MASCOT介绍与蛋白质鉴定
椰浆中椰子蛋白的提取、分离和鉴定
热带作物学报2021, 42(4): 1106 1112Chinese Journal of Tropical Crops椰浆中椰子蛋白的提取、分离和鉴定林塬1,2，吴毓炜2，王焱2，吉哲蓉2，乐学义1*1. 华南农业大学应用化学系，广东广州 510642；2. 海南省产品质量监督检验所/国家热带农产品质量监督检验中心，海南海口 570203摘要：为了更好地了解市售椰浆中椰子蛋白质量状况，本研究以市售的10种椰浆为样品，采用反向高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对提取蛋白进行分析，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）对蛋白进行鉴定。
结果表明：椰浆RP-HPLC约在10.4 min和11.9 min分别出现1个色谱峰，大多数样品峰面积大小都与蛋白标签含量一致，SDS-PAGE条带数量和颜色的深浅与RP-HPLC得到的峰面积结果一致，个别样品标签含量高，SDS-PAGE能分离出的蛋白条带数量也较多，但RP-HPLC的椰子蛋白峰面积小，经MALDI-TOF/TOF-MS鉴定，部分条带没有鉴定出椰子有关的肽段或蛋白。
研究结果为椰浆蛋白的食品安全与质量控制提供了方法参考和示范。
关键词：椰浆；蛋白分析；鉴定；RP-HPLC；SDS-PAGE；MALDI-TOF/TOF-MS中图分类号：S667.4 文献标识码：AExtraction, Isolation and Identification of Coconut Protein from Co-conut MilkLIN Yuan1, 2, WU Yuwei2, WANG Yan2, JI Zherong2, LE Xueyi1*1. Department of Applied Chemistry, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China;2. Products Quality Supervision and Testing Institute of Hainan Province / National Quality Supervision and Inspection Center for Tropical Ag-riculture Products, Haikou, Hainan 570203, ChinaAbstract: In order to better understand the quality of coconut protein in commercially available coconut milk, 10 types of coconut milk were used as the samples bought from the market. Reversed-phase high performance liquid chromatog-raphy (RP-HPLC) and sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were used to analyze the extracted proteins, identified through matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrome-try (MALDI-TOF/TOF-MS). There were two peaks in RP-HPLC of coconut milk at 10.4 min and 11.9 min, the peak area of most samples were consistent with the protein label content. The number of SDS-PAGE bands and intensity were consistent with the peak area results obtained by RP-HPLC. Some samples had high label content, and SDS-PAGE could separate more protein bands, but the peak area of coconut protein from RP-HPLC was small. The protein bands were identified with MALDI-TOF/TOF-MS and no coconut-related peptides or proteins were identified. This method could be used for the isolation and identification of coconut protein in coconut milk.Keywords: coconut milk; protein analysis; identification; RP-HPLC; SDS-PAGE; MALDI-TOF/TOF-MSDOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.029椰子（Cocos nucifera L.）是棕榈科（Palmae）椰子属（Cocos）植物[1]，是世界上重要的果树收稿日期 2020-03-02；修回日期 2020-06-17基金项目 海南省科学技术厅项目（No. KYYS-2014-69）。
mascot检索结果解读
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Mascot检索结果解读主要涉及对检索结果中各个部分的解析，具体如下：
1. 检索结果概述：首先，需要查看Mascot检索结果的整体概述，包括总得分、匹配的肽段序列数、匹配的谱峰数等。
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总的来说，解读Mascot检索结果需要仔细分析每个部分，并结合实际情况进行综合评估。
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生物信息学在蛋白质组学研究中的应用
生物信息学在蛋白质组学研究中的应用在当今生命科学的前沿领域中，蛋白质组学的研究正如火如荼地开展着。
蛋白质组学旨在全面、系统地研究细胞、组织或生物体中蛋白质的组成、结构、功能以及相互作用。
而生物信息学作为一门交叉学科，正为蛋白质组学的研究提供了强大的工具和方法，加速了我们对生命活动的深入理解。
蛋白质组学研究产生了海量的数据，这些数据的复杂性和规模远远超出了传统实验方法所能处理的范围。
生物信息学的介入就像是为这些数据的分析和解读配备了一把“万能钥匙”。
它通过运用各种算法、数据库和统计方法，能够从纷繁复杂的数据中挖掘出有价值的信息。
首先，在蛋白质鉴定方面，生物信息学发挥着关键作用。
质谱技术是目前蛋白质组学研究中常用的蛋白质鉴定手段。
通过质谱分析得到的大量肽段数据，需要与蛋白质数据库进行比对，以确定其对应的蛋白质。
生物信息学提供了高效的算法和软件，能够快速准确地完成这一比对过程。
例如，常用的搜索引擎如 Mascot 和 SEQUEST 等，它们基于不同的算法原理，能够根据质谱数据的特征，在庞大的蛋白质数据库中搜索匹配的肽段和蛋白质。
除了鉴定，蛋白质定量也是蛋白质组学研究的重要内容。
在这方面，生物信息学同样不可或缺。
基于质谱的定量蛋白质组学技术，如标记定量（如 iTRAQ、TMT 等）和非标记定量，都会产生大量的数据。
生物信息学工具可以对这些数据进行处理和分析，计算出不同样品中蛋白质的相对或绝对丰度。
通过统计学方法，可以筛选出在不同条件下表达水平发生显著变化的蛋白质，为进一步研究蛋白质的功能和调控机制提供线索。
在蛋白质结构和功能预测方面，生物信息学也有着出色的表现。
虽然实验方法可以测定蛋白质的三维结构，但由于技术难度和成本等因素的限制，能够测定结构的蛋白质数量相对较少。
生物信息学通过利用已知蛋白质结构的信息和相关算法，可以对未知结构的蛋白质进行结构预测。
同时，根据蛋白质的序列特征和结构信息，还可以预测其功能，例如酶的活性位点、蛋白质的相互作用位点等。
MALDI-TOF MS的原理和应用_1226
蛋白质的搜库鉴定
Protein ID
Mascot Search Results
内容提要
MALDI-TOF质谱的基本原理 蛋白鉴定和蛋白质组分析 定量蛋白质组学 细菌鉴定 血清多肽谱分析 分子成像
BioTyper：微生物的鉴别与分类
如何快速鉴别不同种类的微生物？
实验流程
菌种鉴定 数据分析 质谱分析
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的 原理和应用简介
周春喜 博士
布鲁克·道尔顿公司 应用工程师
内容提要
MALDI-TOF质谱的基本原理 蛋白鉴定和蛋白质组分析 定量蛋白质组学 细菌鉴定 血清多肽谱分析 分子成像
什么是质谱仪？
样品
++ +
离子源
质量分析器
生物质谱仪的离子源与质量分析器
离子源
ElectroSpray Ionization (ESI) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
41
| Ps. fluoreszens B340 |
3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 |
4
| Ps. veronii DSM11331 |
4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 |
6318
7276
0 2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
分子量(定性信息)
9556 9000
m /z
多肽和蛋白质分子量的测定
a.i. 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
蛋白测序方法
蛋白测序方法一、概述蛋白质是生命体中最基本的分子之一，对于研究生命科学具有重要的意义。
蛋白质测序是研究蛋白质结构和功能的重要手段之一，也是研究蛋白质组学的基础。
本文将介绍蛋白质测序方法。
二、样品制备1. 蛋白提取样品制备是蛋白质测序的第一步，需要从生物体中提取出目标蛋白。
常用的提取方法包括机械破碎、超声波破碎、化学法等。
2. 蛋白纯化在进行蛋白质测序前，需要对目标蛋白进行纯化。
常用的纯化方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
三、消化和分离1. 蛋白消化将目标蛋白进行消化，得到肽段。
常用的消化酶有胰酶、肝酶等。
2. 肽段分离将消化后得到的肽段进行分离，常用的分离方法有高效液相色谱（HPLC）、电泳等。
四、质谱分析1. 质谱仪质谱仪是蛋白质测序中最常用的仪器，常用的有MALDI-TOF、ESI-MS等。
2. 数据分析将质谱数据进行处理和分析，得到肽段序列。
常用的软件有MASCOT、SEQUEST等。
五、序列鉴定和验证1. 数据库搜索将得到的肽段序列与数据库进行比对，确定蛋白质的序列信息。
2. 验证方法常用的验证方法包括Western blotting、ELISA等。
六、总结蛋白质测序是研究蛋白质结构和功能的重要手段之一，需要经过样品制备、消化和分离、质谱分析以及序列鉴定和验证等多个步骤。
