第三章 分子荧光光讲解

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分子荧光基本原理

分子荧光基本原理

分子荧光基本原理分子荧光是一种分子从高能级激发态返回到低能级基态时发出的光。

分子荧光主要是由于分子在受到激发后,电子跃迁至激发态,再回到基态时放出荧光。

这个过程是通过分子的内部结构和电子态之间的相互作用完成的。

分子荧光的基本原理可以通过分子的能级结构来解释。

在分子内部,存在着不同的能级,分别是基态、激发态、离子态等。

当分子受到能量输入(如光或热激发)时,电子可以跃迁到激发态。

在这个过程中,分子吸收能量,电子跃迁至高能级的激发态。

然后在一个相对较短的时间内,电子会从激发态返回到基态。

在这个过程中,分子释放出多余的能量,产生出发光。

这就是分子荧光的基本原理。

分子荧光的发生与能级结构有着密切的关系。

分子内部的能级结构是由分子的内部结构和分子轨道的排列规则来决定的。

在分子中,电子分布在不同的分子轨道上,这些轨道间的跃迁会导致分子的吸收和发射光谱。

当分子受到激发后,电子会占据一个比较高的能级的激发态。

随后,电子会通过辐射的方式返回到基态,释放出比较低能量的光子。

这个过程中,光子的波长和分子的能级结构有直接的关系。

分子的内部结构和键合方式也会影响分子的荧光性质。

比如,共轭结构的分子通常会表现出较强的荧光性质,因为共轭结构可以增加分子的π电子系统,加强分子的电子跃迁和荧光的产生。

此外,分子的溶剂环境也会影响分子的荧光性质。

在极性溶剂中,分子的电子态和能级结构会发生改变,从而改变了分子的光谱性质。

分子荧光的原理也可以应用于分析化学和生物化学领域。

分子荧光是一种非常敏感的检测技术,可以用于分析样品中的分子结构、浓度、和环境条件。

比如,荧光标记法可以用于追踪生物分子在细胞中的位置和运动。

利用分子的荧光性质,可以研究生物分子的相互作用、变化、和代谢过程。

此外,分子荧光也可以应用于环境监测和药物研发等领域。

总之,分子荧光是一种由分子内部结构和能级结构决定的发光现象。

分子在受到激发后,通过电子跃迁回到基态时释放荧光,这一过程受分子的结构、能级结构、溶剂环境等因素的影响。

分子荧光光谱分析

分子荧光光谱分析
不能使用含有重原子的溶剂
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溶剂极性增加有时会使荧光强度增加,荧光波长 红移;若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电 离状态改变,会使荧光强度、荧光波长改变。
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3)pH值的影响
荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别,带有酸性
或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关; 4)溶解氧的影响
一、分子退激发的过程
激发态分子回基态的途径很多,速度最快的途径占优势。
1、振动驰豫
1)分子吸收光子后,可能被激(非辐射跃迁)到达同一激发态的最
低振动能级
需时间10-13—10-11sec,效率较高
2、荧光发射
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分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到基 态——荧光发射。
检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的测定方法结合起来, 可用于测定复杂的混合物
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荧光团杂化纳米二氧化硅微球
2002222//33/1/1
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溶解氧的存在使Φf下降
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第二节 荧光分光光度计
一、基本构造
1、光源
强度较高的氙灯或氙汞灯,要求有稳定的供电源。
2、单色器
两个,互成直角
3、样品池
四通杯
4、检测器
光电倍增管
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二、仪器光路
光源
激发单色器
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样品池
荧光光谱的波长比吸收光的波长大(长),这种现象 叫作红移或斯托克斯位移。
3、内部转换 1)分子内过程,热退激 2)两个激发态重叠的能级发生内转换,因此吸收λ1、

