核酸化学

人体游离循环DNA的研究进展摘要：循环DNA 是近些年发现的生物标志物。

健康人含有微量的循环DNA，疾病状态下其含量有不同程度的升高。

尽管目前循环DNA 的来源尚无定论，但它在临床应用方面的研究已广受关注。

通过监测循环DNA 总水平变化及相关肿瘤基因的异常改变，可以实现恶性肿瘤的早期诊断、疗效监测及预后评估；产前疾病的监测与筛查；以及其他一些疾病的病情监测等。

关键词：循环D N A ；临床应用；恶性肿瘤；产前诊断正文：游离循环核酸(Free circulating nucleic acids)是一种存在于动植物和人的体液中的细胞外游离状态核酸。

目前已经在血浆、血清、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、唾液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液及粪便中检测到了游离循环核酸。

已发现的游离循环核酸包括游离循环DNA 和游离循环RNA。

循环DNA是存在于外周血、滑膜液等体液中的细胞外DNA，亦称游离DNA。

循环DNA 由双链DNA、单链DNA及其混合物组成，其存在形式有两种：游离DNA和DNA-蛋白质复合物。

人循环DNA和基因组DNA在核苷酸及碱基组成上基本一致，与机体生理和病理状态密不可分，近年来, 随着对游离循环核酸研究的不断深入, 特别是游离循环DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产前诊断和肿瘤研究中取得众多进展。

为此，本文将对循环DNA 在临床应用中的研究进展作一综述，并对其来源作简单介绍。

1循环DNA的来源虽然目前人们对循环DNA真正的来源仍未达成共识，但已有研究表明健康人和恶性肿瘤患者循环DNA在量和质上均有区别，且来源不同。

Suzuki等[1]发现健康人中循环DNA 水平非常低，仅有3.6~5.0ng/ml，而且其片段大多小于180 bop。

小于180 bop的循环DNA 片段多数是在经历凋亡诱导的细胞培养液中发现，而大于10,000 bop的多数是在经历坏死诱导的培养液中发现，这与Suzuki等的研究结果相吻合，表明正常人循环DNA主要来源于凋亡细胞。

恶性肿瘤患者的循环DNA水平明显增加，其来源也较健康人更为复杂，到目前虽仍无定论，但是有几种观点颇具代表性。

(1)来自肿瘤细胞的坏死和/或凋亡。

Jar等[2]诱导了小鼠肝细胞的坏死和凋亡，分析其细胞培养液中的循环DNA片段，并与恶性肿瘤患者的相比较，发现二者特征相同；Deliverer等[3]将循环DNA电泳，发现有凋亡细胞所特有的“梯形”条带。

(2)来自肿瘤细胞或微转移灶裂解，即进入外周循环的肿瘤细胞或者微转移灶细胞裂解释放DNA，但Ran等[4]却认为血浆中没有足够的肿瘤细胞能够产生如此高水平的循环DNA。

(3)来自肿瘤细胞自发释放。

Cheng等[5]动态监测恶性肿瘤放疗患者循环DNA，发现在放疗后两周内循环DNA水平明显上升，之后稳定下降，这提示随着肿瘤细胞的减少，其释放的循环DNA也逐渐减少。

