血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告

生物化学实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心

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一、实验目的

1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。

2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。

3、了解柱层析技术。

二、实验原理

1、粗提（盐析法）：

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。

2、脱盐（凝胶层析法）

凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，

所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。

3、纯化（离子交换层析法）

离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。

4、纯度鉴定（电泳）

采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。

三、材料与方法：以流程图示意

材料：

1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）

2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。

3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。

方法：

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑

推论，并得出结论。

结果：

1、粗提（盐析法）:如图1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊，），沉淀为白色。如图2所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水

后溶解，为无色溶液（见图4）。

图1 血清加饱和硫酸铵溶液 图2 分离上清液和沉淀

过DEAE-纤维素层磺基

收集含有蛋

过DEAE-纤维素层

磺基

收集含有清

用0.3mol/L

NH4AC 缓冲液

图3上清液图4沉淀加水后溶解

2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图5所示，往层析柱中加样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约0.5cm。与葡聚糖凝胶G-25层析柱相对比，DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图6所示，往磺基水杨酸和BaCl2溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的1管球蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。

图5 DEAE-纤维素层析柱图6磺基水杨酸和BaCl2检测蛋白质呈阳性

（红色圆圈为磺基水杨酸，蓝色圆圈为BaCl 2溶液）

4、纯度鉴定（电泳）：如图7所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。如图8所示，染色后，薄膜上可见5条深蓝色横纹。

图7 直流稳压电泳仪

图8 血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱

血清蛋白

γ

球

蛋

α2球α1球β

球蛋清蛋点样

清蛋白

γ-球

讨论：

1、操作失误：

1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而是接着倒入了1ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液，导致球蛋白被稀释。

2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。

3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。

2、注意事项：

1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉淀物。

2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床/纤维素床表面，以免空气进入凝胶床/纤维素床。

3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒/纤维素粒冲起，破坏凝胶床/纤维素床表面的平整。

4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样品会被稀释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。

5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和BaCl2检验流出液是否含有蛋白质，以免蛋白质流失过多。

6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。

7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效果。

8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。

9）点样时应做好标记，以免弄混。标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。

3、讨论题：