同源重组的基因敲除(20200303180946)
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理引言随着基因工程技术的快速发展，人类对基因编辑和修饰的需求日益增加。
同源重组基因敲除是一种有效的基因编辑技术，可以精确地删除目标基因，进而研究其功能和影响。
本文将从基本原理、步骤以及应用场景等方面详细介绍同源重组基因敲除的原理。
基本原理同源重组基因敲除是一种人工改变生物体基因组的方法。
其基本原理是利用同源重组原理在特定基因位点引入外源DNA序列来替换目标基因或其部分序列。
这个外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因，用于筛选和鉴定敲除细胞。
在同源重组基因敲除中，通常选择目标基因的第一个外显子或关键区域进行敲除，以达到有效丧失目标基因功能的目的。
通过设计特异性的核酸引物，将外源DNA序列与目标基因特定区域相结合，通过同源重组来替代目标基因。
步骤同源重组基因敲除包括以下几个关键步骤：1.设计外源DNA序列：根据目标基因序列，设计与目标基因特定区域同源的外源DNA序列。
外源DNA序列通常包含选择标记基因和辅助基因。
2.制备敲除载体：将设计好的外源DNA序列插入到敲除载体中。
敲除载体通常是由质粒构建而成，具有选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以方便后续筛选。
3.细胞转染：将敲除载体导入目标细胞内。
转染方法有多种，包括化学法、电穿孔法和病毒介导转染法等。
转染后，对细胞进行培养和筛选。
4.筛选敲除细胞：根据选择性标记基因的特性，可使用对应的抗生素或其他筛选条件来选择敲除细胞。
只有敲除了目标基因的细胞才能存活下来，形成筛选突变株。
5.鉴定敲除细胞：通过PCR、Southern blot等分子生物学方法对转染细胞进行鉴定。
PCR扩增特定区域并进行测序分析，可确认目标基因是否被成功敲除。
应用场景同源重组基因敲除技术在基因编辑领域具有广泛的应用前景。
以下是该技术在一些应用场景中的具体应用：1.基因功能研究：同源重组基因敲除可以用于研究基因的功能和调控机制。
通过敲除特定基因，观察编辑细胞或生物体的表现差异，从而揭示该基因对生物体的重要性和功能。
[整理]基因敲除2教学讲义PPT课件
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➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统
一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统王小利;姜闯;刘建华;刘喜朋【摘要】With the development of functional genomics, gene-knockout is becoming an important tool to elucidate gene functions in vivo. As a good model strain for archaeal genetics, Haloferax volcanii has received more attention. Although several genetic manipulation systems have been developed for some halophilic archaea, it is time-consuming because of the low percentage of positive clones during the second-recombination tion. These classical gene knockout methods are based on DNA recombination between the genomic homologous sequence and the circular suicide plasmid, which carries a pyrE selection marker and two DNA fragments homolo-gous to the upstream and downstream fragments of the target gene. Many wild-type clones are obtained through a reverse recombination between the plasmid and genome in the classic gene knockout method. Therefore, it is neces-sary to develop an efficient gene knockout system to increase the positive clone percentage. Here we report an im-proved gene knockout method using a linear DNA cassette consisting of upstream and downstream homologous fragments, and the pyrE marker. Gene deletions were subsequently detected by colony PCR analysis. We determined the efficiency of our knockout method by deleting the xpb2 gene from the H. volcanii genome, with the percentage of positive clones higher than 50%. Our method provides an efficient geneknockout strategy for halophilic archaea.%随着功能基因组学研究的深入发展，基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
运用pKOR1敲除SE1457 srrAB
In-frame deletion of srrAB （2464bp）
∆srrAB突变株鉴定
PCR鉴定
RT-PCR鉴定
srrA srrA srrAB srrB srrB
Western Blot鉴定
srrAB互补株构建
-∆srrAB（pCN51-srrAB） -∆srrAB（pRAB11-srrA） -∆srrAB（pRAB11-srrB）
细菌的遗传变异现象
• 细菌的变异现象
– 形态结构变异 – 菌落变异 – 毒力变异 – 耐药性变异 –…
细菌遗传变异的物质基础
• 染色体:一条环状双螺旋DNA，无核膜、裸 露于细胞质中，无组蛋白包绕，附着在横 隔中介体上或细胞膜上； • 与真核细胞不同，细菌基因组无内含子， 转录后形成的mRNA不必再剪切、拼接，可 直接翻译成多肽