在进行蛋白质测序前，需要对目标蛋白进行纯化。
在数据分析中，常用的软件有MASCOT、SEQUEST等。
通过蛋白质测序能够确定蛋白质的序列信息，为后续研究提供了基础。
灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(１):３０￣３６ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ戚良轩ꎬ徐晴玉ꎬ李㊀晶ꎬ等.灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(１):３０￣３６.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０１.００４灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定戚良轩１ꎬ㊀徐晴玉１ꎬ㊀李㊀晶１ꎬ㊀鞠佳菲１ꎬ㊀孙㊀洋２ꎬ㊀方继朝１ꎬ３ꎬ㊀纪㊀锐１ꎬ２ꎬ３(１.江苏省农业科学院植物保护研究所ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.安徽师范大学生命科学学院/安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室ꎬ安徽芜湖２４１０００ꎻ３.淮阴师范学院/江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心ꎬ江苏淮安２２３３００)收稿日期:２０２２￣０９￣２６基金项目:国家自然科学基金面上项目(３１８７１９６５)ꎻ 十四五 国家重点研发计划项目(２０２１ＹＦＤ１４０１１００)ꎻ江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２２)３０１８]作者简介:戚良轩(１９９３－)ꎬ男ꎬ安徽铜陵人ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事作物与害虫互作研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)４７０７２４５６４＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ徐晴玉为共同第一作者ꎮ通讯作者:纪㊀锐ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｉｒｕｉ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎꎻ方继朝ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｆａｎｇｊｃ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀灰飞虱是一种小型的刺吸式口器昆虫ꎬ是危害水稻的主要害虫之一ꎮ灰飞虱刺吸取食时分泌的胶状唾液可形成唾液鞘ꎬ保护口针并帮助取食ꎬ同时其中的蛋白质效应子在调控作物免疫中扮演重要角色ꎮ本研究利用扫描电子显微镜观察了灰飞虱唾液鞘的形态:多呈树枝状ꎬ表面为较为光滑的珠状结构ꎮ应用双层膜装置收集了若虫的唾液鞘ꎬ经液相色谱与串联质谱联用检测鉴定得到４２种灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ其中１９种蛋白质检测到２个及以上的唯一肽段ꎮ进一步分析了编码这１９种蛋白质的基因在各个组织中的表达模式ꎬ发现其中８个基因在唾液腺中明显高表达ꎬ推测其可能参与了唾液鞘的形成以及害虫￣作物的互作ꎮ唾液鞘蛋白质组分鉴定为后续筛选和研究灰飞虱效应子功能提供了基础ꎬ有助于明确灰飞虱￣水稻互作的分子机制ꎬ为开发害虫绿色防控新策略提供思路ꎮ关键词:㊀灰飞虱ꎻ唾液鞘ꎻ蛋白质组分中图分类号:㊀Ｓ４３５.１１２㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０１￣００３０￣０７ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｆｒｏｍＬａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓＱＩＬｉａｎｇ￣ｘｕａｎ１ꎬ㊀ＸＵＱｉｎｇ￣ｙｕ１ꎬ㊀ＬＩＪｉｎｇ１ꎬ㊀ＪＵＪｉａ￣ｆｅｉ１ꎬ㊀ＳＵＮＹａｎｇ２ꎬ㊀ＦＡＮＧＪｉ￣ｃｈａｏ１ꎬ３ꎬ㊀ＪＩＲｕｉ１ꎬ２ꎬ３(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｓｅｏｆＩｍｐｏｒ￣ｔａｎｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＡｎｈｕｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈｕ２４１０００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＪｉａｎｇｓｕＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＲｅｇｉｏｎａｌＭｏｄｅｒｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ/ＨｕａｉｙｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨｕａｉᶄａｎ２２３３００ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ(ＳＢＰＨ)Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓꎬｔｈｅｔｉｎｎｙｓａｐ￣ｓｕｃｋｉｎｇｉｎｓｅｃｔｓꎬｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓｄａｍａｇｉｎｇｒｉｃｅｉｎＣｈｉｎａ.ＤｕｒｉｎｇｔｈｅｆｅｅｄｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓꎬｇｅｌｓａｌｉｖａｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＳＢＰＨｓｃａｎｆｏｒｍｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｔｏｐｒｏｔｅｃｔｓｔｙｌｅｔａｎｄｈｅｌｐｆｅｅｄｉｎｇ.Ｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎｅｆｆｅｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａ￣ｔｉｎｇｐｌａｎｔｉｍｍｕｎｉｔｙ.ＨｅｒｅꎬｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＳＢＰＨｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ:ｍｏｓｔｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｗｅｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃａｎｄｈａｄｓｍｏｏｔｈｂｅａｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅ.ＴｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｏｆＳＢＰＨｎｙｍｐｈｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｄｏｕｂｌｅｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｖｉｃｅ.Ａｆｔｅｒｔｈｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｅｒ(ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)ａｎａｌｙｓｉｓꎬ４２ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｆｉｎａｌｌｙｉ￣ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓꎬａｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｍꎬ１９ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｓｗｉｔｈｔｗｏｏｒｍｏｒｅｕｎｉｑｕｅｐｅｐｔｉｄｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.Ｕ￣ｓｉｎｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎꎬｗｅａｎａｌｙｚｅｄ０３ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｇｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｓｅ１９ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＳＢＰＨꎬａｎｄｆｏｕｎｄｅｉｇｈｔｇｅｎｅｓｗｉｔｈｄｒａｍａｔ￣ｉｃａｌｌｙｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｓａｌｉｖａｒｙｇｌａｎｄꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈｅｉｒｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓａｎｄｉｎ￣ｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｉｎｓｅｃｔａｎｄｐｌａｎｔ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｙａｓｏｌｉｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＳＢＰＨｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈꎬｒｅｖｅａ￣ｌｉｎｇｔｈｅｄｅｔａｉｌｅｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳＢＰＨ￣ｒｉｃｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎꎬａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｇｒｅｅｎｐｅｓｔｍａｎａｇｅｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓꎻｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈꎻｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔ㊀㊀作物与害虫之间一直存在共同进化的 军备 