DPPH自由基清除法
DPPH自由基清除法
100
DPPH Inhibition %
Trolox BHT Maቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnolol
80 60 40 20 0 0.000 0.004 0.008 0.012 0.016 Concentration mg/mL 0.020
A
NO2
方法大致与 1.4 相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行 数据后，都要重测一次 A0. [实验结果] 清除率（抑制率）的计算公式：
A A Inhibition % = 0 A0
100%
[实例]厚朴酚magnolol的DPPH清除率曲线：(图中Trolox和BHT为阳性对照组)
O2N N N O2N
当 DPPH 自由基被清除，其最大吸收波长 519nm 处的吸光度 A 值随之减小。DPPH 这种稳定的自由基 为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH 测试液的配制 取 DPPH 1mg 溶于约 20mL 溶剂（乙醇、95 乙醇或甲醇）中，超声 5min，充分振摇，务使上下各部分 均匀。取 1mL 该 DPPH 溶液，在 519nm 处测 A 值，使 A＝1.2-1.3 之间最佳。该 DPPH 溶液最好避光保存， 3.5 小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成 1mg/mL 浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选 95 乙醇或无水乙醇，如不溶可用 DMSO。 1.3 预试 取 DPPH 溶液 2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色 情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置 5 个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到 200μL 时，DPPH 溶液颜色基本褪去，则 100μL 为该样品液的最 大用量。其用量梯度宜设为 40、80、 120 、160、200μL。 1.4 测量 A0 值的测量：取 DPPH 溶液 2 mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加 95 乙醇（或无水乙醇）1mL，充 分混合，测 A 值（519nm），此 A 值为 A0（A0 多在 0.7-0.9 之间）。 A 值的测量：取 DPPH 溶液 2mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液 xμL （x 是根据 1.3 预试 结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95 乙醇（或无水乙醇），混合，静置 30 分钟后，测 A 值 （519nm）。如：某样品的用量梯度为 40、80、 120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 样品液 40μL 80μL 1200μL 160μL 200μL 1.5 正式测量 95乙醇（或无水乙醇） 960μL 920μL 880μL 840μL 800μL 加样表 DPPH测试液 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 总体积 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定是评估物质抗氧化能力的重要方法，常用于食品、药物和化妆品等领域。
下面将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH(2,2-二苯基-1-苦味肼)是一种常用的抗氧化剂，它能采用紫色的自由基形式存在，并且在反应中会转变为无色的稳定形式。
DPPH自由基清除法是一种简单而直观的测定方法。
该方法的基本原理是将待测物添加到预先溶解的DPPH中，反应一段时间后，根据颜色变化程度来评估抗氧化活性。
通过测量样品溶液吸光度的降低来计算其清除率，清除率越高，抗氧化能力越强。
二、FRAP法FRAP(铁还原能力)法是一种评估抗氧化物质电子给予能力的方法。
抗氧化物质能够通过给予电子来中和自由基的电子，从而保护细胞免受氧化损伤。
FRAP法通过反应产生的铁（II）络合物的吸光度变化来评估样品的抗氧化能力。
具体操作中，将待测物加入到铁（III）试剂（通常为铁(III)氯化物）中，待反应一定时间后，读取吸光度。
样品的抗氧化能力可以通过吸光度的变化来计算。
三、TBARS法TBARS(硫代巴比妥酸反应物)法是一种评估脂质过氧化的方法。
脂质过氧化是一种自由基引起的反应，会导致脂质的氧化和脂质分解产生不稳定化合物。
TBARS法主要用于评估食品和药物等样品中脂质过氧化的程度。
该方法通过将待测样品与反应试剂（如硫代巴比妥酸）反应生成稳定的色素产物，然后测量这种产物的吸光度来评估脂质过氧化的程度。
吸光度越高，脂质过氧化程度越高。
综上所述，DPPH自由基清除法、FRAP法和TBARS法是常用的抗氧化活性测定方法。
每种方法都有其独特的原理和应用范围，选择适合的方法可以准确评估样品的抗氧化能力。
在实际应用中，可以根据实验需求选择合适的方法，或结合多种方法综合评估抗氧化活性。
清除DPPH自由基能力检测方法
清除DPPH自由基能力检测方法清除DPPH自由基能力是用来评价化合物在体外是否具有抗氧化活性的一种常用方法。
DPPH自由基是一种常用的自由基模型，其具有紫色，可通过其吸收峰的变化来反映清除能力。