关于循环DNA的来源，上述观点都有存在的可能，但具体以哪一种为主，可能和患者所处的疾病状态以及患者的自身免疫状况有关，需要进一步的研究去证实。

2游离循环DNA的生物学性质1947年, Mendel和Metals[6]使用高氯酸沉淀的方法在人血浆和血清中检测出DNA, 但这一发现随后逐渐被人们所淡忘。

直到20 世纪60 年代, 人们在系统性红斑狼疮的患者体内发现高水平的游离循环DNA[7], 才逐渐重新重视当初Mandel 和Metals的发现。

人们又在风湿性关节炎、肾小球肾炎、胰腺炎、炎症性肠病、肝炎和癌症患者体内检测到了高水平的游离循环DNA[8, 9]。

游离循环DNA具有DNA双螺旋结构[10], 不能被Raze 和链霉蛋白酶切割, 但是它可以被DanesⅠ消化。

经电镜和蔗糖梯度沉淀分析, 游离循环DNA的分子大小在500 bp~30 kb 之间。

游离循环DNA部分以复合体的形式存在或者通过蛋白质结合在细胞表面, 但是人们目前还没有对复合体进行研究。

3循环DNA的临床应用随着对循环DNA基础研究的深入，其在临床应用方面的研究也越来越多，包括循环DNA总水平的变化、循环DNA各种基因性质的变化，如微卫星改变、基因甲基化改变、基因突变等。

这些研究均希望将循环DNA应用到临床工作中，如恶性肿瘤的早期诊断、疗效监测及预后评估，产前诊断等。

3.1在恶性肿瘤中的应用恶性肿瘤的发生与各种基因改变密切相关，随着对循环DNA及肿瘤相关基因改变的深入研究，发现循环DNA在恶性肿瘤的临床应用，包括从早期诊断、疗效监测到预后评估的全过程均有重要意义。

3.1.1 早期诊断早期诊断对恶性肿瘤患者的治疗和预后意义重大。

Suzy等[11]对非小细胞肺癌患者和健康人循环DNA分别进行定量检测，发现健康人循环DNA平均浓度只有18 nag/ml，而Ian 期和IBM期患者已分别达到320 nag/ml和344 nag/ml，可见循环DNA在恶性肿瘤早期就已经升高。

Flaming等[12]研究大肠癌患者循环DNA水平发现：其在A期(Dukes分期)就明显上升，以12.5 nag/ml为界限，其诊断大肠癌的敏感度和特异性分别为81.3%和73.3%。

此外，Robert等[13]对不同分期的大肠癌患者和正常人循环DNA中SEPT9基因甲基化进行研究，结果I/II期大肠癌患者循环甲基化SEPT9的检出率为62%，对不同分期患者检出的敏感度和特异性分别为72%和90%，这提示循环SEPT9甲基化对大肠癌患者的早期诊断有重要意义。

3.1.2 疗效监测监测恶性肿瘤病人的治疗效果有利于进行个体化治疗。

Gatchis等[14]采用实时荧光定量PCR技术对非小细胞肺癌患者化疗前后的循环DNA进行检测，发现化疗后病情稳定或者缓解的患者循环DNA浓度与治疗前相比有所下降，而病情恶化者有所升高。

在儿童神经母细胞瘤治疗过程中，N-my基因扩增情况是评价患儿预后以及化疗疗效的一个重要指标，但是有些患儿N-my 基因扩增阴性。

Yogi等[15]对N-my基因扩增阴性患儿的DCR2基因甲基化状态进行研究，通过检测DCR2甲基化特异性序列(M)和DCR2启动子区域参考序列(R)，用M/R评估DCR2的甲基化状态，发现化疗后完全缓解的患儿循环DCR2的M/R明显下降，而缓解后又复发的患儿该比值明显上升。

这表明循环DCR2的甲基化水平可用于神经母细胞瘤，尤其是N-my基因扩增阴性的患儿化疗后的疗效监测。

3.1.3 评估预后良好的预后指标有助于正确评估患者的预后，及时调整治疗方案，帮助患者提高生存质量。

Bastian等[16]检测了192名接受根治性前列腺癌切除术患者的循环DNA水平，发现存在对预后不利因素，如Gleason评分较高、临床分期较晚、前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)水平较高等的患者，其循环DNA水平明显升高，同时还发现复发患者的循环DNA平均浓度为13.7±34.1 nag/ml，而无复发患者仅为3.8±33.6 nag/ml，这说明循环DNA 对前列腺癌患者的预后评估非常重要。

