受体的结构与功能

受体与配基结合反应的基本原理
----简单单位点系统的基本规律
简单单位点系统 对某种受体系统而言，它 的全部受体都以相同的亲和性以单分子与 特定的配基相结合(分子比为1：1)，而且不 表现明显的正负协同作用。
如果一个受体系统存在两（多）种亚型， 但所用配基无选择性，尽管亚型的生物效 应可能不全相同；结合反应却表现出完全 相同的特征，这时，也可作为单位点系统 来看待。
d[d结RtL合] 反V1应 V：2 K1[R][L] K2[RL]
解d离[ R反L应]： dt
K 2 [RL]
竞争性取代反应(competitive displacement reaction)
在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个 化合物，它若能和受体的配基结合位点结合，则 会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放 射配基与受体形成复合物的能力降低(亲和力降 低)，但受体数量不变所以叫竞争性取代反应，此 时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂 (competitive agent)，它可以是激动剂 (agonist)，也可以是拮抗剂(antagonist)，它们 和受体结合后不改变受体分子的结构。
①以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制 剂(饱和结合实验)进行反应，测定结合百分率；
②以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图， 获得一条直线；
③延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记 配基结合活性％。
3．比活度
受体结合分析最后的结 果计算时离不开准确的 比活度数据。必要时也 可用放射受体自身置换 法测定比活度。
(三)膜制剂(membranous preparation)
绝大多数受体结合分析使用膜制剂。
1、使用膜制剂可以减少非特异性结合率。
2、在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内 源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。
3、膜制剂通常也保存有受体—效应器(包括GTP结 合蛋白等)结合系统。但受体功能的其他方面则失 去了，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也 失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构 本身，所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。
简单单位点系统质量作用定律
受体和配基的结合反应服从质量作用定律， 对简单单位点系统 ：
K1，V1
[R] + [L]
[RL]
K2，V2
KD
K 2 K1
[ R][ L] [RL]
[RT
RL][LT [RL]
RL]
饱和曲线
[RL]2 [RL][RT LT KD] [RT ][LT ] 0
受体标本的制备
在受体结合实验的研究中，所用的受体材料 可以是组织切片，也可以是完整的单层培养 细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜 受体，可溶性的受体蛋白等。
(一)组织切片 冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温
育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用 缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5～ 50μm。用组织切片的目的更多是研究受体 的分布(用放射自显影法或免疫组化法)。
求上述两个参数的实验也有两类：一类是：固定 [RT]和[LT]，向系统中加不同量的竞争剂，Fra Baidu bibliotek得竞 争取代曲线。另一类是固定[RT]和[IT](竞争剂浓度)， 不断改变[L]，分析[IT]存在时的影响。
受体放射分析的基本方法
放射性配基的要求
制备优良的放射性配基是受体结合试验的 首要条件。对任何一种受体系统，通常都 有好几种标记配基可供选择。选择应从两 方面考虑：
另有一类通常称为阻断剂(blocking agent)的物 质，它们也能与受体结合，但结合后会引起受体 分子不可恢复的结构改变，导致受体功能丧失。 当受体与放射配基的结合系统中加入此类物质， 就有部分受体被破坏，使受体数量减少，未被破 坏的受体则仍单独与放射配基和受体结合。这类 反应叫非竞争性阻断(irreversible blocking)。
多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可 以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条 件(单碘标记物)，仍能保持较好的生物活性。 另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实 验室可进行。测量操作简单，所以125I配基也 大量采用。
需要注意的是自行标记125I—配基要解决两 个难题：
①要确定标记物的比活度，如果比活度不确切， 最后所得的受体结合位点数不确切。②标记配基 的纯化：多肽的碘标化合物往往产生一碘 (monoiodinated)和二碘(diiodinated)标记物。这些标记 物对受体的亲和力有可能是不同的。
放射性配基的质量鉴定
1．放射化学纯度
放射性配基的放射化学纯度对受体结合率
及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜产品 外存放一定时间后的标记配基均应重测其 放化纯度，以保证分析的准确性。一般要 求放化纯度应在95％以上。
2，结合活性鉴定
受体结合分析中，放射性配基的活性特别重要， 特别是生物活性。目前，测定配基的活性主要 是指与受体的结合能力。即测定其最大结合活 性：
在Scatchard作图时 前者曲线斜乎变小， 后者曲线斜率变大。
协同作用的判断
----Hill作图法(Hill plot)
可进一步判别协同作用的性质。 其原理如下：倘若一个受体可 以和n个配基结合，并且KD值相 同，那么按质量作用定律：
KD＝[RT—RL]·[L]n／[RL]， 或[RL]／[RT－RL]＝[L]n／KD， 两边取对数：
3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。
使用完整细胞的缺点：
1、较难控制分析条件，操作可能导致细胞表面生理活性的改变， 结果有时不够稳定。