以下是常用的几种用于检测清除DPPH自由基能力的方法：1.分光光度法分光光度法是一种常用的检测方法，基本原理是通过测量化合物与DPPH反应后的溶液吸光度的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）准备1mM的DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物按一定浓度体系添加到相应的试管中。
3）将相同体积的DPPH溶液加入到每个试管中，混匀。
4）放置在室温下，静置反应30分钟。
5）使用紫外可见分光光度计测量反应体系的吸光度，计算清除率。
2.电子顺磁共振法（EPR）电子顺磁共振法是另一种常用的方法，通过测量化合物对DPPH自由基的清除能力，进而评估其抗氧化活性。
实验过程如下：1）准备含有DPPH和待测化合物的溶液。
2）使用电子顺磁共振仪测量样品的EPR信号，同时测量含有DPPH和不含DPPH的样品作为参比。
3）通过比较样品与参比的EPR信号来计算清除率。
3.原子力显微镜方法（AFM）原子力显微镜方法是一种非常灵敏的方法，可以用于直接观察化合物对DPPH自由基的清除作用。
实验过程如下：1）制备DPPH自由基薄膜。
2）将待测化合物沉积到DPPH自由基薄膜上。
3）使用原子力显微镜观察样品的表面形态变化。
4）通过观察DPPH颜色的变化和表面形态的变化来评估清除率。
4.荧光法荧光法是一种快速、灵敏且简便的检测方法，利用化合物与DPPH反应后荧光上转换的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）制备DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物与DPPH溶液混合。
3）使用荧光光谱仪测量样品的荧光强度的变化。
4）通过荧光强度的变化来计算清除率。
总结：以上所述是几种常用于检测清除DPPH自由基能力的方法，分别基于吸光度、EPR、AFM和荧光等原理。
DPPH自由基清除与普用自由基清除实验（水溶液）-实验流程图-操作..
DPPH·自由基清除法(修改版)李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.6）【原理】1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, 简称为DPPH·自由基。
由于分子中存在大π键，所以，该自由基能稳定存在。
且在519nm处，有最大吸收波长。
当DPPH·自由基被清除时，其在519nm处的吸光度（A519nm），会相应地减少。
因此，通过检测A519nm值，可以判断DPPH·是否被清除。
如果某个样品能清除DPPH·，就具有一定的自由基清除活性（或称“抗氧化活性”）。
【操作图解】【计算公式】【说明】1. 样品溶液的浓度，也是可以调整的。
不过，为了方便实验，宜配高浓度（如3mg/mL）。
2. 操作图解中的用量，都是可以调整的，需要自行摸索。
3. 当样品溶液的加入量为0 μL 时，所测得的A值即为A0。
4. 实验最好做三个平行样，以减少误差。
【实例】二氢杨梅素的DPPH清除实验的结果二氢杨梅素样品：浓度：0.1mg/ml 溶剂：95%乙醇数据整理：二氢杨梅素原始数据：水溶液中“普用”自由基清除的实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。
它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。
这比DPPH自由基清除实验更合理；因为DPPH自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。
2024DPPH清除自由基方法
2024DPPH清除自由基方法2024年，一种新的清除自由基的方法被引入，该方法使用DPPH试剂。
DPPH（1,1-二苯基-2-三甲基-苦基-2-脒基），是一种广泛应用于生物医学研究中的人工氧化剂。
DPPH试剂呈紫色，并且可与捕获自由基反应后转变成无色。
因此，通过测量DPPH试剂的颜色变化，可以评估抗氧化物质对自由基的清除能力。
DPPH清除自由基方法是一种简单、快速且经济的方法。
它适用于各种类型的样品，包括天然产物、食品、药物和化妆品。
使用DPPH试剂测定抗氧化能力的方法主要有两种：溶液试剂法和固相试剂法。
溶液试剂法是最常用的DPPH清除自由基方法之一、在这种方法中，首先将DPPH试剂以适当浓度溶解在溶剂中，通常使用甲醇或乙醇。
然后，将样品与DPPH溶液混合，反应一定时间。
在反应过程中，DPPH试剂将与样品中的抗氧化物质反应，使DPPH试剂转变为无色。
通过测量反应溶液的吸收光谱或测定其吸光度的变化，可以计算出样品的清除自由基能力。
固相试剂法是一种近年来发展起来的新方法。
在这种方法中，固定DPPH试剂在固相载体上，通常使用硅胶或其他吸附剂。
样品溶液被滴加到载体上，自由基会与固相DPPH试剂发生反应，并转变成无色。
然后，通过测量吸附剂的颜色变化或对比吸附剂的吸光度，可以确定样品的清除自由基能力。
DPPH清除自由基方法的优点之一是它不需要复杂的仪器设备，因此可以应用于各种实验室条件。
此外，DPPH试剂的制备相对简单，价格也相对较低。
这使得DPPH清除自由基方法成为研究抗氧化剂的吸引人选择。
然而，DPPH清除自由基方法也存在一些限制。
首先，DPPH试剂只能评估清除自由基的能力，而不能提供有关抗氧化物质的详细信息。
此外，该方法不能区分不同类型的自由基，因此不能用于研究具体自由基类型的清除能力。
最后，溶液试剂法和固相试剂法都需要一定时间的反应才能得到准确的结果，这可能会造成实验中的误差。
总的来说，DPPH清除自由基方法是一种简单有效的方法，用于评估样品的抗氧化能力。
抗氧化活性测定方法
抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。
抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。
本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。
通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。