分子荧光光度法基本原理

分子荧光光度法基本原理

400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、物质分子结构与荧光的关系
(一)荧光效率(φf) 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和 分子吸收激发光的光量子总数之比:
φf =
发射荧光的光量子数目 吸收激发光的光量子总数
[ φf∈(0,1)]
激发态的分子有几种途径可以回到基态, 荧光去 激发比其它去激发快 ,才可以观 察到荧光发射。
(二) 荧光和磷光的产生 激发态分子在极短的时间内回到 去活化过程: 基态的过程 。
无辐射跃迁
途径 体系跨越 -----最常见 辐射跃迁
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越 外转换
① 振动驰豫 较高能级分子与其它分子(样品或溶剂) 碰撞,能量变为热能。 ② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振 动能级重叠,电子由较高电子能级以无辐射 跃迁方式至低一级电子能级,称为内转换。
(3)镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱(与 激发光谱形状一样)成镜像对称关系。 镜像规则的解释:
基态上的各 振动能级分布 与第一激发态 上的各振动能 级分布类似。
基态上的零振动能级与第一激发态的二 振动能级之间的跃迁几率最大,相反跃迁也 然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 (1)Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长,振动弛豫 消耗了能量。 (2)发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级,吸收不同 波长的能量(如能级图 2 , 1),产生不同 吸收带,但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态,产生波长一定的荧 光(如’2 )。

第三章 荧光分析法

第三章 荧光分析法
第3 章
荧光分析法
Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
第3章 荧光分析法
3.1 概述 3.2 基本原理 3.3 分子结构与荧光关系 3.4 环境因素对荧光强度的影响 3.5 定量分析方法 3.6 荧光分光光度计 3.7 应用
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Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
跨越后,荧光量子减弱,甚至会荧光熄灭。 跨越后,荧光量子减弱,甚至会荧光熄灭。
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3.2 基本原理
一.分子荧光的发生过程 (5)磷光的产生: 磷光的产生: 磷光的产生 由第一电子激发态三线态的最低振动能级跃迁到基 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 态单线态任一振动能级发射的光量子为磷光。 磷光能量比荧光小,波长比荧光长 磷光能量比荧光小, 注: 磷光不干扰荧光的产生 体系间跨越 发磷光 ∴发射时间长(在三线态上逗留一段时间) 发射时间长(在三线态上逗留一段时间) 驰豫
Ft = F0e
− Kt
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Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
此时Ft ( ) 则上式为: 若t = τf , 此时 =(1/e)F0,则上式为:
F0 / e = F0 e
则K= 1/τf,将其带入 则得: 则得:
ln
− Kτ f
F0 t ln = Ft τ f
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Analytical Chemistry 第3章 荧光分析法 章
5.散射光的影响 散射光的影响 散射光: 散射光:光子与物质分子碰撞后使光传播的方向发生改变 而向不同角度散射。 而向不同角度散射。 瑞利光:发生弹性碰撞,无能量交换, 瑞利光:发生弹性碰撞,无能量交换,仅改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 拉曼光:发生非弹性碰撞,有能量交换, 拉曼光:发生非弹性碰撞,有能量交换,改变光子运动方 向的散射光。 向的散射光。 散射光对荧光测定有干扰, 散射光对荧光测定有干扰,尤其是波长比入射波长更长的 拉曼光,因其波长与荧光接近,干扰更大, 拉曼光,因其波长与荧光接近,干扰更大,必须采取措施消 除。

第三章 荧光分光光度法

第三章  荧光分光光度法

螯合物中金属离子的发光机理,通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发,接着配位体把能量转移给金属离子,导 致d d*跃迁或f f*跃迁,最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 (1)激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液,分 别测定其荧光值,然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图,即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值,在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况,可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型,且具有一定的刚 性结构,这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体,顺式分子的两个基团 在同一侧,由于位阻原因不能共平面,而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如:-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等;

有些取代基可减弱荧光。如:-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等; 有些取代基影响不明显。如:-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键,但 由于不是刚性结构,分子处于非同一平面, 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后,伴随着分子的刚性增强,平面结构增 大,常会发出荧光。
例如:8-羟基喹啉本身有很弱的荧光, 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说,能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构,如:Be2+、Mg2+、Al3+等。

位置 • 邻、对位取代,荧光增强;

chapter 3 分子发光光谱-荧光与磷光

chapter 3 分子发光光谱-荧光与磷光

I F ( I 0 I t ) I 0 ( 1 e
按照级数展开式:
2 .303ε bC
)
2 3 4 n x x x x x ex 1 1! 2! 3! 4! n!
(2.303εbC ) 2 (2.303εbC ) 3 (2.303εbC ) 4 I F I 0 (2.303ε bC ) 2! 3! 4!
P/F
λ Fmax(nm) λ Pmax (nm)
6.溶剂效应
无溶剂化作用
在极性溶剂中: 红移: 蓝移: △ Eπ→π* △ E n →π* > <
有溶剂化作用 △ Eπ→π* △ E n →π*
三. 荧光的熄灭
荧 光 熄 灭:荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起 荧光强度降低或消失的现象。 荧光熄灭剂:这些引起荧光强度降低的物质称为荧光熄灭剂。 1. 碰撞熄灭 激发 与分子的直径、粘度、温 发射 度等因素有关。 熄灭
F
发射荧光的分子数 激发分子总数
发射磷光的分子数 P 激发分子总数
F
kF kF ki
i 1 n
P st
kP k P ki
i 1 n
kF、 kp主要取决于荧光物质的分子结构; st系间跨越效率。
ki主要取决化学环境,同时也与荧光物质的分子结构有关。
固定em=620nm(MAX)
A. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长
ex =290nm (MAX)
2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900