竞赛ꎮ作物通过受体识别与感知害虫的相关分子信号激活一系列的免疫反应ꎬ比如:诱发钙离子内流ꎬ激活丝裂原活化蛋白激酶途径ꎬ诱导活性氧爆发和抗虫激素积累ꎬ进而产生有毒物质影响昆虫的取食㊁发育ꎬ或产生挥发物来吸引害虫天敌ꎮ相应地ꎬ害虫也进化出各种对抗策略来逃避与破解植物的防御反应ꎬ分泌效应子至宿主作物体内就是其中的重要策略之一[１]ꎮ灰飞虱(Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ)等刺吸式口器害虫在取食过程中ꎬ向作物体内不断地分泌２种类型的唾液 水状唾液与胶状唾液ꎬ调控植物免疫ꎬ帮助昆虫取食[２]ꎮ水状唾液中的酶类可以将植物的营养物质初步降解ꎬ有利于消化吸收ꎬ部分效应子还能以多种形式与植物抗虫因子相互作用ꎬ比如ꎬ(１)酶解宿主植物中的抗虫物质:褐飞虱(Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓ)唾液中的内切β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶能分解水稻中的纤维素ꎬ便于口针在水稻细胞间和向细胞内穿刺时突破细胞壁屏障ꎬ帮助其顺利取食[３]ꎮ灰飞虱唾液中的ＤＮａｓｅＩＩ能够降解刺吸损伤时植物产生的胞外ＤＮＡꎬ进而抑制刺吸损伤诱导的防御反应[４]ꎻ(２)与植物细胞内的金属离子结合:褐飞虱和灰飞虱唾液中的钙结合蛋白通过结合水稻细胞质中的Ｃａ２＋ꎬ阻断钙信号通道ꎬ抑制取食所诱导的水稻胼胝质沉积以及抗虫信号分子的积累[５￣７]ꎻ(３)与植物中的关键抗虫蛋白质互作:灰飞虱效应子卵黄原蛋白在细胞核中与免疫调控转录因子ＯＷＲＫＹ７１互作ꎬ并抑制其转录活性ꎬ进而抑制ＯｓＷＲＫＹ７１介导的防御反应[８]ꎻ烟粉虱(Ｂｅｍｉｓｉａｔａｂａｃｉ)效应子Ｂｔ５６㊁Ｂｓｐ９㊁Ａｒ￣ｍｅｔ分别和寄主植物中的转录因子ＮＴＨ２０２和ＷＲＫＹ３３以及半胱氨酸蛋白酶抑制子ＣＹＳ６互作ꎬ抑制植物免疫[９￣１１]ꎮ然而ꎬ胶状唾液的成分鉴定和功能分析的报道相对较少ꎬ目前仅在褐飞虱中鉴定到１６种蛋白质[１２]ꎮ胶状唾液分泌进入植物体内后凝结成唾液鞘ꎬ包裹㊁润滑和保护口针[１３]ꎬ还能隔绝口针和植物细胞结构的接触ꎬ封闭针刺产生的细胞伤口ꎬ防止植物细胞内容物外流所引发的免疫反应ꎮ飞虱唾液鞘中的主要蛋白质(Ｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎ和Ｍｕｃｉｎ)对于唾液鞘的形成和取食至关重要[１４￣１５]ꎬ沉默Ｍｕｃｉｎ能影响飞虱的取食行为ꎬ不利于植物病毒的水平传播[１６]ꎬ而且Ｍｕｃｉｎ还可以被作物识别ꎬ激发强烈的防御反应[１５]ꎮ灰飞虱属半翅目飞虱科害虫ꎬ由其直接取食㊁产卵和传播病毒病所引起的粮食减产损失极其严重ꎮ唾液是植物￣病毒￣昆虫三者互作的关键因素ꎬ鉴定灰飞虱的唾液鞘蛋白效应子ꎬ设计相应策略阻断这些唾液效应子的功能ꎬ一方面可以有效地控制灰飞虱的直接危害ꎬ另一方面通过抑制其取食来阻断作物病毒的水平传播ꎬ起到 一石二鸟 的作用ꎮ本研究拟在电子显微镜下观察灰飞虱唾液鞘的形态ꎬ利用液相色谱与串联质谱联用(Ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｅｒꎬＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ)等方法鉴定灰飞虱唾液鞘蛋白质组分ꎬ并采用定量ＰＣＲ技术对唾液鞘基因的组织表达模式进行分析ꎬ为后续效应子筛选积累重要的蛋白质资源ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试昆虫灰飞虱在人工气候室内[温度:(２８ʃ１)ħꎻ光周期:１４ｈ光照㊁１０ｈ黑暗]以南粳９１０８稻苗为寄主进行饲养ꎮ１.２㊀双层膜夹蔗糖溶液用高压灭菌后的超纯水溶解蔗糖ꎬ配置成２.５％的蔗糖溶液ꎬ经针孔式过滤器(滤膜孔径０ ２２μｍ)除菌ꎮ将Ｐａｒａｆｉｌｍ膜裁成小方块ꎬ置于紫外灯下灭菌１ｈꎮ将充分拉伸过的膜覆盖在双通玻璃管的一端ꎬ另一端用纱布包住透气ꎮ将８０μｌ蔗糖溶液滴到膜的中央位置ꎬ再覆上第２层膜ꎬ压紧２层膜使蔗１３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定糖溶液在膜间充分铺展ꎮ１.３㊀唾液鞘样品处理及形态观察(１)样品收集与清洗:将约６０头４~５龄灰飞虱若虫放进双通管中ꎬ待灰飞虱在上述的Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上取食蔗糖溶液２４ｈ后ꎬ用７５％乙醇溶液轻轻漂洗带有唾液鞘的膜ꎮ(２)固定:将４％多聚甲醛与２ ５％戊二醛(２ʒ１ꎬ体积比)混合配置成固定液ꎬ对Ｐａｒａｆｉｌｍ膜进行固定ꎬ然后去除固定液ꎬ并用ＰＢＳ溶液进行清洗ꎮ(３)脱水:用梯度浓度的乙醇溶液(３０％~１００％)对样品进行梯度脱水ꎮ(４)置换:向上述样品中倒入醋酸异戊酯和乙醇(１ʒ２ꎬ体积比)的混合液ꎬ适当摇动１０ｍｉｎꎻ转移膜至醋酸异戊酯ʒ乙醇(１ʒ１ꎬ体积比)的混合液中ꎬ摇动１０ｍｉｎꎻ最后转移膜至醋酸异戊酯中ꎬ缓慢摇动１０ｍｉｎꎬ从样品中充分置换出乙醇ꎮ(５)干燥:用滤纸吸除样品表面残留的醋酸异戊酯ꎬ将样品膜在室温下干燥２４ｈꎬ然后转移至５０ħ的烘箱中ꎬ干燥２ｈꎻ(６)粘样㊁镀膜:采用导电双面胶将膜粘到样品台上ꎬ利用离子溅射法镀膜ꎻ(７)样品观察:在扫描电镜观察室进行观察ꎬ拍摄获得唾液鞘的清晰图片ꎮ涉及的具体方法参照文献[１７]ꎮ１.４㊀唾液鞘收集在体视显微镜下观察ꎬ用镊子从Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上取下完整的唾液鞘ꎬ放入ＳＤＴ蛋白裂解液中ꎬ－８０ħ保存ꎮ取约６０００头若虫的唾液鞘ꎬ超声波破碎处理(１００Ｗ工作１０ｓꎬ间歇１０ｓꎬ循环１０次)ꎬ沸水浴１０ｍｉｎꎮ离心后取上清液ꎬ利用胰蛋白酶进行充分酶解ꎬ获得肽段ꎮ１.５㊀ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ测定上述酶解后的肽段上样到经０ １％甲酸溶液平衡过的色谱柱ꎬ再经分析柱分离ꎬＨＰＬＣ系统流速设定为０ ３μｌ/ｍｉｎꎮ色谱分离后的产物进一步用Ｑ￣Ｅｘａｃｔｉｖｅ质谱仪检测２ｈꎮ１.６㊀质谱数据分析和蛋白质鉴定将获得的质谱数据利用ＭＡＳＣＯＴ软件比对灰飞虱基因组预测的蛋白质数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｄａｔａ￣ｈｕｂ/ｇｅｎｏｍｅ/?ｔａｘｏｎ＝１９５８８３＆ａｎｎｏｔａｔｅｄ＿ｏｎｌｙ＝ｔｒｕｅ＆ｒｅｆｓｅｑ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＝ｔｒｕｅ＆ｇｅｎｂａｎｋ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＝ｔｒｕｅ)ꎮ参数设定如下:ｅｎｚｙｍｅ为ｔｒｙｐｓｉｎꎻｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖ￣ａｇｅｓｉｔｅｓ为２ꎻｆｉｘｅｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ为ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌꎻｖａｒ￣ｉａｌｂｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ为ｏｘｉｄａｔｉｏｎ(Ｍ)和Ａｃｅｔｙｌ(ＰｒｏｔｅｉｎＮ￣ｔｅｒｍ)ꎻ过滤参数ＦＤＲɤ０ ０１ꎮ１.７㊀灰飞虱各组织总ＲＮＡ提取和荧光定量ＰＣＲ分析㊀㊀灰飞虱各组织总ＲＮＡ的提取参照普洛麦格生物技术有限公司的总ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行ꎬ提取的总ＲＮＡ用琼脂糖凝胶电泳和艾本德有限公司的微量分光光度计检测其质量和浓度ꎮｃＤＮＡ合成参照宝生物工程有限公司的反转录试剂盒说明书进行ꎮ定量ＰＣＲ配置体系和方法参照宝生物工程有限公司的染料法荧光定量试剂盒(ＴＢＧｒｅｅｎＴＭＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭｋｉｔ)说明书进行ꎬ在罗氏的ＬｉｇｈｔＣｙ￣ｃｌｅｒ４８０ＩＩ实时荧光定量ＰＣＲ仪上进行反应ꎮ灰飞虱延伸因子基因(ＥＦ￣１)为内参基因ꎬ唾液鞘基因相对表达量的计算采用２－әＣｔ方法[８]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀灰飞虱唾液鞘形态利用扫描电子显微镜观察Ｐａｒａｆｉｌｍ膜上的灰飞虱唾液鞘的形态ꎮ唾液鞘多为树枝状ꎬ可有多个分叉ꎬ大多数表面为较光滑的珠状结构(图１)ꎮ图１㊀扫描电子显微镜观察的灰飞虱唾液鞘的形态Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ２.２㊀灰飞虱唾液鞘样品质量检测收集到６９ ７μｇ灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ利用ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析了唾液鞘样品的质量ꎬ蛋白质条带(考染)清晰㊁丰富(图２)ꎬ表明唾液鞘蛋白质含量较高ꎬ并且未发生明显的降解和损失ꎮ唾液鞘样品质量较好ꎬ可满足后续蛋白质组分测定的要求ꎮ２３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期２.３㊀灰飞虱唾液鞘蛋白质鉴定与注释利用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ检测了灰飞虱唾液鞘的蛋白质成分ꎬ共鉴定到４２种蛋白质ꎬ其中１９种蛋白质检测到的肽段数量较多ꎬ有２~３４个唯一肽段ꎻ其他２３种蛋白质只检测到１条唯一肽段ꎮ利用ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０预测这些唾液鞘蛋白质的信号肽序列:仅４个含信号肽ꎬ分别是精氨酸激酶和肌动蛋白ꎬ以及２个未知功能蛋白质(ＫＡＦ７７５１９７４.１和ＲＺＦ３３３７９.１)ꎮ将鉴定到的蛋白质氨基酸序列比对到ＮＣＢＩ的Ｎｏｎ￣ＲｅｄｕｎｄａｎｔＰｒｏｔｅｉｎ(ＮＲ)数据库进行功能注释ꎬ发现其中３６个具有功能注释结果(表１)ꎮ肌球蛋白重链在唾液鞘蛋白质中含量最高ꎬ检测到３４个唯一肽段ꎮ副肌球蛋白质的含量次之ꎬ检测到１２个唯一肽段ꎮ图２㊀ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析灰飞虱唾液鞘样品Ｆｉｇ.２㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｓｕ￣ｓｉｎｇＳＤＳ￣ＰＡＧＥ２.４㊀灰飞虱唾液鞘基因的组织表达模式检测到１９种唾液鞘蛋白质的唯一肽段数ȡ２(表１)ꎬ表明这些蛋白质的鉴定结果可信度较高ꎬ因此利用定量ＰＣＲ探究了这１９个基因在灰飞虱各组织中的表达模式ꎬ引物见表２ꎮ结果(图３)表明ꎬ编码副肌球蛋白㊁精氨酸激酶㊁原肌球蛋白￣１㊁延伸因子１￣α㊁肌球蛋白调节轻链２㊁碱性肌球蛋白轻链㊁组蛋白Ｈ２Ｂ以及微管蛋白β￣１链的８个基因在唾液腺中特异性高表达ꎬ而在脂肪体㊁肠道㊁精巢以及卵巢中表达量很低ꎮ其余基因在灰飞虱各个组织中均有不同程度的表达ꎮ表１㊀灰飞虱唾液鞘蛋白质组分Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈ蛋白质组分㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀登录号㊀㊀唯一肽段数是否含有信号肽肌球蛋白重链ＡＰＡ３４０５４.