实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。
实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。
2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。
3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。
4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。
三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。
该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。
实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。
不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是评估化合物或材料抗氧化性能的一种重要手段。
随着抗氧化活性的研究日益深入，目前已经发展出很多种测定方法。
以下将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法、Fe2+/Fe3+还原能力法和ABTS自由基清除法。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色的自由基，常用于评估化合物或材料的抗氧化活性。
该方法基于DPPH自由基与抗氧化物质发生反应后，颜色由紫色变为淡黄色或无色。
测定方法简单，操作方便。
其原理是待测样品与DPPH混合后，通过电子或氢的转移反应，DPPH自由基将被清除，溶液颜色由紫色转变为淡黄色。
根据吸光度变化可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
2.Fe2+/Fe3+还原能力法：该方法基于还原能力测定抗氧化物质对Fe3+离子的还原能力。
常用的试剂是FeCl3溶液和TPTZ（2,4,6-三聚吡啶甲酸）、酸性pH缓冲液。
其原理是待测样品能够还原Fe3+离子为Fe2+离子，Fe2+离子与TPTZ反应生成有颜色的络合物，通过分光光度计测定络合物的吸光度变化，进而计算出还原能力。
较高的吸光度变化表示较高的抗氧化活性。
3.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)）自由基是一种蓝绿色自由基，其浓度在紫外可见光区域有最大吸收。
该方法基于ABTS自由基清除率来评估抗氧化物质的抗氧化活性。
该方法较DPPH法和还原能力法更为灵敏。
其原理是待测样品与ABTS自由基反应后，ABTS自由基将被清除，溶液颜色由蓝绿色变为无色或浅黄色。
通过测定吸光度的变化，可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
除了上述常用的抗氧化活性测定方法外，还有很多其它方法也被广泛应用于抗氧化活性的评估，如氧化还原测定法、Fenton反应法、还原剂抑制能力法等。
每一种测定方法都有其独特的原理和适用范围，研究人员可以根据具体的研究目的和样品性质选择合适的测定方法。
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。
同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。
4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
2、ABTS 自由基清除实验20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。
加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。
ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3、超氧阴离子清除实验采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
DPPH自由基清除实验教学(详细版)
DPPH实验步骤一、原理：DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。
作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获("清除")其他的自由基。
因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。
由于DPPH自由基在以520nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。
有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。
此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。
二、实验步骤：1.配制0.1mM的DPPH溶液：配两次，每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇，避光保存。