循环DNA总水平及其肿瘤相关基因的异常改变贯穿于恶性肿瘤的早期诊断，疗效监测，预后评估的全过程。

3.2在产前疾病监测与筛查中的应用目前产前诊断越来越受国家和个人的关注。

传统的产前诊断方法包括羊膜腔穿刺、绒毛活检等，但是很多孕妇不能接受，因为这些方法创伤较大，还有致流产的危险。

循环DNA 的应用将有可能改变这一局面。

孕妇循环DNA 包括母体和胎儿两个来源的DNA。

Birch等[17]通过对活产男性胎儿的孕妇进行产前循环胎儿DNA特异性Y染色体基因检查，以99%的敏感度和100%的特异性鉴别出男性胎儿。

同时对孕妇总循环DNA定量检测发现，早期妊娠和晚期妊娠时总循环DNA浓度比中期妊娠高。

这提示可以对孕妇总循环DNA进行动态监测，及时发现不同孕期出现的异常情况。

Stanghellini等[13]在无精症缺失基因(DAZ)的重复序列区域(DAZ4M8)设计了一个多位点探针，结合探针法实时荧光定量PCR技术有效定量了早期妊娠的循环胎儿DNA，表明其在妊娠早期就可以检测到，建议将此方法用于循环胎儿DNA的定量监测。

Sailor等[18]对Red阴性孕妇产前循环胎儿DNA的Red第7和第10外显子进行扩增，分析胎儿Red血型，之后对初生婴儿进行Red血型鉴定，二者结果完全一致，表明循环胎儿DNA 的检测在胎儿Red血型鉴定中较为可靠。

这一结果对于妊娠Red阳性胎儿的Red阴性孕妇意义重大，可以预知产后婴儿溶血的发生。

另有研究发现[19]，先兆子痫的孕妇循环胎儿DNA平均浓度比同胎龄的正常孕妇高出5倍多。

Christina等[20]通过鸟枪法测序技术对孕妇循环DNA进行高通量测序，成功检测了21三体，18三体及13三体的胎儿。

这些研究表明循环DNA为产前疾病监测与筛查提供了重要信息。

和传统的产前诊断方法(如羊膜腔穿刺、绒毛活检)相比，循环DNA有以下几方面诊断优势[21] ：(1)血浆标本易于采集、创伤小，对孕妇及胎儿均无危险，孕妇及其家属易于接受；(2)在早期妊娠就可以检测到，可用于动态监测；(3)价格相对优廉。

循环DNA在产前疾病监测与筛查中将有广泛的应用前景。

3.3在其他疾病中的应用除了肿瘤学和胚胎医学, 游离循环DNA 的检测也被有效地应用在对其他疾病的研究中。

这些疾病包括外伤、中风、糖尿病和自身免疫性疾病。

对于外伤的患者的研究发现其体内的血浆游离循环DNA的浓度在受伤一小时内会上升, 同时游离循环DNA浓度与受伤的程度有关[22]。

此外, 对于治疗中的患者的游离循环DNA 的检测可以预测其在器官衰竭, 急性肺损伤, 急性呼吸综合症以及死亡方面的情况。

同样, 对中风患者研究发现, 其体内游离循环的β-globing DNA的浓度要高, 这可以作为一个预测中风患者死亡情况的标志物[23]。

研究人员研究发现, 在胸痛(急性呼吸综合症)患者血浆中的游离循环DNA浓度是上升的, 上升的水平与损伤的程度相关; 在 2 年内死亡的患者, 其血浆内游离循环DNA浓度是最高的。

对游离循环DNA 的检测也有效地应用在对器官移植排斥的检测中。

对捐献者特异游离循环DNA的检测可以有效地预测肾移植排斥情况[24]。

4小结尽管人们目前对循环DNA的临床应用已经进行了大量的研究，并且也取得了一些突破性的成果，但是其中存在的一些问题仍然不容忽视，比如，研究过程中所使用的一些技术方法仍然不成熟，关于循环DNA的定量仍然没有统一的标准等等。

不过，自从血浆和血清中游离循环DNA 的发现, 该领域不断发展。

在许多国家, 对孕妇血浆中的胎儿DNA已经应用在对胎儿血型鉴定的常规检查中。