WB实验问题
WB常见问题的解答
Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
WB常见问题解答
Western Blot常见问题及处理(一)1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
实验老司机分享：WB实验做容易出现的问题集锦
那些年，我们一起追过的WB实验，总是因为环节多、耗时长让实验室的达人们头疼不已。
虽然天天做Western blot，但不是忙上一天最后看不清条带，就是条带清晰了样品间差异很难重复。
今天，就让我们来看看如何解决并完美避开WB实验中的各种问题。
Western blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western blot应用：目的蛋白的表达特性分析;目的蛋白与其他蛋白的互作;目的蛋白的组织定位;目的蛋白的表达量分析;Western blot一般流程：蛋白样品的制备：1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般;2 有机溶剂提取法;3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强;4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。
Western blot注意事项和常见问题：1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢?答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长; 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2 我做的蛋白质分子量很小(10 KD)，请问怎么做WB?答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3 最后显色时用DAB好还是ECM好?答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot 试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?答：免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
wb实验过程中的各种问题和解决方法
wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。
1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。
解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。
-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。
-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。
2.染料在染色过程中不均匀。
解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。
-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。
-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。
3.染色结果不明显。
解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。
-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。
-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。
-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。
4.细胞在染色过程中丧失形态。
解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。
-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。
-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。
5.染色结果有杂质。
解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。
-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。
-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。
6.染色结果无法观察到。
解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。
-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。
-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。
在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。
2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。
3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。
4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。
WB问题分析
WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移:因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高,转膜过程中注意降温。
在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高:1）封闭不全， 5%脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制:通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法
刚开始接触WB实验有没有大佬可以分享常见WB常见问题的解决方法对于WB实验，我真的很有发言权，实验室苦干几年加上毕业后在试剂公司做技术支持好几年，我碰到的正常与非正常的WB实验问题肯定比一般人更多！这里给大家分享我们合作的课题组以及我们自己课题组在做WB实验的时候常见的一些问题以及解决方法！在讲WB之前，大家有兴趣的可以保存下这套课程，这是我自己买过的一套解螺旋实验技术学习的课程，2000分钟的实验讲堂，40个实验技能认证培训，有需要的可以自取，能学到非常多的实验实操知识。
好了，继续我们的主题内容。
Western Blot，通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”，其核心本质是抗原抗体的特异性反应。
Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。
Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
01样本问题Q：蛋白样本如何准备？A：对于细胞样本，蛋白的提取方法比较简单，只需要将细胞培养基弃掉，然后利用PBS清洗2-3次，随后添加RIPA裂解液进行冰上直接裂解，离心上清即为蛋白；但是对于植物和动物组织而言，需要将组织分解成较小的组织块，液氮研磨，后续利用RIPA裂解液进行冰上裂解，相对于细胞蛋白的提取，多了一步组织样块的处理步骤。
02电泳问题Q1：大小分子蛋白各自的电泳胶浓度如何选择？小提示：1、由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；2、大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；3、由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀；4、推荐浓度梯度预制胶，4-20%高分辨率梯度预制胶，分离分子量范围3.5-200kD，大分子量小分子量兼顾，非常好用幺。
WB实验问题解决方案
抗体浓度太低
1.优化抗体的使用浓度。
二抗种属问题
1.确保二抗能够识别所用的一抗
使用的一抗是天然蛋白免疫制备的
1.天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别变性的蛋白，检查抗体的厂家信息，确保可以用来检测你的目的蛋白。
检测试剂过期
1.确保检测试剂的有效期，设置阳性对照。
空白带
信号太强，底物被消耗
1.降低抗体浓度或者蛋白上样量。
2.跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚蓝会干扰荧光信号。
3.当使用Cy3标记的二抗时，使用Tween-20作为去污剂，TritonX-100会干扰Cy3的荧光信号。
4.洗涤最后一步使用PBS或者TBS去除去污剂。
Multiplex问题
与实验设计相关
1.确保二抗能有效地分开不同种属的一抗。
斑点背景
膜上有灰尘污染/圆珠笔做记号
4.对于单抗或者高度纯化的抗体，封闭液中不含去污剂效果会更好。
5.优化洗涤的次数降低信噪比。
6.如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷酸的缓冲液（如PBS）
过度封闭