细菌遗传变异的物质基础
• 转座因子的特点：
– 能从染色体的一个位点转移到另一个位点，或 由一条染色体转移至另一条染色体 – 不能像质粒或噬菌体那样独立存在 – 能编码转座所需的转座酶，移动时携带转座必 需基因一起迁移 – 转座的频率很低，且插入的位点是随机的，不 依赖转座子和靶位点之间序列的同源性
• 常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部 曲思想
基因敲除的技术路线
• 构建重组基因载体（含同源片段的重组质 粒）； • 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入 受体细胞核内（待敲除菌株中）； • 用选择培养基筛选已击中的细胞（筛选重 组子）； • 将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因 动物，对转基因动物进行形态观察及分子 生物学检测（筛选突变株）；
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组技术是一种常用的基因编辑方法，它可以通过精确地改变某一特定基因的序列，从而实现对该基因的敲除或修饰。
同源重组基因敲除原理是基于DNA双链断裂修复机制的原理，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
下面我们将详细介绍同源重组基因敲除的原理及其应用。
首先，同源重组基因敲除的原理是基于DNA修复机制的。
在细胞中，DNA双链断裂是一种常见的DNA损伤形式。
细胞会通过两种主要的修复途径来修复这种损伤，即非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。
在同源重组修复过程中，细胞会利用同源DNA片段来修复断裂的DNA，从而实现对目标基因的敲除或修饰。
其次，同源重组基因敲除的实现需要引入外源DNA片段。
这些外源DNA片段通常包含有与目标基因相同或相似的序列，以便在同源重组修复过程中与目标基因发生配对。
一旦发生同源重组，外源DNA片段会替代目标基因的部分或全部序列，从而实现对目标基因的敲除。
同源重组基因敲除技术在基因编辑领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于研究基因功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以了解该基因在生物体内的功能及其对生物体的影响，从而揭示基因与生物性状之间的关系。
其次，同源重组基因敲除还可以用于生物工程和生物医学研究。
研究人员可以利用这一技术来改良农作物、动物，甚至进行基因治疗，为人类健康和农业生产提供新的解决方案。
总之，同源重组基因敲除是一种重要的基因编辑技术，它基于DNA修复机制，通过引入外源DNA片段来实现对目标基因的敲除。
这一技术在基因功能研究、生物工程和生物医学研究等领域有着广泛的应用前景。
随着基因编辑技术的不断发展，同源重组基因敲除技术将为人类社会带来更多的福祉和进步。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除
adhE 基因
重组 基因
经紫外分光光度法测定，重组菌株经诱 导表达后，乳酸脱氢酶酶活力为114. 8U/ml, 比原始菌株乳酸脱氢酶酶活高了3~4倍
中的应用。
途径工程（Pathway Engineering) ：
利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网 络、并通过DNA重组技术原理设计细胞代谢 途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的 应用性学科。
1．提高细胞已有的化学物质的产量；
许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上 冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为 基因家族的其他成员可以提供同样的功能； 对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性， 也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
五、展望
基因敲除技术在国外已是成熟技术，而国内的技术 相对落后，但是国内目前已有许多单位在一领域开 展了工作。 改造生物、培育新的生物品种，细菌的基因工程技 术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基 因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。 这项新技术在基础理论研究及实际应用中都将有着 广阔的应用前景。
图1
同 源 重 组 原 理 图 示
单交换
双交换
图2
③、同源重组引起的基因敲除—真核细胞：ES细胞
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 技 术 路 线 外显子插有新霉素抗 性基因 （neor）作为 正选择
疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk)基因作为 负选择
根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同：逆 转录病毒可用于动物细胞的插入；植物细胞中农杆 菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可 用于细菌基因敲除。
同源重组的基因敲除
3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
基因敲除
因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤
图2. 由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠
2. 利用随机插入突变进行基因敲除
• 此法是利用某些能随机插入基因序列的病毒，细 菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随 机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞 库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基 因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择 也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插 入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化 和转座子比较常用；噬菌体也可用于细菌基因敲 除。
