细胞染色

细胞染色

（1）消化收集细胞，以2-10×103 cell/coverslip 接种细胞于24孔板中，滴加细胞悬液50-100µl，2小时后补加10%FBS+DMEM500µl

（2）37℃细胞培养箱中培养48小时后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量适应的玻片做染色。

（3）去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加3.7-4%甲醛0.5ml（in PBS）室温固定10min （4）PBS洗两次，加穿膜液0.5ml（0.1％triton X-100+0.1M Gycine）冰上30min

（5）PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.3ml室温封闭1小时。

（6）PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗（用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25µl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时

将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的24孔板中，PBS洗两次，取另外一张封口膜，做好标记，加二抗（羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25µl 于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时

（7）同上PBS洗两次，同上操作，将玻片与10µl DAPI (1µg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O) 室温孵育1－5min.

（8）PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记（时间，细胞名称，实验内容，号码）

（9）待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察完后将玻片放－20℃保存。

（10）若只观察转染了EYFP的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可直接用DAPI染核后封片。

（11）以BSA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行2组以上。

10. 盖玻片的处理

（1）10×10的盖玻片用医用酒精浸泡过夜(若玻片较脏，可浸泡酸液过夜，用自来水冲洗十几遍后用双蒸水冲三四遍，晾干，用酒精泡过夜，以下步骤同)

（2）将酒精倒掉,晾干。

（3）准备干净塑料15ml离心管，用蒸馏水稀释多聚赖氨酸1：10后室温浸泡盖玻片5min （如果室温小于15℃时延长至10min）,捞出后于工作台晾干后，密封后可保存半年以上。

（4）上述稀释液可反复浸泡，一般每瓶多聚赖氨酸可够100－200张玻片使用，稀释液保存于4℃，三个月内仍可使用。

1、DAPI的目的是什么？看核？凋亡？转荧光蛋白以观察在核中的分布？

2、玻片是否是细胞培养之前加入到孔板中的？或者不用孔板用皿代替的话是一样

的？

3、封片如何进行？

4、第一步为什么先取细胞滴液，两小时后添加培养基？是否是为了让细胞更好的贴到

玻片上？

单纯DAPI染色实验：

1.将处理好的盖玻片置于培养皿中，？，培养到适宜情况后（假设3.5厘米盘甲1 ml培养

基）

2.去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加

3.7-4%甲醛1ml（in PBS）室温固定10min

3.PBS洗两次，加穿膜液1ml（0.1％triton X-100+0.1M Gycine）冰上30min

4.PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.6ml室温封闭1小时。

5.PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，将10µl DAPI (1µg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml

in dd H2O) 加到封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在DAPI染液滴上，室温孵育1－5min.

将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的培养皿中

PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记（时间，细胞名称，实验内容，号码）

6.待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察

完后将玻片放－20℃保存。

1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。

2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 µg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。

3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色

DAPI，即2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，也称DAPI dihydrochloride，分子式为C16H15N5·2HCl，分子量为350.25，CAS Number 28718-90-3。

DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。和双链DNA结合后可以产生比DAPI 自身强20多倍的荧光。和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。

DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI 也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。

DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

用于细胞核染色时，推荐的DAPI工作浓度为0.5-10μg/ml

Separately DAPI staining:

• Wash the cells twice with PBS：用PBS洗细胞两次

• Incubate with 1: 750 of stock DAPI for 5 min in dark：黑暗中用1/750的DAPI贮存液温育5min

• Wash 2 x 5 min with PBS in dark：黑暗条件下用PBS洗涤两次，每次五分钟

• Rinse with water for a few seconds：用水清洗几次

• Air dry at RT in dark：黑暗条件下室温自然晾干

• Mount with antifade solution (Vectashield, Co#: H-1000, Vector Lab)：孵抗猝灭剂

5 µl for each d12 mm coverslip, 25 µl for square coverslip and 50µl for full size coverslip

• Seal the coverslip with nail polish：用指甲油封闭

• Store in 4 C up to 2 weeks、四摄氏度可储存两周