万方数据
８
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
２００９年第２期
一性位点间实现同源交换．可以把外源基因整合到 染色体上，也可以从染色体上把外源基因切除。目 前应用于植物遗传转化的重组酶系统有大肠杆菌 噬菌体Ｐ１的Ｃｒｅ．１０ｘ系统，酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２斗ｍ质粒的ｎＰ．ＦＲＴ系统，接合酵母