③ 提供廉价的异种移植器官。众所周知，器官来源稀 少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的 异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源 生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源 分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动 物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具 大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成 功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α－1，3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a１－３半乳糖基转移酶的 基因的２个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子， 人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性， 从而引发超急性免疫排斥反应。缺乏这种酶的情况下， 超急性排斥反应即不会再发生。
基因敲除技术介绍
成单链，并和某些蛋白 形成复合物。
④：上述复合物同与siRNA
互补的mRNA结合，一方 面使mRNA被RNA酶裂解， 另一方面以SiRNA作为引 物，以mRNA为模板，在 RdRP作用下合成出mRNA 的互补链。结果mRNA也 变成了双链RNA，它在 Dicer酶的作用下也被裂 解成siRNA。
利用随机插入突变进行基因敲除
插入载体的选择：
根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。
1)逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；
2)植物细胞中农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；
3）噬菌体可用于细菌基因敲除。
利用随机插入突变进行基因敲除
基 因 捕 获 法
利用随机插入突变进行基因敲除
基因捕获法的优点
利用基因同源重组进行基因敲除
ｄ．选择筛选已击中的细胞：
目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位 点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
ｅ．表型研究：
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变 化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
利用基因同源重组进行基因敲除
该方法通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的克服了随机整合的盲目性和偶然性是一种理想的修饰改造生物遗传物质的方直到现在运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法
2007诺贝尔生理学医学奖获得者
英国人马丁· 埃文斯、 美国人马里奥· 卡佩基、 奥利弗· 史密斯
基因敲除简介
中文名称：基因敲除或基因剔除 英文名称：gene knock-out; gene knockout 定义1：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物 细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基 因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以 及成段基因组序列的敲除。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义2：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。敲除的基因用 以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使其功能完全丧失的实验 技术。 所属学科：遗传学（一级学科）；发育遗传学（二级学科）
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法基因敲除是一种使特定的基因失活或缺失的技术，它可以用来研究基因的功能和表型。
基因敲除的一种常用方法是利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
然而，这种方法并不总是有效，有时候细胞会利用非同源末端连接机制来修复DNA双链断裂，从而导致不可预测的突变或损伤。
本文将介绍利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法，以及它们的优缺点和影响因素。
同源重组同源重组是一种利用未受伤的姐妹染色单体或者人工提供的供体模板作为修复模板的方式，它可以保持基因组的完整性和稳定性。
同源重组主要发生在S期或G2期，当细胞有两份相同或相似的染色单体时。
同源重组的步骤如下：•首先，细胞需要将双链断裂的末端进行修剪，产生3’单链DNA（ssDNA），这个过程需要MRN复合物（由Rad50、Mre11和Nbs1组成）和转录因子CtIP（CtBP-interacting protein）等蛋白质的参与。
•然后，ssDNA被复制蛋白A（Replication protein A，RPA）包被，使其免受核酸酶的降解，并去除二级结构。
•接着，由BRCA2蛋白介导，RPA被重组酶RAD51替换，形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上或供体模板上的同源序列。
•最后，RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板，并与同源DNA序列配对形成D-Loop结构，D-Loop延伸或与另一个末端连接，完成修复过程。
利用同源重组实现基因敲除的方法是设计一个与目标基因有一定同源性但也有一些差异的供体模板，比如在其中插入了一个标记基因或者删除了一个关键片段。
这样，当细胞利用同源重组机制来修复双链断裂时，供体模板会与双链断裂的末端配对，并将修改过的目标基因整合到细胞基因组中，从而达到基因敲除的目的。
利用同源重组实现基因敲除的优点是可以精确地替换或插入目标基因，不会引入额外的突变或缺失。