1.室温封闭不超过1hr或者低温4度过夜。
曝光时间过短
1.延长曝光时间
抗体结合时间不够或者温度不合适
1.一抗或二抗在室温通常结合1-2小时，时间过短容易导致弱信号
转印buffer中甲醇浓度太低
1.提高甲醇的浓度（15%-20%）
蛋白结合时间不够
1.调低电压，延长转印时间。
分子量大的蛋白转印效率低
甲醇浓度太高
1.降低甲醇浓度至10%（V/V）以下。
蛋白结合时间不够
1.使用湿转代替干转。
2.延长转印时间。
蛋白凝胶浓度太高
1.降低凝胶浓度
WB常见问题及处理方法
WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。
封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。
一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。
抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。
4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。
组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。
转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。
洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。
过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。
激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。
WB实验常见问题与解决方案
一、WB基本原理的理解
Western Blot（WB）原理：
通过电泳区分不同组分，并转移至固相支持物，通过 特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白 质的WESTERN 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1~5ng （最低可到10~100pg）中等大小的靶蛋白。
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
很好
细胞核转录因子提取 很好
含蛋白酶抑制剂
是
含磷酸酯酶抑制剂
是
主要用途
WB, IP,co-IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP
很好 是 是 WB, IP, co-IP
很好
很好
是
是
是
是
WB, IP,coIP
WB, ChIP
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
样本中蛋白酶抑制剂的使用
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 原 理 示 意 图
红色箭头：目标抗原 绿色箭头：靶抗体 黄色箭头：标记二抗
WB
一、WB基本原理的理解
基 本 过 程 示 意 图
二、样本的制备和抗体的选择 ——样本制备
WB样本来源：大部分细胞或组织裂解物
蛋白位置 全细胞
胞浆（可溶性蛋白）
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
WB 过程中常见问题2
1. 在western实验中，通常有人采用TBS，有人采用PBS，在使用中有什么区别？答：选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。
PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在pH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。
但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
2. 没有注明可以用来做western blot的一抗，可以用来做western blot吗？答：不一定，因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
3. 做western每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？答：最好还是不要同时加两种一抗。
因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。
做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。
4. western blot 使用的膜哪种最好啊，PVDF好还是NC膜，如何选择？答：PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。
NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。
都可以用丽春红染色。
具体使用还要参考相关文献。
5. 为什么出现了多条带，每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？做WESTERN 必须要内参吗？答：一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。
雨课堂WB实验技能试题答案
雨课堂WB实验技能试题答案一、选择题(30分)1. 设立一组权值子集W={2，3，4，5，6}，则由该权值子集结构的哈夫曼树中有向路径长度之和为( )。
(A) 20 (B) 30 (C) 40 (D) 452.继续执行一趟快速排序能获得的序列就是( )。
(A) [41，12，34，45，27] 55 [72，63](B) [45，34，12，41] 55 [72，63，27](C) [63，12，34，45，27] 55 [41，72](D) [12，27，45，41] 55 [34，63，72]3.设一条单链表的头指针变量为head且该链表没有头结点，则其判空条件是( )。
(A) head==0 (B) head->next==0(C) head->next==head (D) head!=04.时间复杂度不受到数据初始状态影响而恒为O(nlog2n)的就是( )。
(A) 堆排序 (B) 冒泡排序 (C) 希尔排序 (D) 快速排序5.设二叉树的先序结点序列和后序结点序列刚好恰好相反，则该二叉树满足用户的条件就是( )。
(A) 空或只有一个结点 (B) 高度等于其结点数(C) 任一结点并无左孩子 (D) 任一结点无右孩子6.一趟排序结束后不一定能够选出一个元素放在其最终位置上的是( )。
(A) 堆排序 (B) 冒泡排序 (C) 快速排序 (D) 希尔排序7.设某棵三叉树中有40个结点，则该三叉树的最小高度为( )。
(A) 3 (B) 4 (C) 5 (D) 68.顺序查找不论在顺序线性表中还是在链式线性表中的时间复杂度为( )。
(A) O(n) (B) O(n2) (C) O(n1/2) (D) O(1og2n)9.二路归并排序的时间复杂度为( )。
(A) O(n) (B) O(n2) (C) O(nlog2n) (D) O(1og2n)10. 深度为k的完全二叉树中最少有( )个结点。
WB中常见问题和解决方法
1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4.Western blot结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
WB常见问题总结
WB常见问题总结Q1：两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?1）玻璃没有洗干净。
2）过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍。
3）加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。
4）稍微注意手法，均匀加入。
5）灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面。
6）边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。
7）温度也是影响胶聚合的重要因素，可能为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。
Q2：胶为什么总是漏？1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件。
2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。
3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了。
4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。
5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用。
6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干。
（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果。
）7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。
或者在玻璃底部用琼脂糖封上。