第三章 分子荧光光度法

第三章 分子荧光光度法

测器,检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I;荧光物质被激发后,发射荧光F。 为消除入射光的影响,荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0,经样品池后,一部分光能被荧光物质吸收,
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰,如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光,以获得所需要的荧光,让其 作用于检测器上,得到相应的电信号,经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较,荧光法检测是在
黑背景下进行,所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级,测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似,则可从激发光谱的差异来区分;而如果
它们的激发光谱相同,则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点:
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关,如前所述,
无论引起物质激发的波
长是1还是2,但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带;由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高,远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况;
三.荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件: (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构,才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后, 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率,表示物质发 射荧光的本领,为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。

三章分子发光分析法

三章分子发光分析法
If 2.3fIobcKc
K2.3f Iob
f
I0
b
(二)、荧光熄灭
If
0
C
1、内滤效应
发射的荧光在溶液中通过时被基态分 子所吸收而使荧光强度下降的现象。
2、淬灭效应
碰撞淬灭: 荧光分子之间或荧光分子与熄灭剂分子 之间碰撞引起的荧光熄灭效应
M + h M* (吸光) M* M + h ’ (发生荧光) M* + Q 熄灭 例如:芳香烃的荧光可以被溶解 O2 所淬灭
荧光
相对强度
250 300 350 400 450 蒽乙醇溶液吸收和荧光光谱
300 400 500 硫酸奎宁在稀硫酸中的荧光光谱与吸收光谱
•荧光光谱与吸收光谱镜像对称 •荧光光谱较吸收光谱简单
(三)、荧光量子产率(荧光效率)
发荧光的两个必要条件 • 分子能吸收光子而跃迁至激发态 • 激发态分子能以光的形式释放能量
转入三线态的淬灭
含溴化物、碘化物、硝基化合物、重氮化合物、 羰基化合物及某些杂环化合物容易转变为三重态,因 而易使荧光淬灭
(二)、
荧光分析的仪器
检测器 If
单色器
光源
I0 单色器 液槽
记录器
1、光源 汞 弧灯 山气 弧灯
低压汞灯:254 nm 荧光光源强度 > 紫外-可见吸收光谱光源强度
激光光源
(3)量子产率与分子结构
荧光通常发生在具有刚性结构和平面结构的 -电子共轭体系分子中,任何有利于提高-电子共轭 度的结构改变,都将提高荧光量子产率,或使荧光 波长向长波长方向移动。
化合物
苯 联苯 对联三苯
荧光效率
0.07 0.18 0.93
平均波长

现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法

现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法

第二节 荧光分析的原理
(一)荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射, 被激发至激发态,在返回基态时,产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态

荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同, 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别: 对于荧光来说,当激发光停止照射后,发光 过程几乎立即停止(在10-9~10-6秒,荧光寿 命fluorescence life time )。 磷光则将持续一段时间(在10-3~10秒)。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生


分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后,基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级,根 据自旋禁阻规律,不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态,发射荧光是其中的一条 途径。


世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中,可观察到极可爱的天蓝色。
1852年,stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时,用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些,从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前,荧光的观察是靠肉眼进行 的,直到1928年,才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同

03第三章_分子荧光和化学发光解析

03第三章_分子荧光和化学发光解析

格也较低廉.
36

在流动注射进样方式中,传递分析物和反应物都是通
过泵来实现的,它的反应池是一个透明性良好的盘 管.分析时用泵驱动试剂进入流动系统,样品经注入 阀注入到反应试剂的溪流中,试剂和试样在流动过程 中进行混合(主要在盘管中混合),并在盘管中产生 化学发光,用置于盘管正前方的光电倍增管检测光信 号.流动注射式自动化程度高、分析速度快,便于连
NH2 O NH NH O O
N N NH2 [O]
*
COO- COO