2.配制0.5mg/mL的Vc溶液，至少2mL（设为阳性对照，选择性做）3.配制一定浓度的样品溶液，至少2mL母液（也可以配制不同溶度梯度样品，计算IC50）4.上板（避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测吸光度）96孔板，三组，每组设3个复孔，每孔加入量及96孔板分布如下：sample（样品组）：样品溶液100uL+ DPPH醇溶液100uL (每个浓度3个孔)blank（空白组）：样品溶液100uL+无水乙醇100uL （每个浓度3个孔）control（对照组）：DPPH 醇溶液100uL+水100uL （一块板可共用一个对照组,3个孔）样品VC浓度 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 sampleblankcontrol5.检测并计算清除率测517nm处的吸光度，取平均値，计算每个浓度的DPPH清除率，做出折线图。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。
目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。
以下将对这三种方法进行详细介绍。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。
可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。
吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。
2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。
ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。
测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。
吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。
3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。
在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。
浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。
这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。
DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。
因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。
dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican Li
dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-
Xican Li
dpph自由基清除实验:实验流程图2017.10
【前言】DPPH自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在519 nm范围有最大吸收峰。
其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个成单电子。
NO2
NOON22
NH
.N
DPPH自由基结构式 DPPH自由基模型图
当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H分子，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。
清除DPPH自由基是DPPH法的根据，当DPPH自由基与抗氧化剂反应后，519nm波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子(抗氧化剂清除自由基活性)呈定量关系，反应进程很容易通过分光光度计测定。
【文献】Jing Lin, Xican Li, Li Chen, Weizhao Lu, Xianwen Chen, Lu Han, Dongfeng Chen. Protective effect against hydroxyl radical-induced DNA damage and antioxidant mechanism of
[6]-gingerol: A Chemical Study. Bulletin of the Korean Chemical Society, 2014, 35(6), 1633-1638.
【实验流程图】
1
2。
体外抗氧化实验方案
体外抗氧化实验方案一、DPPH自由基清除法[原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
ON2NONN2NO2当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。
DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
1.2 样品液的配制 Vc溶液(0.25mg/ml)称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液1.3 预试取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。
其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、200μL。
浓度梯度mg/ml为0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400μg/ml 2.5、5、 10、20、401.4 测量A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。
0 A值的测量:取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。
抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法是一种用于测试物质对氧气自由基、过氧化物和其他氧化性物质的抵抗能力的方法。