8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。
以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。
用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。
注意两边均匀用力，一般不会再漏。
9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。
WB实验问题解决方案
1.降低转印电流，不要超过0.8 mA/cm2。
2.增加转印滤纸数量。
蛋白样品过量或者有杂质干扰，如脂类、核酸、IgG、白蛋白等
1.请参考GE样品制备指南，去除杂质。
分子量小的蛋白转印效率低
小蛋白在膜上结合量少
1.使用蛋白结合能力更强的PVDF膜。
2.增大SDS-PAGE凝胶浓度。
3.使用0.2μm孔径的膜。
1.避免手指与膜接触。
2.使用70%乙醇擦拭扫描仪，保证成像相关物品干净。
3.避免使用圆珠笔在膜上做记号。
低信号
漂白
1.荧光基团标记的抗体需要避光，避免光漂白
激发光及滤光片选择不对
1.使用的正确的激发光及滤光片。
成像仪的设置不对
1.选择合适的曝光时间和检测器的强度。
2.提高封闭液浓度和延长封闭时间。
二抗浓度太高
1.优化抗体浓度
封闭液与抗体交叉反应，需更换封闭液。
1.比如检测磷酸蛋白，建议使用BSA代替牛奶作为封闭液，因为牛奶中含有磷酸化的蛋白。
非特异条带
一抗，二抗浓度太高
1.优化抗体浓度。
上样量太大
1.降低上样量。
非特异的小蛋白带
1.可能是目的蛋白降解产生的。请参考GE样品制备指南，建议样品制备时冰上快速操作，添加蛋白酶抑制剂等。
转印装置正负极摆放不对
1.确保膜处在阳极位置，凝胶在阴极。
2.确保转印正负电极连接位置正确。
目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白，IgG等。
1.去除高丰度蛋白
膜上蛋白条带出现smear拖尾
转印中过热
对于湿转：
1.确保转印槽中buffer没过转印模块。
2.Buffer可先预冷或者在4度环境下转印。
WB试验常见问题解答
WB试验常见问题解答[1]各位朋友：请教关于sds-page的问题。
我的配胶体系如下：15%分离胶4%浓缩胶水2.3ml2.7ml30%丙烯酰胺5.0ml0.67mltris-hclph8.82.5mlph6.80.5ml10%sds0.1ml0.04ml10%aps0.1ml0.04mltemed0.004ml0.004ml我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60v,40min，分离胶90v，70min。
跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。
谢谢答：【1】胶的配制方法；酿制相同体积15%胶sds-page拆分胶所须要各成分的体积(毫升)15%胶(毫升)：5－－10－－15－－20－－30－－50蒸馏水：0.5－－1.0－－1.5－－2.0－－3.0－－5.030?r-bis(29:1)：2.5－－5.0－－7.5－－10.0－－15.0－－25.01mtris,ph8.8：1.9－－3.8－－5.7－－7.6－－11.4－－19.010%sds：0.05－－0.1－－0.15－－0.2－－0.3－－0.510%过硫酸铵：0.05－－0.1－－0.15－－0.2－－0.3－－0.5temed：0.002－－0.004－－0.006－－0.008－－0.012－－0.02酿制相同体积4%胶sds-page铀胶所须要各成分的体积(毫升)4％铀胶（两块胶，5ml）超纯水：3.16ml40％acr/bic（37.5：1）：0.5ml0.5mol/ltris?hcl（ph6.8）：1.26ml10％sds：50持续上升?微升?10%ap（过硫酸胺）：25temed：5微升?提temed后，立即搅匀即可灌胶。
【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。
如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。
【3】特别注意电泳液不要出来问题（与否过期了，与否把迁移液当做电泳液了？），电泳液如果出来问题，也可以导致楼主所说的现象。
WB注意事项及常见问题
WB注意事项及常见问题WB注意事项及常见问题注意事项一、样本收集1.组织样本原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保存。
具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；2.细胞样品原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；二、总蛋白提取1.组织样品具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；2.细胞样品具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂；三、蛋白样本保存裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接-20℃保存；四、蛋白变性提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性；五、SDS-PAGE1.浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品；2.分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页；3.分离胶和浓缩胶的高度比为8:3；4.电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；5.电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；6.清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝；六、转膜1.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；2.注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；3.转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；4.转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；5.转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏；七、封闭1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高；八、一抗杂交1.一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；2.杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃；3.应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保存，如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃；九、一抗杂交后洗膜1.一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);2.一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十、二抗杂交1. 二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整；2. 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）；3. 应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收；十一、二抗杂交后洗膜1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM);2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次；十二、拍照1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间；十三、报告单整理1.原始图片；2.对比度和亮度调整的图片；3.图片说明：上样顺序；4.灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1；5.实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例；常见问题一、没信号1.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体；2.膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策；二、背景过高1.目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；三、杂带1.目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500 nM；2.杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间，已经采取上述解决方法；四、目的带弱1.一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量；2.转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；五、复合问题上述问题往往同时出现，首先客观冷静分析问题所在，针对问题采取相应策略，有些策略可能互相矛盾，应以解决主要问题为主；。