氧化剂
OH-
叠氮醌
NH2 O N. NH O
+ N2
单电子氧化 鲁米诺 游离基
3-氨基邻苯二 甲酸根阴离子
NH2 COO- COO-
+ hv
(λmax=425nm)
28

鲁米诺(3-氨基苯二甲酰环肼)在碱性溶液中可
被一些氧化剂氧化,产生最大发射波长为425nm 的化学发光.发光过程有两种方式,即单电子氧 化和双电子氧化,单电子氧化得到中间体鲁米诺 游离基;双电子氧化得到中间体叠氮醌,而最后

式中C*为能量给予体,而F为能量接受体.例如,用罗丹 明B-没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3,其化学发光 反应就属这一类型.
21

没食子酸 + O3 A* + 罗丹明B 罗丹明B*
A* + O2 罗丹明B* + B 罗丹明B + hv

没食子酸被O3氧化时吸收反应所产生的化学能,
形成受激中间体A*,而A*又迅速将能量转给罗
率,其反应机理为
NO + O3 NO2* NO2* + O2 NO2 + hv

分子的荧光原理

分子的荧光原理

分子的荧光原理分子的荧光是指在吸收能量后,分子会发出光的现象。

荧光是一种从分子的高能级到低能级跃迁的过程,其原理可以通过分子的电子能级结构来解释。

在分子中,电子存在于不同的能级上。

当分子受到光的激发时,电子会从基态跃迁到激发态。

这个跃迁的过程需要满足一定的能量差,即跃迁能级的差异。

分子激发态的寿命通常比较短暂,其持续时间通常在纳秒到微秒的范围内。

在分子激发态,电子会在能级之间进行不同的跃迁。

其中一种跃迁是非辐射跃迁,即电子从高能级跃迁到低能级而不发生光的辐射。

这种跃迁会产生热量,使得分子发生振动、转动等运动,最终将能量散失。

另外一种跃迁是辐射跃迁,即电子从高能级向低能级跃迁时发射出光的辐射。

这种跃迁产生的光称为荧光。

荧光的发生需要满足一系列条件。

首先,分子必须能够吸收能量,这需要光的频率与分子的能级差异相匹配。

当光的频率与分子的能级差异相匹配时,分子吸收光的能量,电子跃迁到激发态。

其次,分子必须有足够长的寿命以保持在激发态上足够长的时间,这样才能产生可观测到的荧光信号。

最后,分子在激发态上的电子需要足够稳定,以便发生辐射跃迁,释放出光的能量。

分子的荧光发生过程可以用一个简单的能级图来表示。

在能级图中,基态能级用E0表示,激发态能级用E1表示。

当分子受到激发时,电子从基态能级跃迁到激发态能级。

在激发态能级上,电子可以通过非辐射跃迁返回基态能级,也可以通过辐射跃迁返回基态能级。

当电子发生辐射跃迁时,分子会发出与跃迁能级差异相对应的光。

荧光的发射光谱是离散的,具有特征性的谱线。

这是因为分子的能级结构是离散的,所以只有在特定的能级差异下才能发生辐射跃迁。

荧光光谱可以提供关于分子结构和环境的信息。

在实际应用中,荧光可以用于分子探针、生物成像、化学分析等领域。

总结起来,分子的荧光是分子在受到光激发后发出光的现象。

荧光的发生需要分子能级结构的支持,吸收光的能量、通过非辐射跃迁返回基态能级或通过辐射跃迁释放光的能量。

分子荧光分析法简介课件

分子荧光分析法简介课件

荧光光谱的测量
总结词
荧光光谱的测量是荧光分析中的重要环节,通过测量可以得到待测物的荧光发射光谱和 激发光谱。
详细描述
在测量荧光光谱时,需要使用光谱仪在特定的激发波长范围内扫描,记录待测物的荧光 发射光谱和激发光谱。同时,还需控制实验条件,如温度、溶剂等,以确保测量结果的
准确性和可靠性。
荧光量子产率的测定
荧光寿命的测定有助于了解荧光染料的发光 持续时间和能量衰减规律,有助于深入理解 荧光分析的原理和应用。
详细描述
荧光寿命的测定通常使用脉冲或时间相关偏 振光谱技术进行。通过测量染料在不同时间 点的荧光强度,可以计算出荧光寿命。该参 数对于优化实验条件、提高荧光分析的灵敏
度和特异性具有指导意义。
CHAPTER 05
CHAPTER 03
分子荧光分析法的分类
荧光分光光度法
总结词
一种常用的荧光分析方法,通过测量荧光光谱和荧光强度,对荧光物质进行定性和定量分析。
详细描述
荧光分光光度法基于荧光物质在不同波长光的激发下会发出不同波长的荧光原理,通过测量荧光光谱和荧光强度 ,可以确定荧光物质的成分和浓度。该方法具有高灵敏度、高选择性等优点,广泛应用于生物、医学、环境等领 域。
时间分辨荧光分析法
总结词
一种高灵敏度的荧光分析方法,通过测量荧光物质在不同时间点的荧光强度,对荧光物质进行定性和 定量分析。
详细描述
时间分辨荧光分析法利用荧光物质在不同时间点的荧光特性,通过测量不同时间点的荧光强度,可以 消除背景荧光的干扰,提高检测的灵敏度和准确性。该方法具有高灵敏度、高分辨率等优点,在生物 、医学、环境等领域有广泛应用。
分子荧光分析法的应用实例
在环境监测中的应用