１３４否副肌球蛋白ＲＺＦ４０８５４.１１２否肌动蛋白相关蛋白１ＲＺＦ３２７２３.１１０否ＡＴＰ合酶α亚基ＡＩＬ２６０６９.１５否精氨酸激酶ＲＺＦ４１８４６.１４是原肌球蛋白￣１ＲＺＦ３７４７７.１３否组蛋白Ｈ４ＸＰ＿０１５３７２５９６.１３否羧化酶/加氧酶大亚基ＡＳＤ３５３９２.１３否原肌球蛋白１ＲＺＦ４６５３７.１３否延伸因子１￣αＲＺＦ３５６８２.１３否ＡＴＰ合酶β亚基ＲＺＦ４１６５０.１３否钙转运ＡＴＰ酶ＲＺＦ３６５６０.１２否肌球蛋白调节轻链２ＲＺＦ４１８００.１２否碱性肌球蛋白轻链ＲＺＦ４５２４２.１２否组蛋白Ｈ２ＢＡＡＢ４８０９２.１２否α￣肌动蛋白ＲＺＦ３９１３４.１２否肌动蛋白ＧＦＴ５５０９０.１２否ＡＤＰ/ＡＴＰ易位酶ＲＺＦ３２５９４.１２否微管蛋白β￣１链ＸＰ＿０２２２０７９２１.１２否原肌球蛋白￣１ＸＰ＿０２２１８７６２３.１１否未知功能蛋白ＸＰ＿０２２１６８１６６.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ３９７５７.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ４７２６６.１１否黏蛋白ＪＦ５０２０３３.１１是动力蛋白β链ＲＺＦ４４４３７.１１否剪接因子１ＫＡＦ７７４２３２３.１１否光系统ＩＩＣＰ４３反应中心蛋白ＫＡＨ９７５２４９８.１１否可能的分泌蛋白ＱＭＵ２３６０４.１１否组蛋白Ｈ４ＣＡＦ９９２８７７８.１１否未知功能蛋白ＫＡＦ７７５１９７４.１１是表皮蛋白７ＸＰ＿０２２１８６６３４.１１否ＡＴＰ合酶α亚基ＫＸＮ６９５２８.１１否线粒体Ｆ１Ｆ０ＡＴＰ合酶ＲＣＩ０５４０５.１１否肌动蛋白ＡＭＺ０１５５３.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ４０２３４.１１否热休克蛋白７０￣５ＡＱＰ３１３３８.１１否微管蛋白α￣１链ＲＺＦ４７５７８.１１否原肌球蛋白￣１ＲＺＦ４１１１９.１１否液泡蛋白分选蛋白ＸＰ＿０２２１９５４５８.１１否ＡＴＰ合酶脂质结合蛋白ＲＺＦ４６１９２.１１否包含ＢＴＢ/ＰＯＺ结构域的蛋白１ＲＺＦ３７４２１.１１否未知功能蛋白ＲＺＦ３３３７９.１１是３３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定ＳＧ:唾液鞘ꎻＧｕｔ:肠道ꎻＴｅ:精巢ꎻＯｖ:卵巢ꎻＦＢ:脂肪体ꎮ不同字母表示组织间同一基因的相对表达量具有显著性差异(Ｐ<０ ０５)ꎮ图３㊀灰飞虱唾液鞘基因的组织表达模式Ｆｉｇ.３㊀Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｇｅｎｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ３㊀讨论本研究利用扫描电子显微镜观察到灰飞虱唾液鞘呈树枝状的清晰形态ꎬ并收集了大量的灰飞虱唾液鞘样品ꎬ利用ＬＣ￣ＭＳ/ＭＳ测定了其蛋白质组分ꎬ鉴定得到４２个灰飞虱唾液鞘蛋白质ꎬ其中ＡＴＰ合成酶ꎬ肌动蛋白和Ｍｕｃｉｎ在褐飞虱唾液鞘蛋白质中也被鉴定到[１２]ꎬ其他唾液鞘蛋白质组分为首次报道ꎮ我们鉴定到的灰飞虱唾液鞘蛋白质数量虽然比褐飞虱唾液鞘中鉴定得到的蛋白质数量(１６种)要多[１２]ꎬ但是远少于水状唾液中鉴定得到的蛋白质数量(褐飞虱水状唾液中鉴定到１４９种蛋白质ꎬ灰飞虱中鉴定到２３６种)[１８]ꎬ这说明水状唾液中蛋白质比胶状唾液中蛋白质的种类和功能更丰富ꎬ这可能是因为水状唾液参与了飞虱取食㊁体外消化和降解㊁调控水稻防御等多种功能ꎬ而胶状唾液多为结构性蛋白质ꎬ其主要参与唾液鞘形成ꎮ４３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期表２㊀灰飞虱唾液鞘基因定量ＰＣＲ检测的引物Ｔａｂｌｅ２㊀ＰｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｑＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｇｅｎｅｓｉｎｓｍａｌｌｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ检测基因㊀㊀㊀㊀引物(５ᶄң３ᶄ)肌球蛋白重链Ｆ:ＣＧＴＧＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＲ:ＴＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣ副肌球蛋白Ｆ:ＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＲ:ＣＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣ肌动蛋白相关蛋白１Ｆ:ＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＲ:ＡＧＧＴＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＧＴＣＡＣＧＡＴＰ合酶α亚基Ｆ:ＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＧＡＧＣＡＴＴＧＧＴＲ:ＣＡＡＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧ精氨酸激酶Ｆ:ＡＣＣＴＴＣＣＴＣＧＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＲ:ＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＡＴ原肌球蛋白￣１Ｆ:ＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＲ:ＡＣＣＧＡＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴ组蛋白Ｈ４Ｆ:ＴＣＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＧＡＡＡＣＲ:ＡＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＧＴＡＡＡＧＡＧ羧化酶/加氧酶大亚基Ｆ:ＡＴＧＡＧＴＧＴＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＧＡＲ:ＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＡＧＴ原肌球蛋白１Ｆ:ＴＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＲ:ＴＣＴＧＧＧＴＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴ延伸因子１￣αＦ:ＡＡＧＴＧＣＧＧＡＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＲ:ＴＡＣＴＴＧＧＣＣＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＡＴＰ合酶β亚基Ｆ:ＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＲ:ＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡ钙转运ＡＴＰ酶Ｆ:ＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＴＧＲ:ＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧ肌球蛋白调节轻链２Ｆ:ＧＣＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＲ:ＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣ碱性肌球蛋白轻链Ｆ:ＧＣＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＲ:ＡＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＴＡＧＧ组蛋白Ｈ２ＢＦ:ＴＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＧＣＴＣＧＡＣＲ:ＡＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴα￣肌动蛋白Ｆ:ＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＲ:ＧＣＣＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＴ肌动蛋白Ｆ:ＴＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＲ:ＴＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＧＧＡＣＴＴＡＤＰ/ＡＴＰ易位酶Ｆ:ＴＣＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＣＣＲ:ＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＴＣＣＴＣＴＧＴ微管蛋白β￣１链Ｆ:ＣＧＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＲ:ＡＴＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＡ延伸因子Ｆ:ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＲ:ＣＧＡＣＡＧＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡ㊀㊀水状唾液中的降解酶可以帮助昆虫体外消化㊁分解植物中的营养物质和抗性因子ꎮ本研究在唾液鞘中虽然未检测到相关的降解酶ꎬ但鉴定到一些与能量代谢相关的酶ꎬ比如ＡＤＰ/ＡＴＰ转移酶和５种ＡＴＰ合成酶ꎬ这在稻飞虱水状唾液㊁胶状唾液中也被检测到[５ꎬ１２]ꎬ其可能在植物中发挥了与消耗能量相关的功能ꎮ此外ꎬ还发现了肌球蛋白㊁原肌球蛋白㊁副肌球蛋白㊁微管蛋白㊁肌动蛋白等参与维持细胞功能的一些结构蛋白质ꎬ推测这些蛋白质可能与唾液鞘的形成有关ꎬ其在昆虫￣植物互作中的功能尚需进一步研究ꎮ灰飞虱唾液鞘蛋白质组分比较丰富ꎬ但仅有４个蛋白质含有信号肽ꎬ这与其他刺吸式口器昆虫唾液中大部分蛋白质不含信号肽类似ꎬ说明除了内质网￣高尔基体这一经典的分泌途径外ꎬ唾液蛋白质还有着其他非经典的分泌方式[１２]ꎮ不同的唾液鞘基因在灰飞虱各组织中的表达模式不尽相同ꎬ测定的１９个基因中ꎬ４２％的基因在唾液腺中的表达水平显著高于在其他组织中的表达量ꎬ这些蛋白质可能在唾液腺中合成ꎬ然后被分泌到寄主作物中ꎬ主要在保持唾液腺的生理功能㊁维持正常的取食行为或调控水稻防御过程中发挥重要作用ꎬ它们是潜在的效应子ꎮ唾液鞘蛋白质除了具有参与唾液鞘形成以及介导昆虫与植物互作的功能ꎬ还可能参与植物病毒的传播ꎮ普通的非虫接种方式很难使病毒感染植物ꎬ唾液作为植物￣病毒￣昆虫三者互作的关键因素ꎬ极可能是病毒侵染作物并且传播爆发的关键因子ꎮ水稻条纹病毒(ＲｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓꎬＲＳＶ)随着灰飞虱唾液进入到水稻中ꎬ最近研究发现唾液鞘蛋白质Ｍｕｃｉｎ与唾液鞘形成相关ꎬ通过影响灰飞虱的取食行为来干扰ＲＳＶ的水平传播ꎬ表明正常结构的唾液鞘对于刺吸式口器害虫水平传播植物病毒极为重要[１６]ꎮ由于唾液鞘蛋白质在植物￣病毒￣昆虫互作中的重要性及其功能的多样性ꎬ本研究鉴定到的４２种灰飞虱唾液鞘蛋白质是研究灰飞虱￣水稻￣病毒互作过程中的重要里程碑ꎮ深入研究这些蛋白质在帮助灰飞虱危害作物和传播病毒过程中的作用ꎬ一方面有利于明晰害虫￣病毒￣作物互作背后复杂的分子机制等基础科学问题ꎬ另一方面鉴定出的效应子以及与效应子互作的水稻抗虫因子ꎬ可以成为抗性育种㊁新型ＲＮＡｉ生物农药㊁高效防控的新靶标ꎬ这对于制定害虫可持续治理对策㊁研发新的绿色防控产品及技术ꎬ具有重要价值ꎮ参考文献:[１]㊀董玉妹ꎬ张美倩ꎬ沈㊀慧ꎬ等.