WB 过程中常见问题1
Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
WB 实验中常会出现各种问题问题可能原因建议电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全调整装置拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样条带两边扩散加样量过多适当减少上样量Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样背景高膜封闭不够延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度一抗孵育的温度偏高建议4℃ 结合过夜二抗浓度度过高降低二抗浓度二抗的非特异性背景增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短洗膜不充分增加洗膜的时间和次数抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。
洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应杂带较多目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行上样量过高，太敏感适当减少上样量一抗不纯纯化抗体一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体二抗的非特异性结合增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。
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Western Blot问题指南时间：2011-05-13 08:55 来源：网络作者：admin点击：3679次根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）； 1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual ，根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）；1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies （a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane ）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1,样品不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
E我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5—10%甲醇。
F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。
G. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30%是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5m m的comb。
H. 蛋白变性后可以存放多久？解答：—80C, —两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
I. 我所测定的蛋白分子量是105KD按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11 %的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
J. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA弋替应该好一点.K. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：Western Blot 一般上样30—100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合WesternBlot的怎样做也不行。
所以拿到好的结果不容易。
L. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制剂cocktail ）,封闭剂一般5%兑脂奶粉较常用。
如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也是不错的选择。
M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%勺；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
N. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
O. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot 就可以了。
如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。
42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3（1 g/mn2。
Q. 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3. 抗体R. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
S. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。
转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。
我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。
至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。
一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。
至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1 : 1500; 二抗1：20000试试。
另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！T. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。
（限于单抗）U. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。
稀释后应在2-3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4. 滤纸、胶和膜的问题V. NC膜\ PVDF膜\尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480—600 i g/cm2,可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80—100 i g/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125 —300 i g/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
W. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
X. 检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？解答：可以。
AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC.采用tank system 有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），女口28V 14 —16hrs。
DD.做HSP WESTE定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTE却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。
EE.膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF.如果是6 X 8转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3—5ml。
GG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：无要求。
HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。
过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。
如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。