第3章分子荧光分析法

第3章分子荧光分析法
2019/11/5
3 溶液荧光的猝灭
荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的 现象 1) 碰撞猝灭:荧光分子与淬灭剂分子碰撞 2)静态猝灭:荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物 3) 转入三重态猝灭:引入溴、碘、溶解氧 4) 发生电荷转移反应的猝灭:甲基蓝与Fe2+ 5)荧光物质自猝灭
kf
kf
ki
影响因素:荧光产生过程中, 辐射和无辐射过程; 与每一过程的速率常数有关;
kf 分子结构决定(内因);
主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。
2019/11/5
(1)跃迁类型:具有电子跃迁类型的结构
激发
荧光
n
振动弛豫
n
跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
cs和cx应很接近
3.3.4 荧光分析法的应用 1 无机化合物的荧光分析 衍生化法:与荧光试剂形成荧光配合物
2019/11/5
3.3.4 荧光分析法的应用 直接法:可测定的化合物很少 2 有机化合物的荧光分析 衍生化法:与荧光试剂形成共价化合物
待测物
试剂
丙三醇 糠醛 氨基酸 维生素A 蛋白质 肾上腺素
第三章 分子荧光分析法
molecular fluorescence analysis
一、 荧光分析的基本原 理
二、荧光分析仪 三、分子荧光分析法及其 应用
2019/11/5
3.1 荧光分析的基本原理
1575:西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象 1852:Stokes 研究荧光,提出作为一种分析手段 1867:Goppelsroder首次应用方法 1880:提出荧与化学结构关系的经验法则 1928:Jette和West 第一台光电荧光计 1952:第一台商品化的荧光分光光度计
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三、影响荧光的因素
(一)荧光效率
荧光效率越大,表示分子产生荧光的能力越强,荧光效率在0~1之间
影响荧光效率的因素主要取决与分子的化学结构,同时也与外界环境有关
(二)影响荧光的因素
1、分子结构 (1)跃迁类型 实验表明,大多数能发荧光的化合物都是由π→ π*跃迁或n→ π*跃迁 激发,然后经过振动弛豫等无辐射跃迁,再发生π* → n 跃迁或π* → π 跃迁而产 生荧光。 π→ π*跃迁通常产生较强的荧光效率 1、其中π→ π*跃迁吸收时跃迁的摩尔吸光系数比n→ π*跃迁的大102~103倍, ( π→ π*跃迁几率大,为允许跃迁),对激发光吸收较多,激发效率高 2、π→ π*跃迁的寿命(10-7~10-9)比n→ π*跃迁的寿命(10-5~10-7)短,在各种 去激发过程的竞争中,激发态寿命短,其他非荧光过程发生几率小,荧光效率高 3、 π→ π*跃迁能级差比n→ π*跃迁的大,体系间跨越的发生几率小,对荧光过 程有利。
基态分子吸收能量后,若电子在跃迁过程中,不发生自旋 方向的变化,这时仍然是M=1,分子处于激发的单重态; 如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化,这时分子 中便具有两个自旋不配对的电子, 即S=1,M=3,分子处于 激发的三重态,用符号T表示。下图为电子重态示意图。
能量
(a)基态单重态 (S0)(b)激发单重态(度下,大多数分子处在基态的最低振动能级。处 于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被 激发为激发态。激发态是很不稳定的,它将很快地释放出 能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射电磁辐 射(即光)的形式释放能量,就称为“发光”。如果物质的分 子吸收了光能而被激发,跃迁回基态所发射的电磁辐射, 称为荧光和磷光。
处于激发态的分子是很不稳定的,它可能通过辐射跃迁 和非辐射跃迁的形式去活化(去激发)释放出多余的能量 而返回基态。 辐射跃迁主要涉及到荧光,延迟荧光或磷光的发射; 无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量,包括振动 弛豫、内部转移、系间跨越及外部转移等过程。