以下是常见的抗氧化性测定方法：
1. DPPH自由基清除法：使用一种紫色自由基DPPH，通过测定反应前后DPPH 吸收峰的差异来评估样品的自由基清除能力。
2. ABTS自由基清除法：使用一种蓝色自由基ABTS，通过ABTS的光谱变化来衡量样品对自由基的清除能力。
3. ORAC法：利用ORAC反应器测量被测样品对氧化过程中产生的自由基的清除能力。
4. FRAP法：利用FRAP反应器测量被测样品对铁离子的还原能力。
5. TAC法：通过测量总抗氧化能力评价样品的抗氧化能力。
6. 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定法：利用SOD对超氧化物的清除作用来评估物质的抗氧化能力。
以上方法中，DPPH和ABTS自由基清除法是较常用的评估抗氧化性的方法。
抗氧化性是很多食品和保健品评估其品质和功效的重要指标，因此，准确测定物质
的抗氧化性对于推广新产品、提高产品质量和开发功能性食品有着重要意义。
DPPH自由基清除法以阿魏酸为例
DPPH法测定抗氧化原理—以阿魏酸为例【基本原理】根据文献[1]可知，DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种在体外较为稳定的氮自由基，其结构式如图所示。
图1.DPPH结构式此自由基在519nm处有着最大吸收，其溶液显紫色。
随着自由基被清除，其溶液在519nm 处的吸光度会减少，颜色变浅，所以可用这一特性来测定自由基清除剂的清除自由基能力。
DPPH分子模型如图2.图2.DPPH 分子模型【实例】我们选取了阿魏酸作为实例。
阿魏酸（Ferulic acid），学名“3-甲氧基-4-羟基肉桂酸”，分子式为C10H10O4，是桂皮酸（又称肉桂酸，3苯基2丙烯酸，分子结构）的衍生物之一，最初在植物的种子和叶子中发现，是一种广泛存在于植物中的酚酸，在细胞壁中与多糖和蛋白质结合成为细胞壁的骨架。
它的结构式如下。
阿魏酸作为酚酸类化合物具有良好的抗氧化活性，能够与DPPH发生供氢反应，清除DPPH自由基，具有良好的清除自由基能力。
图3.阿魏酸结构式图4.阿魏酸分子结构【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿；。
2.试剂阿魏酸（AR）、DPPH（AR）、无水乙醇（AR）；【实验操作】清除DPPH能力检测本实验采用文献[1]的方法，并视情况改动。
大致过程如下测定A0值：取DPPH溶液100μL 加至小试管中，加95%乙醇50μL，稀释混合，测A519nm值，此A值为A0（A0多在0.8-0.9之间）。
测定A值：取DPPH溶液100μL 加至小试管中，加阿魏酸溶液（0.0005mol/L）xμL（x为5、10、15、20、25、30、35、40），补加95%乙醇（50 –x）μL，混合，静置30min后，测A519nm值。
抗氧化活性测定方法的比较
抗氧化活性测定方法的比较1.DPPH自由基清除法：DPPH是一种紫色自由基，具有很强的吸收特性。
该方法通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
这种方法简单、快速，广泛用于抗氧化活性的初步筛选。
但是该方法只能反映样品对一种自由基的清除能力，不能全面评估其抗氧化性能。
2.ABTS自由基清除法：ABTS是一种蓝色自由基，其吸收波长与DPPH不同，具有更广的吸收范围。
该方法通过测定样品对ABTS自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
与DPPH法相比，ABTS法可以更全面地评估样品的抗氧化性能。
但是该方法需要较长时间才能得到准确结果。
3.过氧化氢清除法：该方法通过测定样品对过氧化氢的清除能力来评估其抗氧化活性。
过氧化氢是一种常见的氧化剂，可以导致细胞损伤。
该方法简单、快速，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是过氧化氢法只能评估样品对过氧化氢的清除能力，不能反映其对其他自由基的清除能力。
4.铁离子还原能力法：该方法通过测定样品对Fe3+的还原能力来评估其抗氧化活性。
Fe3+是一种常见的氧化剂，可以与还原剂发生反应，形成Fe2+。
该方法简单、快速，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是铁离子还原能力法只能评估样品对Fe3+的还原能力，不能全面评估其抗氧化性能。
5.脂质过氧化抑制能力法：该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力来评估其抗氧化活性。
脂质过氧化是一种常见的氧化反应，可以导致脂质的氧化损伤。
该方法能够全面评估样品的抗氧化性能，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是该方法操作繁琐，需要较长时间才能得到准确结果。
总体来说，不同的抗氧化活性测定方法各有优劣。
在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法进行测定。
此外，多种方法的综合比较可以更全面地评估样品的抗氧化性能。
氮自由基(DPPH)清除
一．实验原理：DPPH（11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即11-二苯基-2-苦基肼基自由基，DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，有一个单电子，在517nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收会消失褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比。
即反应物清除氮自由基的能力与试剂在517nm的吸光值成反比。