植食性昆虫唾液效应子和激发子的研究进展[Ｊ].昆虫学报ꎬ２０２１ꎬ６４(８):９８２￣９９７.５３戚良轩等:灰飞虱唾液鞘形态及其蛋白质组分鉴定[２]㊀ＣＯＨＥＮＣＡ.Ｅｘｔｒａ￣ｏｒａｌｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｎｐｒｅｄａｃｅｏｕｓｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌａｒｔｈｒｏｐ￣ｏｄａ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ４０:８５￣１０３. [３]㊀ＪＩＲꎬＹＥＷＦꎬＣＨＥＮＨＤꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｅｎｄｏ￣β￣１ꎬ４￣ｇｌｕ￣ｃａｎａｓｅａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｅｎａｂｌｅｓｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｔｏｆｅｅｄｏｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ１７３:１９２０￣１９３２. [４]㊀ＨＵＡＮＧＨＪꎬＣＵＩＪＲꎬＸＩＡＸꎬｅｔａｌ.ＳａｌｉｖａｒｙＤＮａｓｅＩＩｆｒｏｍＬａｏ￣ｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｃｅ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１９ꎬ２２４(２):８６０￣８７４. [５]㊀ＦＵＪＭꎬＳＨＩＹꎬＷＡＮＧＬＨꎬｅｔａｌ.Ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｓａｌｉｖａｒｙｃａｌｍｏｄｕｌｉｎａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｆｏｒｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ１３:８４１３７８.[６]㊀ＴＩＡＮＴꎬＪＩＲꎬＦＵＪＭꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＬａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｈａｔｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓｄｅ￣ｆｅｎｓｅｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ７７(５):２２７２￣２２８１.[７]㊀ＹＥＷＦꎬＹＵＨＸꎬＪＩＡＮＹＫꎬｅｔａｌ.ＡｓａｌｉｖａｒｙＥＦ￣ｈａｎｄｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｆｏｒｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅ￣ｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７:４０４９８.[８]㊀ＪＩＲꎬＦＵＪＭꎬＳＨＩＹꎬｅｔａｌ.Ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎｆｒｏｍｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｏｒａｌｓｅｃｒｅｔｉｏｎａｃｔｓａｓａｎｏｖｅｌｅｆｆｅｃｔｏｒｔｏｉｍｐａｉｒｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０２１ꎬ２３２:８０２￣８１７.[９]㊀ＷＡＮＧＮꎬＺＨＡＯＰＺꎬＭＡＹＨꎬｅｔａｌ.ＡｗｈｉｔｅｆｌｙｅｆｆｅｃｔｏｒＢｓｐ９ｔａｒｇｅｔｓｈｏｓｔｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｇｕｌａｔｏｒＷＲＫＹ３３ｔｏｐｒｏｍｏｔｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ[Ｊ].ＰｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙＢꎬ２０１９ꎬ３７４(１７６７):２０１８０３１３[１０]ＸＵＨＸꎬＱＩＡＮＬＸꎬＷＡＮＧＸＷꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｅｆｆｅｃｔｏｒｅｎａ￣ｂｌｅｓｗｈｉｔｅｆｌｙｔｏｆｅｅｄｏｎｈｏｓｔｐｌａｎｔｓｂｙｅｌｉｃｉｔｉｎｇｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ￣ｓｉｇｎａ￣ｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓꎬ２０１９ꎬ１１６(２):４９０￣４９５.[１１]ＤＵＨꎬＸＵＨＸꎬＷＡＮＧＦꎬｅｔａｌ.Ａｒｍｅｔｆｒｏｍｗｈｉｔｅｆｌｙｓａｌｉｖａａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｏｒｔｏｓｕｐｐｒｅｓｓｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｓｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｏｂａｃｃｏｃｙｓｔａ￣ｔｉｎ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０２２ꎬ２３４(５):１８４８￣１８６２.[１２]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＩＵＣＷꎬＨＵＡＮＧＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓｓａｌｉｖａｒｙｐｒｏｔｅｏｍｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ１５:１８８３.[１３]ＳŌＧＡＷＡＫ.Ｔｈｅｒｉｃｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ:ｆｅｅｄｉｎｇｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｈｏｓｔｐｌａｎｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ２７(１):４９￣７３.[１４]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＩＵＣＷꎬＣＡＩＹＦꎬｅｔａｌ.Ａｓａｌｉｖａｒｙｓｈｅａｔｈｐｒｏｔｅｉｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｗｉｔｈｒｉｃｅｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６６:７７￣８７.[１５]ＳＨＡＮＧＧＵＡＮＸＸꎬＺＨＡＮＧＪꎬＬＩＵＢＦꎬｅｔａｌ.Ａｍｕｃｉｎ￣ｌｉｋｅｐｒｏ￣ｔｅｉｎｏｆｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｆｅｅｄｉｎｇａｎｄｉｎｄｕｃｅｓｉｍｍｕｎｉｔｙｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):５５２￣５６５. [１６]ＨＵＯＹꎬＺＨＡＯＪꎬＭＥＮＧＸＹꎬｅｔａｌ.Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓｓａｌｉｖａｍｕｃｉｎｅｎａｂｌｅｓｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｙｌｅｔｓｈｅａｔｈｅｓｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｉｔｓｆｅｅｄ￣ｉｎｇａｎｄｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ７８(８):３４９８￣３５０７.[１７]鞠佳菲ꎬ孙㊀洋ꎬ刘宝生ꎬ等.一种制备稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品的方法:ＺＬ２０１８１１５１４９２０.Ｘ[Ｐ].２０２１￣０６￣０１.[１８]ＨＵＡＮＧＨＪꎬＬＵＪＢꎬＬＩＱꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ/ｐｒｏ￣ｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓａｌｉｖａｒｙｇｌａｎｄａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄｓａｌｉｖａｉｎｔｈｒｅｅｐｌａｎ￣ｔｈｏｐｐｅｒｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓꎬ２０１８ꎬ１７２:２５￣３５.(责任编辑:陈海霞)６３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第１期。
MASCOT介绍与蛋白质鉴定
LC/ESI/MS/MS for Protein ID
Digested proteins
Waters CapLC pump
MASCOT results
MS/MS data processing and database searching
LC/MS/MS Peak List 範例 .pkl format
Database Example
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK TRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCN
web：5MB or 300 spectra in a single MS/MS search in-house： no limitation
2.Searching Databases:
web：adding databases is not available in-house：users can setup their own databases
MASCOT介紹與蛋白質鑑定 的實際應用
講員: 蔡沛倫 鎂陞科技股份有限公司 Mass Solutions Technology 時間: 2010年7月22日 地點: 台灣大學
蛋白質資料庫搜尋鑑定 (Mascot)
Mascot蛋白質鑑定的技術原理介紹 各項使用參數的意義及建議設定值 鑑定分析結果報告呈現 Mascot進階功能介紹 Mascot 2.3新增功能介紹
Protein modifications
Export search result
(word版)Mascot检索软件在蛋白质质谱鉴定中的应用
Mascot 打分算法是基于 MOWSE(MOlecular Weight Search)算法的改进。MOWSE 算法是基于非冗余蛋白质数据库 OWL 中肽分布频率及可能性的算法。通过采用基于可能性大小的打分算法能够提供一个直观的数值或者图形来评价一个 结果是否为显著值或是否可信。同时可以对不同的搜库方式及数据库检索的结果直接比较。
1
螺旋讲堂
第一部分：生物质谱简介
1.1 生物质谱的基本结构：
生物质谱仪一般由离子源(ion source)、质量分析器(mass analyzer)和检测器(detecter)三个部分组成。离子源的主要作用 是使蛋白或多肽变成带电离子，以便在电场中运动。电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)是最常用的两种 生物质谱离子源。起始于上世纪八十年代的这两项软电离技术解决了非 挥 发 性 和 热 不 稳 定 性 生 物 大 分 子 解 吸 离 子 化 的 问 题 ，使得分析蛋白质等生物大分子成为了可能，大大促进了质谱技术在生物学领域中的应用。发明这两项软电离技术 的科学家也同时于 2002 年获得诺贝尔化学奖。
1.2 生物质谱的基本类型：
由于质谱仪的三个部分是相对独立的，可以自由组合从而形成不同的质谱类型。目前的生物质谱仪大致可以根据其 离子源的不同分成两类，一类是基质辅助激光解吸电离（MALDI）离子源的质谱仪，该类离子源的质谱仪常和飞行时间 质谱分析器（TOF）结合使用，组合成 MALDI-TOF 一级质谱仪或者 MALDI-TOF-TOF 串联质谱仪。这种类型的质谱仪 的需要的样品为固态，具有仪器结构简单、扫描速度快、通量高等优点，但其分析结果的可靠性与样品的质量关系比较 密切。
博苑生物-Mascot质谱检索
生物质谱简介 ——蛋白质质谱鉴定基本流程
肽段混合物
一级质谱
二级质谱
蛋白
肽段分 子量
二级碎片 分子量
DNA/protein数据库
搜索软件
鉴定结果
生物质谱简介 ——蛋白质质谱检索常用软件
软件名称 软件类型 数据格式
Mascot
SEQUEST X!Tandem
商业软件 商业软件 免费开源软件
MGF、DTA RAW、 DTA DTA 、PKL、
采用基于可能性大小的打分算法能够提供一个直观的数值或 者图形来评价一个结果是否为显著值或是否可信。同时可以 对不同的搜库方式及数据库检索的结果直接比较
Mascot简介 ——打分算法
步骤
将数据库中的每一个蛋白按 10 kDa 大小归类 对于每一个蛋白质，将理论酶切产生的肽段按100Da大小作
Peptide tol. ±：肽段容差，主要以ppm和Da两种形 式，表示前体离子所测误差值的大小，其大小与仪器 类型相关， TOF等高分辨质谱可能在几个ppm到几十 个ppm之间，而离子阱质谱可能在0.5Da甚至更大
MS/MS tol. ±：表示二级质谱中碎片离子的质量误差 Monoisotopic or Average：一般选单同位素质量而不
原理：根据一个蛋白质酶切后的一组特异肽段分子量 信息进行比较从而进行蛋白鉴定
优点：是蛋白质鉴定的经典方法，算法简单，速度 快，在串联质谱鉴定出现之前应用广泛
缺点：质量相近的多肽增加匹配难度，并且无法实现 混合蛋白的鉴定，不太适合数据库不完整的物种的蛋 白质鉴定，不能分析到翻译后修饰位点
Mascot简介 ——部分序列比对
为一个字节进行归类（每个氨基酸的平均分子量接近100Da） 以每10kD蛋白间隔为单位，分别计算间隔内所有蛋白质酶
mascot 质谱
mascot 质谱
Mascot质谱是一种经典的蛋白鉴定数据库软件，也是常用的肽质量指纹图谱（PMF）检索工具，在质谱鉴定蛋白质中发挥重要作用。
蛋白肽段经质谱仪检测后获得质谱数据需要与理论数
据库中的数据进行比较和评价，才能将实验数据转换成具有生物学意义的结果。
利用Mascot软件进行检索时，需要根据样品及仪器的实际使用情况设置相应的检索参数以限制
检索范围。
检索参数主要包括检索的数据库Database、所使用的水解酶、未水解的酶切位点数、固定修饰、可变修饰、蛋白质分子质量上限以及肽分子质量误差范围等。
CN6 串联质谱法
肽键及其断裂
肽键断裂的说明
♨ CID中，肽键的断裂方式有非常多的可能 性。关于具体的断裂方式，可以去查询生 物化学方面的书籍。
♨ 通常，我们只考虑b系列和y系列。原因 是我们使用的电压较低，其他系列的离子 不易产生。
0.089
1.556 24.871 386.23 5958.36 92016.7 1418510
Database Searching
对于一张不完美的质谱图，有这么多的组 合可以生成之。但是，幸运的是，我们还有 这个蛋白序列数据库。 虽然组合有那么多，但是在这个数据库的 限制之下，组合数就大大的减少了。 所以我们可以从数据库里搜索最好的匹配 质谱图的多肽，这样就有了二级质谱的数据 库搜索算法。
二、串联质谱法（MS/MS）鉴定蛋白质技术 1.原理
20种氨基酸根据肽的氨基酸残基不同有多种排列方式 20n种，如三肽203种，四肽204种排列方式，出现频率为 1/160000 。5-6个氨基酸序列片段可决定蛋白的特异性 。 MS/MS可以检测到每一肽段的序列。根据一级质谱测 得的精确分子质量和MS/MS所得到的序列信息，结合蛋 白质数据库搜索，大大增加了蛋白质鉴定的准确性。
第三节 质谱前蛋白质或多肽 样品制备方法和关键步骤
一、质谱前的样品纯化、浓缩 Zip Tip是纯化、浓缩蛋白质和肽段的 理想工具。有关使用的详细说明，见网址： /ziptip
二、染色方法与质谱分析的兼容性
考马斯亮蓝染色法
微克级检测水平；具有
线形动力学范围，适合定量；易于使用且与质谱 分析的兼容性好。缺点是无法检测到低丰度蛋白
从健康人尿液筛选年龄相关蛋白质
基础医学与临床Basic & Clinical MedicinvApdi 2021VoV41 NeD2221年 4月 第41卷第4期文章编号：144)-6325(2421)44-4528氟5研究论文从健康人尿液筛选年龄相关蛋白质郑舒心、，赵敏迪4,邵 晨2孙海丹、，刘晓燕、，郭正光、，孙 伟、**收稿日期：2424W 、W4 修回日期：242、氟、表3基金项目：中国医学科学院医学科学创新基金(2417D2M-)909)* 通信作者(ccrresponding authoe ) : sunwei@ iSms.4111110.1X44/(1.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院药理系，北京140045；2.北京医院国家老年医学中心检验医学科，北京144732； 8.国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心北京生命组学研究所，北京142202)扌商要：目的筛选健康成人尿液中与年龄相关的差异表达蛋白质，探讨成人因年龄增长而发生的蛋白质改变。
方法选取2名健康男性及2名健康女性,按年龄各分为3组(24~ 34、44~ 53和M 64周岁)，用非标记定量蛋白质组学 技术进行尿液蛋白质组分析，筛选年龄相关尿液蛋白。
结果从男性尿液中共获得14个与年龄增长相关的尿蛋白，其中上调66个，下调34个。
从女性尿液中共获得94个与年龄增长相关尿蛋白，其中上调77个，下调15个。
获得男女共有的年龄增长相关尿蛋白1个。
蛋白功能分析显示,这些蛋白与凝血系统、蛋白泛素化.LXR/RXR 激活、糖酵解等通路相关。
结论尿液中存在与年龄增长相关的蛋白质，有可能成为衰老相关的尿液标志物，并为后续疾病生物标志物发现提供基础。
关键词：尿液蛋白质组学;个体差异;年龄中图分类号:R32文献标志码:AScreening aying related protein) in udnc from hea/hy adult)ZHENG SSuwin 1, ZHAO Mis-dO, SHAO Chen 7, SUN HaOdan 、，LIU XOe-ysn 、，GUO Zhepg-auang 1, SUN Wei 1 *(1. DepaPmeo) of Pharmacologp , Institute of Basic Medical Sciences CAMS , School of Basic Medicixc PUMC , BeijOg 120005 ；4. Depadmeo) of Lakoratop McdRixc , National Center of Gerontologp , BeijOg Hospital ,BeijOg 120736 ；3. Beijmg Institute of Lifeomics, National Centos for Protein Sciences (Beijmg),BeijOg Proteomc Research Ceotes, BeijOg 122226, Chixa)Abstrach : Objective To screen the diOerextial proteins related W aping in human udne and W find out the func-tioxal changes of proteins related te aping. M ethods Fondeen healthy men and 15 healthy women woo oplUdand divided them inte three gAups accorVing W their ages (22-36, 40-54 and over 66 years olU) . The diOerential proteins were screened Sy laXel-Zrev quanti/cahox and 2DLC-MS/MS. R csu IS s In male gAVp , there were 120 pre Wins di/erentially expres/d in three gAups ； 66 wca over-axpres/d and 34 wca under-axpres/d. In female gAnp , there were 94 proteins UPoo/XU expressed in three gAups, 77 were overexpressed and 15 were undo a x -pressed. Thera were 1 diPerextial expressed proteins related W aping in Soth male and female gAups. Thou protein pathways mainly fochsed on coagulation system , protein uUiqui/na/ox pathway , LXR RXR vhWxWn and lactoso UepraSatiox III, etc. Conclusions Proteins related te aping can Sv found in udne , which may Sv used as SiomarVers of aping and previding Seis far suUsepuext discaveA of iisoso SiomarVers.郑舒心从健康人尿液筛选年龄相关蛋白质529 Key words:uh/c proteomics;individual vaha/on;aging近年来，尿液逐渐成为寻找疾病标志物的重要来源⑴。