振动弛豫(简写为VR)—— 当分子吸收光辐射(为图中 的λ1、λ2)后可能从基态的 最低振动能级(V=0)跃迁到 激发单重态Sn(如图中S1、 S2)的较高振动能级上。然 后,在液相或压力足够高 的气相中,分子间的碰撞 几率很大,分子可能将过 剩的振动能量以热的形式 传递给周围环境,而自身 从激发态的高振动能级跃 迁至该电子能级的最低振 动能级上,这个过程称为 振动弛豫。发生振动弛豫 的时间为10-12s数量级。
第三章 分子荧光光谱法
第一节 概述
一、荧光的发现 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes,他于1575年提到,在含有一种称为“Lignum Nephriticum” 的木头切片的水溶液中,呈现出极为可爱的天蓝色。以后逐步有一些学者 也观察和描述过荧光现象,但对其本质及含义的认识都没有明显的进展。 直到1852年,对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和绿色 素的荧光时,用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些,而 不是由光的漫反射引起的,从而导入荧光是光发射的概念,并提出了“荧 光”这一术语,他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系,并描述 了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光猝灭现象。可以说,他是第一个 提出应用荧光作为分析手段的人。1867年,Goppelsröde应用铝一桑色素 配位化合物的荧光测定铝,这是历史上首次进行的荧光分析工作。
外部转移(EC)— —激发态分子与 溶剂分子或其它 溶质分子相互碰 撞,并发生能量 转移的过程称为 外部转移。外部 转移能使荧光或 磷光的强度减弱 甚至消失,这种 现象称为猝灭或 熄灭。
二、激发光谱和发射光谱
荧光和磷光均属于光致发光,所以都涉及到两种辐射,即激发光(吸收)和发射光, 因而也都具有两种特征光谱,即激发光谱和发射光谱。它们是荧光和磷光定性 和定量分析的基本参数及依据。 1. 激发光谱 通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(即强度)随激发光波长的变化而获得的 光谱,称为激发光谱。激发光谱的具体测绘方法是,通过扫描激发单色器, 使不同波长的入射光照射激发荧光(磷光)体,发出的荧光(磷光)通过固定波长 的发射单色器而照射到检测器上,检测其荧光(磷光)强度,最后通过记录仪记 录光强度对激发光波长的关系曲线,即为激发光谱。通过激发光谱,选择最 佳激发波长——发射荧光(磷光)强度最大的激发光波长,常用λex表示。
系间跨跃(ISC)——系间跨跃 是指不同多重态之间的无辐 射跃迁过程,它涉及到受激 发电子自旋状态的改变。如 由第一激发单重态S1跃迁至 第一激发三重态T1,使原来 两个自旋配对的电子不再配 对。这种跃迁是禁阻的(不符 合光谱选律),但如果两个能 态的能层有较大重叠时,如 图中S1的最低振动能级与T1 的较高振动能级重叠,就有 可能通过自旋一轨道耦合等 作用实现这一跃迁。系间跨 跃的速度较慢,经历的时间 较长。
荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中,荧光发射的效率(称为量子产率)与激 发光的波长无关,因此用不同发射波长绘制激发光谱时, 激发光谱的形状不变,只是发射强度不同而已。
荧光激发发光谱与吸收光谱的形状相近似,荧光发射光谱与吸收光谱成镜像 关系
物质的分子只有对光有吸收,才会被激发,所以,从理论上说,某化合物的 荧光激发光谱的形状,应与它的吸收光谱的形状完全相同。然而实际并非如 此,由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响,使得绝大多数情况 下,“表观”激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别。只有在校正仪器因 素后,两者才非常近似,而如果也校正了环境因素后,两面的形状才相同。 如果把某种物质的荧光发射光谱和它的吸收光谱相比较低,便会发现两者 之间存在着“镜像对称”关系。如图分别表示苝的苯溶液和硫酸奎宁的稀硫 酸溶液的吸收光谱和荧光发射光谱。
荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动 能级跃迁回基态的各振动能级所产生的,所以不管激发光的能 量多大,能把电子激发到哪种激发态,都将经过迅速的振动弛 豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级,然后发射荧 光。因此除了少数特殊情况,如S1与S2的能级间隔比一般分 子大(如)及可能受溶液性质影响的物质外,荧光光谱只有一个 发射带,且发射光谱的形状与激发波长无关。