二．实验仪器：分光光度计三．实验试剂：试剂一：DPPH试剂1mL×1瓶试剂二：100μg/mL 维生素C标准溶液 20mL×1瓶四．溶液配制：试剂一：37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加入100ml 95%乙醇或无水乙醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。
注意：溶解一定要充分，如有条件可采用超声波助溶。
试剂二应用液：根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制方法。
1. 如仅需要将维生素C作为质控品，可取100μL 试剂二，加入900μL样品稀释液，充分混匀；2. 如需测定维生素C的IC50，可分别移取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0mL 试剂二于空离心管中，再依次加入10.0，9.5，9.0，8.5，8，7.5，7.0，6.0，5.0ml样品稀释液，充分混匀。
配制成0，5，10，15，20，25，30，40，50 μg/mL 维生素C样品。
五．实验步骤:六．清除能力计算：氮(DPPH)自由基清除清除能力(%)=[空白孔吸光值-(测定孔吸光值-对照孔吸光值)]/空白孔吸光值*100%七．注意事项：1. 如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；2. 如不确定样品的氮自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
dpph自由基清除实验
DPPH自由基清除实验引言自由基是一类具有不成对电子的化学物质，它们高度活跃且能够引发细胞氧化损伤。
因此，寻找有效的抗氧化剂来清除自由基对细胞和健康的影响至关重要。
DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼）是一种常用的化学试剂，被广泛用于评估抗氧化剂的活性。
本实验旨在使用DPPH自由基清除实验来评估抗氧化剂的抗氧化性能。
实验步骤1.准备实验样品，可以选择不同的抗氧化剂，如维生素C、维生素E等。
2.准备DPPH溶液，将适量的DPPH溶解在乙醇中，摇匀使其充分溶解，最后得到0.1 mM的DPPH溶液。
3.取一定量的DPPH溶液（如2 mL），加入试管中。
4.分别将不同浓度的抗氧化剂溶液（如0.1 mM，0.2mM，0.3 mM等）加入不同的试管中。
5.快速摇匀试管，使DPPH和抗氧化剂充分接触。
6.将试管放置在室温下静置15分钟，使反应充分进行。
7.使用分光光度计测定每个试管中溶液的吸光度，记录下数值。
数据处理1.计算抗氧化剂的清除率，清除率的计算公式为：（A₀ - A₁）/ A₀ × 100%。
其中，A₀为对照组（只有DPPH 溶液）的吸光度，A₁为实验组的吸光度。
2.绘制抗氧化剂浓度与清除率之间的曲线图，以展示不同浓度下清除率的变化趋势。
结果与讨论根据实验数据绘制的曲线图，可以看出抗氧化剂的清除率随着浓度的增加而增加。
这说明抗氧化剂对DPPH自由基具有较好的清除能力。
其中，浓度为0.3 mM的抗氧化剂表现出最大的清除率，清除率超过90%。
而浓度较低的抗氧化剂，如0.1 mM的清除率较低，仅为50%左右。
通过本实验可以初步评估抗氧化剂的抗氧化性能。
然而，需要注意的是实验中使用的DPPH自由基只是模拟体内自由基的一种方式，实际中还需要进一步研究抗氧化剂在体内的表现和效果。
结论本实验使用DPPH自由基清除实验评估了不同浓度抗氧化剂的抗氧化性能。
结果表明抗氧化剂的清除率随浓度的增加而增加，0.3 mM浓度的抗氧化剂表现出最佳的清除能力。
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DPPH自由基清除法
李熙灿/Xican Li
（广州中医药大学）
[文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140.
[原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
N
2
2
当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。
DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]
1.1 DPPH测试液的配制
取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
1.2 样品液的配制
样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试
取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。
其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。
1.4测量
A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。
A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。
如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下：
表1 加样表
1.5 正式测量
方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。
而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A 0.
[实验结果]
清除率（抑制率）的计算公式：
-⨯00
% = 100%A A Inhibition A [实例]厚朴酚magnolol 的DPPH 清除率曲线：(图中Trolox 和BHT 为阳性对照组)
D P P H I n h i b i t i o n %Concentration mg/mL
广州陶粒，广州陶粒厂 J6RCRDk223NV。