蛋白质组学技术及其在乳及乳制品中的应用研究进展
蛋白质组学技术及其在乳及乳制品中的应用研究进展摘要：蛋白质组学技术是近年来生命科学研究的重要工具，在食品，医学及动植物研究领域具有独特优势.利用蛋白质组学技术研究乳及乳制品，深入阐明其中蛋白质的表达及动态变化已成为当前的研究热点。
本文主要论述蛋白质组学的定义及蛋白质组学及其研究过程中的主要技术，进而提出在乳及乳制品中的应用研究。
关键词：蛋白质组学；乳；乳制品；应用引言：蛋白质组学工具可用于考察蛋白质的多样性.随着越来越多的细菌基因组网络资源的日益丰富，可以利用蛋白质组学技术来筛选各种发酵食品中的微生物所表达的蛋白质，提供全面而动态的研究。
1.蛋白质组学的定义在经过全世界科学家的共同努力下，人类基因组计划终于在2005年完成，同时还完成了十余种模式生物的全基因组序列的测定工作。
随着人类基因组计划的完成，科学家又进一步提出了后基因组计划即基因功能研究，而蛋白质组学研究就是后基因组计划中的一个重要组成。
研究表明，人类一共有24000个基因，但是蛋白质的种类却多达50000种，这就说明由基因控制的蛋白质的表达并不是一一对应的，并且生命体的生命活动的完成是由大量蛋白质相互作用共同完成的，这就给人们研究蛋白质的功能带来了巨大的困难。
事实上，人类基因组编码的蛋白质的功能有约一半是未知的，由此而知，对于基因功能的研究将是人们关注的重点。
2.蛋白质组学及其研究过程中的主要技术2.1 蛋白质的鉴定技术质谱（mass spectrum，MS）技术是目前最为常用的蛋白质鉴定技术，通过分析经特异性蛋白酶（如胰酶）水解后得到的肽段混合物，能够快速鉴定蛋白质组分，并准确测定肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列和翻译后的修饰物。
因色谱与质谱的高效性与准确性，两者联用已成为蛋白质组学研究的重要手段。
在蛋白质组学中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time offlight- mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和电喷雾离子化质谱（electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）是使用频率较高的质谱。
mascot质谱
mascot质谱
MASCOT（Matrix Science）是一种常用的蛋白质鉴定软件，用于分析和解释质谱数据。
它是基于数据库搜索的方法，将实验产生的质谱数据与预先构建的蛋白质数据库中的质谱图进行比对，以确定样品中存在的蛋白质。
MASCOT软件可以接受从不同类型的质谱仪器中获取的数据，例如液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）。
用户需要首先将实验产生的质谱数据导入MASCOT软件，并选择适当的蛋白质数据库进行搜索。
MASCOT会使用数据库中的蛋白质序列与质谱数据进行匹配，并计算匹配的得分来确定最可能的蛋白质身份。
MASCOT提供了丰富的功能，包括蛋白质定量、修饰位点鉴定、谱图过滤等。
它被广泛应用于蛋白质组学研究领域，用于确定复杂样品中的蛋白质组成，标识不同组织、细胞或生物体中蛋白质的差异表达，并研究蛋白质的翻译后修饰。
槟榔黄化病叶片差异表达蛋白筛选与鉴定
槟榔黄化病叶片差异表达蛋白筛选与鉴定曾莉娟;李涛;王健华;张雨良;刘志昕【摘要】以相同品种,树龄、长势一致的黄化病槟榔和健康槟榔叶片为试材,采用TCA(三氯乙酸),丙酮法制备蛋白质样品,结合双向电泳-质谱结合技术,分析病原菌-槟榔互作后差异表达蛋白.结果表明.双向电泳SDSPAGE胶中黄化病槟榔叶片与健康叶片平均蛋白质点数分别为1 081个和960个,其中差异明显的点34个.选择5个差异蛋白点进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,并进行数据库查询,结果鉴定了2个蛋白质,分别为核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶和蕈状支原体高同源蛋白,这些蛋白质可能参与了槟榔黄化病发生和发展过程.另外3个蛋白点在数据库中未检索到同源性和匹配率较高的蛋白质,认为是未知蛋白.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2010(031)008【总页数】5页(P1298-1302)【关键词】槟榔;槟榔黄化病;蛋白质;双向电泳【作者】曾莉娟;李涛;王健华;张雨良;刘志昕【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南,海口,571101;中国热带农业科学院科技信息研究所,海南,儋州,571737;海南大学环境与植物保护学院,海南,儋州,571737;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南,海口,571101【正文语种】中文【中图分类】S792槟榔（Areca catechu Linnaeus）是一种典型的热带经济作物和观赏作物。
在海南和台湾，槟榔分别是仅次于橡胶和水稻的第二大经济作物[1,2]。
槟榔黄化病是一种慢性病且没有有效的防治措施，自1914年首次报道以来，现已遍及大部分槟榔生产国主产区，造成槟榔大面积减产[3]。
串联质谱蛋白质鉴定的关键计算问题
第二类是基于串联质谱的。这类方法首先利用串联质谱技术(Tandem Mass Spectrometry, MS/MS)准确测定肽的氨基酸序列，再通过肽序列鉴定蛋白质的序列。所以，这种方法可以 用于鉴定复杂的蛋白质混合物或者验证肽质量指纹搜索的结果，是目前最常用最有效的主流 方法，下面加以详细介绍。
在典型的液相色谱-串联质谱联用实验中，蛋白质样品首先被蛋白酶水解得到多肽混合 物，然后通过液相色谱分离并被离子化。在质谱仪中，具有特定质量电荷比的肽离子被选择 过滤后，在某种能量轰击，比如碰撞诱导的裂解(Collision-Induced Dissociation，CID)[10]或电 子转运裂解(Electron Transfer Dissociation，ETD)[11]，作用下碎裂。在碎裂过程中，三种肽键 断裂能够生成主要六个系列的碎片，即 N-端的 a，b，c 碎片和 C-端的 x，y，z 碎片，如图 5 所示。碎片可能丢失一个中性的水或者氨分子[12]，保留了母离子电荷的碎片离子、没有碎
第一类是基于一级质谱的，称作肽质量指纹作图。这类方法搜索已知蛋白质数据库，用 指定的酶对蛋白质进行模拟水解，得到理论一级质谱。理论一级质谱与实验一级质谱进行比 较，结果按照匹配的程度排序。这样的系统有 MOWSE[5]，Mascot[6]，ProFound[7]，PeptIdent[8]， MS-Fit[9]等等。肽质量指纹作图适用于蛋白质样品包含一种蛋白质或简单的混合物的情况。 其缺点是由于蛋白质混合物和污染物、部分酶解、残基修饰（所谓氨基酸残基是指去掉一个 水分子的氨基酸）、质量精度等因素的影响，往往误差较大，导致搜索结果错误。
相对强度
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100(%)
图6. 串联质谱示例
质谱鉴定蛋白与成分的结合位点
质谱鉴定蛋白与成分的结合位点质谱技术是一种用于鉴定和表征复杂蛋白与小分子成分之间结合位点的强大工具。
质谱是一种基于分子质量-电荷比的分析技术，可以通过测量分子的质量和相对丰度来确定目标蛋白与成分之间的配对关系。
质谱鉴定蛋白与成分的结合位点的原理是利用蛋白质和成分之间的非共价相互作用，例如氢键、离子键、范德华力、疏水效应等。
通过这些相互作用，蛋白质可以与成分形成稳定的结合，并在质谱测量中保持这种稳定的配对关系。
质谱鉴定蛋白与成分的结合位点的方法通常涉及以下步骤：样品制备、蛋白-成分复合物的分离、质谱测量和数据分析。
下面将详细介绍这些步骤。
首先，样品制备是质谱鉴定蛋白与成分结合位点的关键步骤之一。
样品制备包括蛋白质的纯化和成分的提取。
蛋白质的纯化可以使用不同的方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
成分的提取可以使用有机溶剂、酸碱水溶液等。
在样品制备过程中，需要注意选择适当的条件以保持蛋白质与成分之间的结合。
其次，蛋白-成分复合物的分离是鉴定蛋白与成分结合位点的关键步骤之二。
蛋白-成分复合物的分离可以使用不同的方法，如凝胶电泳、液相层析、超滤等。
这些方法可以根据复合物的特性和大小选择合适的分离策略。
然后，质谱测量是鉴定蛋白与成分结合位点的关键步骤之三。
质谱测量可以使用不同的质谱仪器，如质谱-质谱（MS-MS）、飞行时间质谱（TOF-MS）、离子流动管质谱（Ion Mobility-MS）等。
这些仪器可以根据特定的实验要求选择合适的测量方法。
最后，数据分析是鉴定蛋白与成分结合位点的关键步骤之四。
数据分析包括质谱图的解析和蛋白与成分结合位点的确定。
质谱图的解析可以使用不同的软件和数据库，如Mascot、Sequest、ProteinProspector等。
这些软件和数据库可以通过与已知蛋白质和成分的比对，确定目标蛋白与成分结合的位点信息。
总结起来，质谱技术是一种强大的工具，可以鉴定复杂蛋白与成分结合的位点。
[.Mascot检索软件在蛋白质质谱鉴定中的应用(PPT)
目录
生物质谱简介 Mascot简介 应用实例
生物质谱简介 ——基本结构
离子源(ion source)：使蛋 白或多肽变成
带电离子
质量分析器 (mass analyzer)： 将离子源中形成 的离子按质荷比
大小分开
常见类型： A:电喷雾电离(ESI) B:基质辅助激光 解吸电离(MALDI)
Variable modfication：可变修饰，一般选择甲硫氨酸 氧化-Oxidation (M)，也可能存在N-乙酰化
对于一些有特殊化学处理修饰的氨基酸功能基团修 饰，可人为在本地数据库中进行配置。可变修饰选择 越多，检索速度越慢，而且易出现假阳性结果，需人 工确认存在修饰的结果
应用实例 ——检索输入
Mascot是一款强大的数据库检索软件，可以实现从质 谱数据到蛋白质的鉴定，其检索方式包括以下三种： Peptide Mass Fingerprint （肽指纹图谱检索） Sequence Query （部分序列比对） MS/MS Ion Search （串联质谱检索）
Mascot简介 ——肽指纹图谱鉴定
著差异值E=0.05，则对应与Mascot分数S=10*Log [(1/1.5 x 106)(0.05)]=74.7
说明：这个分数算法是PMF的分数算法，MS/MS ion search则采 用其它分数算法
Mascot简介 ——打分算法
分数高低取决于数据库的大小与设定的E值，对于特定 的数据库和E值(如E=0.05)，则可以算出S。一般用确定 的E值来设定对应的阈值分数。如下图，E=0.05，则阴 影内结果表示为小于阈值分数的不可信结果
