植酸酶活力的测定方法及应注意问题(精)

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植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 [1]。植酸酶是一种胞外酶 [2], 广泛存在于自然界中, 植物、动物、微生物均可产生植酸酶。植酸酶的活性因来源不同而有差异。

植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸分解成为肌醇和磷酸。植酸酶可以专一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的

磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸、终产物为肌醇和磷酸 [3]

。植酸酶的作用机理见图 1。

图 1植酸酶的作用机理

1. 植酸酶酶活力测定的意义酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力, 用在一定条件下, 酶所催化某一反应的速率表示。酶活性是研究酶的特性, 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。

酶活力单位是以酶活力为根据而定义的。国际生化协会酶委员会规定, 1min 内将1μmol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为标准单位, 同时规定了酶作用的条件。因标准单位在实际应用时不够方便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位。在测定酶活力时, 对反应温度、 pH 、底物浓度、作用时间都有统一规定, 以便同类产品互相比较。但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只不过是一种相对比较的依据 [4]。

植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位。确定植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率。

2. 植酸酶活力测定的原理及方法

酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定无机磷的释放量。

植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。方法包括:钒 -钼酸铵法、硫酸亚铁 -钼蓝法、 Vc-钼蓝法、丙酮 -磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等 [5]。可根据实验需要选择不同的方法。

2.1钒 -钼酸铵法

该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。通过加入酸性钼-钒试剂使水解反应停止 , 同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应 , 形成黄色的钒钼磷络合物 , 在 415nm 波长下测定磷的含量。以标准植酸酶为参照物 , 间接计算被测样品中植酸酶的含量。本法于 1994年列入 AOAC, 我国也已将此法的测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证和验收进口产品的法定商检依据。

2.2硫酸亚铁 -钼蓝法

该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入三盐酸使水解反应停止 , 然后加入钼酸铵及 FeSO 4·7H 20的混合液使溶液显色 , 在 720nm 波长下测定其吸收值 , 以标准酶为参照物 , 间接计算被测样品中植酸酶的含量。

2.3Vc-钼蓝法

该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入三氯乙酸使反应停止 , 然后加入钼酸铵与 Vc 的混合液 , 使溶液显色 , 在 820nm 波长下测定吸光度 , 再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程 , 最后以待测样品吸光度代入方程 , 计算出酶活性。

2.4丙酮 -磷钼酸铵法

磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后 , 可慢慢生成黄色磷钼酸铵 , 加入丙酮后将黄色物质提出来 , 在 355nm 波长处测吸光度 , 灵敏度增加 10倍。

2.5方法比较

不同的测定方法, 各有优缺点。钒 -钼酸铵法灵敏度最高, 丙酮法

稳定性最好, 抗干扰能力较强, 在测定饲料、发酵产物中植酸酶酶活, 采用丙酮法较好。

AOAC 法测定出现酶活力结果偏小 , 原因可能是由于显色反应需要在沸水浴中进行,溶液中已经存在的 TCA 可在高温下水解底物植酸

钠, 因此造成误差。所以,

用 TCA 做酶的灭活剂时, 不能采用 AOAC 无机磷分析方法进行植酸酶的测定。

钼蓝 -Vc 显色法是在室温下进行的, 可减少 TCA 对植酸的水解作用, 分析结果相对准确。空白样测定时, 当

采用 TCA 为灭活剂时,

可能产生假酶活问题。如果改进程序, 先不加入底物植酸钠, 而是将酶液与缓冲液保温, 反应完成后用 TCA 将酶灭活, 然后加入底物,这样操作避免了 TCA 在热环境下对植酸钠的水解作用, 能够较准确地测定植酸酶水解底物后释放的无机磷的量, 酶活力分析结果更为准确。

3. 植酸酶活力测定中应注意的问题 3.1温度

植酸酶作为一种酶制剂, 对温度非常敏感, 温度低会降低它的生物活性; 温度高也会降低其生物活性, 甚至完全失活。因此, 在检测过程中对温度的控制则显得非常重要,国标要求植酸酶活性测定时的温度为 (37±0.1 ℃。在 33℃时植酸酶不能很

好地发挥其活性, 酶活与其真实值相比约低 10%; 在 40℃时, 部分植酸酶会失活, 酶活与其真实值相比

约低 8%。另外,

水浴加热时, 水浴液面要超过试管内反应液液面, 使其在规定时间内充分反应。

3.2pH 值

pH 值在酶活测定时影响很大, 国标要求 pH 值为 5.5。当 pH 值为 3.0时,植酸酶活力基本消失。尽量不要用酸度计来调节缓冲液的 pH 值, 因为酸度计存在一定的误差, 使用时间长了会发生钝化, 使测定的

pH 值不准。可以通过计算缓冲溶液中 H +

浓度的方法来配制一定 pH 值的溶液。

3.3底物植酸钠的型号植酸钠有两种型号, 一种是 Sigma p-3168, 分子量为923.8; 另一种是 Sigma p-8810, 分子量为 660.03。根据国标要求,植酸钠应为 Sigma p-3168, 在实验中发现 Sigma p-3168植酸钠底色浅, 且作磷标准曲线时梯度较好检测植酸酶活性时用 Sigma p-3168为反应底物较好。

3.4离心速度和时间

当水浴 30min 终止酶解反应后, 需要进行离心。国标要求 4000r/min,

离心 10min 。若以 3000r/min离心 10min ,

则离心不彻底, 测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度; 以 5000r/min离心10min 时, 发现标准曲

线各梯度的吸光度与以 4000r/min离心 10min 时相比偏低。