文库构建及酵母双杂交技术

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术

1 基因组文库的构建

基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

1. 1构建基因文库的载体选用

载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）

1.2 基因文库构建的一般步骤

1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。

1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建

cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。

2.1高质量mRNA的制备

应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA

可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；

应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；

应选用甲基化dCTP；

应保证所获得双链cDNA 的方向性。

cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。

寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6寡聚(dT)12-18随机6碱基引物R 6mRNA (A)n (T)12-18

(A)n (A)n

(T)12-18R 6R 6R 6R 6R 6R 6第二链合成(A)n

(T)12-18(A)n R 6R 6R 6

R 6R 6R 6(A)n (T)12-18

Eco RI Eco RI 加上EcoRI 接头，磷酸化，cDNA 分级cDNA 合成完毕，准备连接第一链合成

cDNA 合成过程示意图

第四章

基因文库构建及酵母双杂交技术

接头及引物序列无RNaseH活性的反转

录酶，5’甲基化的dNTP

XhoI

RNaseH，DNA聚合酶I

XhoI

EcoRI接头，T4连接酶

EcoRI XhoI

XhoI酶切

XhoI

完整有方向的cDNA cDNA合成的分子修饰

cDNA文库的构建

3 RACE技术

cDNA 3′

端的快速扩增法

（3′RACE 法）

(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)

•3`-Full RACE法

cDNA 5′

端的快速扩增法

（5′RACE 法）

(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)

5 ’ RACE原理

●Self-Ligation 法

5’ RACE 法种类

1.使用RNA Ligase 的5’ RACE 法

●Self-Ligation Method

●Adaptor-Adding Method

2. 使用TdT (Terminal Deoxynucleotidyl

Transferase) 的5’ RACE 法

Adaptor-Adding Method 原理

TdT 法原理

几种5’ RACE 法的比较¿É·ñ½øÐNested PCR TdT·¨

Öк¬PolyG ²»¿ÉµÍSelf-Ligation·¨ÒýÎïÇé¿öÀ©ÔöÌØÒìÐÔ¸ßÖиß

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