应用实例 ——检索输入
maxquant 原理
MaxQuant是一种高通量蛋白质组学数据分析软件，它基于蛋白质组学实验数据，使用峰值信噪比（PSM）筛选方法，对蛋白质组进行定量和鉴定分析。
其基本原理如下：
1. 数据预处理：MaxQuant对原始的蛋白质组学实验数据进行预处理，包括去除低质量的肽段、去除内部重复的肽段、去除低丰度肽段、去除可能来自低丰度蛋白质的肽段等。
2. 峰值信噪比筛选：MaxQuant使用Peptide Shifter算法对预处理后的肽段进行峰值信噪比（PSM）筛选，通过对肽段的信噪比、RT值、质量等指标进行计算和比较，筛选出可能来自蛋白质的肽段。
3. 蛋白质定量：通过对筛选出的肽段进行质量控制、峰形分析、肽段匹配和定量计算等步骤，对蛋白质进行定量分析。
MaxQuant使用了多种算法对定量结果进行校正和优化，包括负向偏差校正、正则化、多重比较等。
4. 蛋白质鉴定：通过对定量后的蛋白质进行特征分析和聚类分析，鉴定不同的蛋白质。
MaxQuant使用了多种算法进行鉴定，包括XCorr、Mascot、ProteinPilot等。
5. 数据输出：MaxQuant最终输出包括蛋白质的数量、丰度、鉴定结果等信息的结果文件，以及可视化的蛋白质组图谱和蛋白质富集分析结果。
总之，MaxQuant的基本原理是基于蛋白质组学实验数据，采用峰值信噪比（PSM）筛选方法，对蛋白质进行定量和鉴定分析，最终输出蛋白质组学数据结果。
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Search Parameters database taxonomy enzyme missed cleavages fixed modifications variable modifications protein MW protein pI estimated mass measurement error
Database Example
>gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK TRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLE NYCN
web：5MB or 300 spectra in a single MS/MS search in-house： no limitation
2.Searching Databases:
web：adding databases is not available in-house：users can setup their own databases
Protein modifications
Export search result
For the publication guideline
What’s the difference between public web version and in-house version?
1.Query number:
3.Searches that sent simultaneous per user：
web：2 in-house：no limitation
4.Enzyme：
web：can’t perform “no enzyme” search in-house：no limitation
5.modifications：
MASCOT 網頁免費版: /search_form_select.html In House版: http://localhost/search_form_select.html
Protein Identification
Protein separation
MASCOT介紹與蛋白質鑑定 的實際應用
講員: 蔡沛倫 鎂陞科技股份有限公司 Mass Solutions Technology 時間: 2010年7月22日 地點: 台灣大學
蛋白質資料庫搜尋鑑定 (Mascot)
Mascot蛋白質鑑定的技術原理介紹 各項使用參數的意義及建議設定值 鑑定分析結果報告呈現 Mascot進階功能介紹 Mascot 2.3新增功能介紹
What is MASCOT ?
MASCOT是一套利用質譜的圖譜與資料庫序列進行比對來鑑定蛋白質 的軟體。 MASCOT提供的比對方式有以下三大類： 1. Peptide mass fingerprint 2. Sequence Query 3. MS/MS Ion search MASCOT預設可使用的資料庫如下： 1.MSDB 2.NCBInr 3.SwissProt 4.dbEST ( nucleic acid database) MASCOT提供使用者自建database比對的功能，方便使用者進行 recombinant protein searching。
Search Result
何時進行 error tolerance search? 當進行MS/MS Ions search時發現有許多MS/MS spectrum無 法比對到任何peptide，而且這些MS/MS spectrum的品質 很好時，可能的原因如下： 1.低估誤差值( e.g.質譜誤差過大時) 2.Precursor ion的 charge state判斷錯誤 3.使用的蛋白脢沒有特異性或不佳 4.未知的PTM或化學修飾 5.資料庫中不存在這些peptide序列 MASCOT error tolerance search功能則是針對後三點進行資 料庫比對。
False positive rate= no. of id. In decoy database search no. of id. In normal database search
Automated decoy database search
點選後可以看decoy database比對的結果
charge
intensity Fragment ion m/z m/z
LC/MS/MS Peak List 範例 .mgf format
intensity
Fragment ion m/z
Database search
Probability based search algorithm – Typically 95% confidence level is accepted
Each MSMS (each query number) has an individual corresponding table
Bold: the first time a particular match appears in the report Red: the first ranking peptide match appears
PTM: post-translational modification
Error tolerant search
Automated decoy database search 在龐大的資料比對中，使用randomized的database進行比 對，用以增加比對結果的可信度。 Reverse database search or Random database search
LC/ESI/MS/MS for Protein ID
Digested proteins
Waters CapLC pump
MASCOT results
MS/MS data processing and database searching
LC/MS/MS Peak List 範例 .pkl format
7.Security control： web：N/A in-house：administrator can config all user’s rights to use MASCOT in-house server, and search results handling
Mascot進階功能
Search Result
以這張結果為例，利用decoy database進 行比對分數達homology的false-postive rate為4.05%，比對分數達identity的falsepostive rate為0%
New features in Mascot 2.3
Protein Family Report Percolator Support Search Multiple Databases Export search results as mzIdentML Batch automate quantitation with Mascot Daemon Support for mzML format peak lists 64-bit executables for Windows Result report caching makes all large reports faster to load Support for Perl 5.10 Multiplex quantitation now supports isobaric precursors Reports now show counts of distinct sequences as well as counts of matched spectra ... and lots more
web：5 variable modification in-house：no limitation
What’s the difference between public web version and in-house version?
6.Quantitation:
web：can only use default quantitation methods, and can’t co-operate with MASCOT Distiller in-house： no limitation
>gi|1351907|sp|P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6) (BSA) MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYL QQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYG DMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYL YEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASS ARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCH GDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLP PLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATL EECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRY TRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHE KTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTE KQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPK LVVSTQTALA