磷光发射(PE)——激发态的电子 经系间跨跃后到达激发三重态, 经过迅速的振动弛豫而跃迁至第 一激发三重态的最低振动能级, 然后以辐射形式跃迁回基态的各 振动能级,这个过程为磷光发射。 磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻 的,所以发光速度很慢。磷光的 寿命为10-4~100s。因此,外光 源照射停止后,磷光仍可持续一 短时间。由于经过系间跨跃及T1 中振动弛豫丢失了一部分能量, 所以磷光波长比荧光波长要长, 即。 必须指出的是 T1还可能通过 热激发而重新跃回S1 即T1→S1, 然后再由S1经辐射跃迁回S0,即 S1→S0,发出荧光,这种荧光称 为延迟荧光,其寿命与磷光相近, 但波长比磷光短。
第二节 基本原理
一、荧光的产生 (一)分子的激发 每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级,称为电子能极,而 每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。分子中电 子的运动状态除了电子所处的能级外,还包含有电子的多重态,用 M=2S+1表示,S为各电子自旋量子数的代数和,其数值为0或1 。 根据Pauli不相容原理,分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有 相反的自旋方向,即自旋配对。若分子中所有电子都是自旋配对的, 则S=0,M=1,该分子便处于单重态(或叫单重线),用符号S表示。大 多数有机化合物分子的基态都处于单重态。
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
斯托克斯位移 : 在溶液荧光光谱中,所观察到的荧光发射波长总是大于激 发波长,λem>λex 。Stokes于1852年首次发现这种波长位 移现象,故称Stokes位移。 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的能 量损失。激发态分子由于振动弛豫及内部转移的无辐射跃 迁而迅速衰变到S1电子激发态的最低振动能级,这是产生 其位移的主要原因;其次,荧光发射时,激发态的分子跃 迁到基态的各振动能级,此时,不同振动能级也发生振动 弛豫至最低振动能级,也造成能量的损失;第三,溶剂效 应和激发态分子可能发生的某些反应,也会加大斯托克斯 位移。
(2)共轭效应 发生荧光(或磷光)的物质,其分子都含有共轭双键(π键)的结构体系。共轭体系 越大, 电子的离域性越大,越容易被激发,荧光也就越容易发生,且荧光光谱向 长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环,芳环越大,其荧光(或磷光)峰越 向长波移动,且荧光强度往往也较强。 如苯、萘、蒽三者的共轭程度依次增大,其荧光效率分别为0.11、0.29、0.36.
2. 发射光谱,也称荧光光谱或磷光光谱 通过测量荧光(或磷光)体的发光通量(强度)随发射光波长的变化而获 得的光谱,称为发射光谱。其测绘方法是,固定激发光的波长,扫描发 射光的波长,记录发射光强度对发射光波长的关系曲线,即为发射光谱。 通过发射光谱选择最佳的发射波长——发射荧光(磷光)强度最大的发射 波长,常用λem表示。磷光发射波长比荧光来得长,图为萘的激发光谱 及荧光和磷光的发射光谱。
进入二十世纪以来,荧光现象被研究得更多了,在理论和实验技术上都得到 极大的发展。特别是近几十年来,在其他学科迅速发展的影响下,随着激光、 计算机和电子学的新成就等一些新的科学及技术的引入,大大推动了荧光分析 法在理论上及实验技术上的发展,出现了许多新的理论和新的方法。 在我国,二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作者从事荧光分析方面 的研究工作。到了七十年代以后,已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队 伍。目前,研究内容已从经典的荧光分析方法扩展到新近发展起来的一些新方 法和新技术。 磷光也是某些物质在紫外光照射下所发射的光,早期并没有与荧光明确的区 分。1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念,指出磷光是分子从 亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光,它有别于从激发单重态跃迁回基 态所发射的荧光。磷光分析法由于其有某些特点,几十年来的理论研究及应用 也不断得到发展。
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