2、细胞上某种受体的含量低时，需加人大量细胞才能获得足够的 放射性计数，给实际工作带来一定困难。
3、完整细胞的膜受体在37℃时会产生受体入内化现象 (internalization)，导致测定结果不准确，常需要在较低温度下 温育。
[RL]和[LT]并非线性关系， 而是曲线关系，这就是饱 和曲线。
曲线的高度主要反映受体的 数量多少，曲线上升的快慢 则主要反映受体和配基的亲 和力(亲和力越高，上升越快)。
非特异结合(non-specific binding，NSB)
NSB主要来自杂蛋白，反应器 壁，分离材料的吸附，它的 特点是，容量很大，而亲和 力低，因此在一般情况下不 被饱和 。
如果n<1，则往往是由于负协同作用或者存在两种 亲和力不同的受体亚型，
如果n>1但又明显小于2，则往往是由于正协同作用。
受体与配基反应的动力学(kinetics)
受体与配基的结合反应一般 都较快(多数在数十秒至数十 分钟)达到平衡。当周围的游 离配基急剧下降，或非标记 配基浓度急剧升高时，放射 性复合物的解离也很快，这 种快速结合和快速解离对保 证受体的迅速反应有很重要 的意义。
受体与配基结合的基本特征
可饱和性 (saturability)
每种受体在一个细胞上的量有一定限度，所以如果不断增加细胞周围配 基的浓度，结合到细胞上的配基将渐趋饱和。
特异性 (specificity)和高亲和力(high Affinity)
一种受体只和一定结构的配基发生特异性结合反应，这种结合的特点是： 亲和力高而结合容量少。配基和受体结合的特异性还具有立体特异性。
可逆性(reversibility)
受体与配基结合反应的可逆性是保证细胞随时适应内外环境变化的重要 特征。
识别能力(recognition)和效应的一致性
受体对配基的特异结合保证了受体对机体内成千上万种生物活性物质的 高度识别能力。这种识别能力必定和配基引起的生理(药理)效应相匹配。 主要表现在两个方面。一是组织分布上的匹配：亦即受体在不同组织和 细胞中的分布和相应配基在引起生理或药理效应方面的组织和细胞特异 性有高度一致性；二是浓度上的匹配，亦即配基引起生理或药理效应的 有效浓度和配基与受体结合的有效浓度有高度一致性
以上两类反应有时统称为抑制结合反应。它们 的区别可从Scatchard作图上明显看出
表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个： IC50值和KI。
IC50值是指抑制50％受体与放射配基结合所 需竞争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑 制作用小。
KI则是指竞争剂的平衡解离常数，KI越小，表 明竞争剂抑制作用越大。
在具体设计某种受体的放射性结合分析时，一般 是选标记拮抗剂作为放射性配基，例如皮质激素 受体的分析常选用氚标记地塞米松，它是皮质激 素的拮抗剂。然而生理激动剂却能更准确反映受 体的生物学意义。
用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I 标记。
氚标记配基与原型配基为同型式，生物学活 性好，多数情况下比活度也能达到要求，且 半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪 测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标 记。
•①配基的特性； •②实验目的
对放射性配基的基本要求
比活度高 亲和力高 特异性强 稳定性好 标记的稳定性、贮藏时的
稳定性以及温育分析时之稳定性
实验目的
主要针对具体研究目标来选择。例如有的受体有 几种亚型，如果实验的意图是放射性配基要结合 所有这几个亚型，即可选择无亚型选择的配基。 相反，想研究其中某一个亚型，则应选择针对该 亚型的高亲和力配基。
(二)游离的完整细胞悬液
完整细胞来源分三种：①从组织分离出游离细胞；②血细胞； ③培养细胞。
使用完整细胞的优点：
1、受体处于原有的正常环境中。受体与其相连的效应系统(如C蛋 白)也保存完好。
2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与 受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的 生理特点。
做NSB时，所需的非标记配基， 其浓度最好通过实验来选定。 如果浓度不够，NSB的抑制不 完全，而如果浓度过高，也 会使空余的非特异结合位点 被占领，使NSB出现被抑制过 多的假象
配基受体结合常数Kd的计算
----Scatchard作图(Scatchard plot)
KD＝[RT—RL][L]／[RL] 重排， 得到Scatchard函数 。当RT和 KD固定时， [RL]／[L]和[RL]是 线性关系 ，直线斜率的倒数就 是KD。这是简单单位点系统的 一个重要特征。
受体的放射配基结合分析
什么是受体
受体(receptor)都是有特定氨基酸序列和特定 构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有 特定的宏观和微观分布。它接受细胞外的 特定信号(神经递质、激素、某些药物和毒 物等)，通过受体后特定的信号传递系统， 引起细胞的特定反应，因此是高等动物适 应环境、协调整体各种细胞功能的关键性 分子。
Scatchard作图在下列情况下不呈 直线：①双位点或多位点系统，亦 即受体有两种以上亲和力；②受体 有正协同(positive Cooperativi-ty) 或负协同(negative Cooperativity) 现象；③非特异结合的测定所用非 标记配基浓度不对
正负协同作用
是指当一部分受体与 配基结合后使相邻的 受体的亲和力发生改 变，，倘若亲和力逐 步下降，称之为负协 同作用，亲和力逐步 增大，称之为正协同 作用。
Log [RL] nLog[L] LogKD [RT RL]
以Lg（[RL]/[RT—RL]）为纵坐标，Lg[L]为 横坐标作图，为一直线，这就是Hill作图。 直线的斜率为n，称Hill系数；
简单单位点系统不应有正负协同作用，n=1。
对每一受体结合两个或三个配基的系统，n=2或 n=3．
125I—配基比活度的校正
当产物的放射性丰度为80％，比活度为: 0.80 ／ (0.80+0.2)× 8.048×1014Bq ／ mmol =
6.438×1014Bq(1740Ci)／mmol。 60天后，其放射性标记配基变为原来的一半，而非放射性配基
则或者不变，或者增加(由放射性部分转化而来)。放射性丰度 变为： 0.8e—0.693(60／60)=0.40， 如果属于前一种情况，比活度变为： 0.40／(0.40+0.20)×8.048×1014Bq／mmol = 5.365×1014Bq(1462Ci)／mmol。 如果属于后一种情况，则比活度变为： 0.40／(0.40+0.20+0.40)× 8.048× 1014Bq／mmol= 3.219× 1014Bq(870Ci)／mmol。