基因敲除的原理
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
基因敲除
基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。
将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。
将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
例题(18分）1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。
（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。
同源重组原理的基因敲除
同源重组原理的基因敲除同源重组原理是指在相同基因家族中存在有相似的基因序列，在细胞发育或疾病发生过程中，通过交叉互换和基因重组的方式，产生新的基因序列和突变。
同源重组原理的基因敲除是指通过特定方法使某一特定基因失去功能，从而研究该基因在细胞、组织或整个生物体中的作用、功能和调控机制。
同源重组原理的基因敲除方法主要有两种，一种是传统的基因敲除方法，另一种是CRISPR/Cas9系统。
传统的基因敲除方法是通过基因转座，引导同源重组技术来实现基因敲除。
基因转座是指基因序列从一个部位移到其他部位的过程。
以酵母为例，可以构建一个含有基因敲除所需片段的DNA质粒，并通过大量的复制使其进入靶基因的基因座位，然后利用同源重组方式使这个基因座排挤原基因，从而实现基因敲除。
这种方法的优点是简单易行，但存在着一些问题，如基因敲除效率低、通过杂合性培养获取敲除株困难等。
CRISPR/Cas9系统是一种新出现的基因编辑技术，通过修改CRISPR序列和Cas9蛋白使其成为靶向特定基因的工具。
CRISPR序列是一种存在于原核细菌和古细菌基因组中的一段重复序列，与Cas9蛋白一起组成CRISPR/Cas9系统。
Cas9蛋白具有核酸酶活性，可以识别和切割特定的DNA序列。
通过设计合成特异性的CRISPR序列和构建指向目标基因的合适sgRNA（single guide RNA），CRISPR/Cas9系统可以实现高效、准确的基因敲除。
CRISPR/Cas9系统的基因敲除步骤为：首先是设计和合成与目标基因靶向序列相对应的sgRNA，并将其与Cas9蛋白复合；然后将sgRNA和Cas9蛋白复合体导入到细胞中，靶向特定基因的DNA序列；接下来，Cas9蛋白将sgRNA引导到目标基因上，并通过识别和切割目标基因的DNA序列导致其断裂；最后，细胞通过自身修复机制修复断裂的DNA片段，导致错误的连接和缺失，从而使目标基因失去功能。
基因敲除的应用非常广泛。
同源重组基因敲除的流程
同源重组基因敲除的流程同源重组基因敲除，这可是个超有趣的基因操作呢。
一、什么是同源重组基因敲除。
简单来说，就是一种对基因进行改造的方法。
我们就像基因世界里的小魔法师，想要去掉某个基因，就会用到这个技术。
想象一下，基因就像一串长长的项链，而我们要敲除的那个基因就是项链上一颗我们不想要的珠子。
通过同源重组的魔法，我们就能精准地把这颗珠子拿掉啦。
这种技术在研究基因功能的时候可太重要了，就好比我们想知道汽车上某个零件有啥用，那就把这个零件拿掉看看汽车会怎么样，对于基因也是同样的道理哦。
二、准备工作。
要进行同源重组基因敲除，那可得好好准备一番呢。
1. 我们得先找到要敲除的目标基因呀。
这就像在一大群小伙伴（众多基因）里找到那个我们想要捉弄（敲除）的特定小伙伴一样。
这个目标基因得是我们已经研究过，知道大概功能或者是我们特别好奇想知道它功能的基因。
2. 构建打靶载体可是个技术活。
这就像是打造一把专门的钥匙，这个钥匙得和我们要敲除的基因所在的那段“基因锁”匹配得严丝合缝。
这个打靶载体通常包含有和目标基因两端同源的序列，这就好比钥匙的齿要和锁孔形状完全一样才能插进去。
3. 细胞的选择也很关键呢。
不同的细胞就像不同的小房子，有些小房子适合做这种基因敲除的实验，有些就不太合适。
我们得选择那些容易接受外来“改造”，而且在培养的时候比较听话的细胞，就像我们要找那些性格好、容易相处的小伙伴一起玩游戏一样。
三、基因敲除的实际操作。
1. 把构建好的打靶载体导入到我们选好的细胞里。
这一步就像是把我们打造好的特殊钥匙送到小房子（细胞）里去开锁。
导入的方法有好多种呢，像电穿孔法，就像是给细胞通了一下电，让细胞开个小缝，好让打靶载体进去；还有脂质体转染法，这就好比给打靶载体穿上一件特制的“小外套”，这个外套能和细胞的细胞膜很友好地融合，然后带着打靶载体就进去细胞啦。
2. 一旦打靶载体进入细胞，同源重组就开始发生了。
这时候细胞内部就像一个小小的战场，打靶载体上的同源序列会找到目标基因，然后进行交换，就像两个战士在交换武器一样。
同源重组技术原理
同源重组技术原理基因敲除⿏技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，⾸次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这⼀技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利⽤这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出⼩⿏（KO Mice: knockout mice）;由于这⼀⼯作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发⽣在姐妹染⾊单体（sister chromatin) 之间或同⼀染⾊体上含有同源序列的DNA分⼦之间或分⼦之内的重新组合。
在基因敲除⼩⿏制作过程中，需要针对⽬的基因两端特异性⽚段设计带有相同⽚段的重组载体，将重组载体导⼊到胚胎⼲细胞后外源的重组载体与胚胎⼲细胞中相同的⽚段会发⽣同源重组，如图1所⽰：制作流程：图2. 基因敲除⿏制作过程⽰意图1、Knockout载体设计与构建根据研究项⽬具体情况和要求把⽬的基因和与细胞内靶基因特异⽚段同源的DNA ⽚段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
2、Knockout ES细胞筛选Knockout载体测序验证正确后，将载体线性化，然后电转⼊ES细胞，通过载体上的正负筛选基因获得阳性的Knockout ES克隆。
选取PCR鉴定打靶载体正确插⼊的ES基因组DNA⽤于Southern Blot鉴定，将Southern Blot鉴定的Knockout ES扩⼤培养并液氮保存。
3、Knockout ES细胞囊胚注射得到嵌合体⼩⿏扩增经鉴定插⼊或置换⽚段位置正确的Knockout ES细胞，以囊胚显微注射的⽅式将⼀定数量的Knockout ES细胞注⼊特定品系⼩⿏囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的⼩⿏⼦宫中。