免疫组织化学染色技术 PPT课件

酶---免疫酶法 荧光染料---免疫荧光法 铁蛋白---免疫铁蛋白法 胶体金---免疫金银法 放射性同位素----放射免疫法
根据染色步骤
直接法：例-免疫荧光探针
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原 物质。 例：两步法，三步法及多步法 优点：提高灵敏度，同时避免多次标记I抗
第二节 免疫组织化学的关键技术
第三节 酶免疫组织化学染色
第四节 荧光免疫组织化学技术
第五节 免疫金银法
本
免疫组化的概念及原理 （重点掌
次 课
第一节 概述
握）
免疫组化分类（了解）
程
常用免疫组化方法（熟悉）
任
免疫组化特点（熟悉）
务
第二节 免疫组织化学的关键技术（学习难点）
第三节 酶免疫组织化学染色
【教学目的与要求】
Elisa试验）
❖将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测 （蛋白印记）---免疫印记技术（Westernblot）
主讲人：王兴名
指导教师：王洪江
在此特别感谢我的导师王洪江老师及研究生科三位老师的指导与支持！谢谢。
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
在
、血型抗原
异嗜性抗原：人与其他动物、植 物等之间存在的共同抗原
（2）抗体（antibody）
❖机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆 细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特 异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。
Illustration of EnVision method
Secondary antibody
Primary antibody
Ag Ag
Enzyme, AP or HRP
小复习：
显色剂
酶标II抗
特异性I抗
组织内抗原
※ 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）
❖用于鉴别肿瘤的组织来源 ❖细胞受体检测 ❖病毒性抗原检测 ❖癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测 ❖重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制
P-O
Avidin-biotin-peroxidase complex
Avidin P-O HRP
sp法
基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同： 是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混 合液来测定细胞和组织中的抗原
Illustration of SP method
❖特性：能够与相关抗原特异性结合。
（3）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧 化物酶等），与底物发生酶促反应。
酶促反应的特点：高效性 特异性 操作简单 条件可控。
❖总结： （1）+（2）+（3）==免疫组织化学的优点：
2.免疫组化染色原理：
免疫反应+组织化学 结合的产物 1.利用了免疫学基本原理：抗
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
ABC试剂盒
1 .封闭用血清 2.生物素标记II抗 3.A试剂： 卵白素（抗生物素） 4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物
Illustration of ABC method P-O
Biotinylated second antibody
P-O
Primary antibody
Antigen
Biotin
2.特点：荧光显微镜 下观察
免疫酶标方法
1.目前应用最为广 泛
2.原理：抗原抗体 反应，酶标记抗 体，加底物显色
3.特色：准、清、 久、兼容。
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
水化、洗涤：PBS浸泡 5min
5.灭活
3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化 物酶的活性
6.抗原修复
❖ 目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色 ❖ 方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M ❖ 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。 ❖ PBS洗涤 3次
图例
直接法：特异性 间接法:灵敏性
一步法
三步法、两步法
根据结合方式：
抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过 氧化物酶复合物法
亲和连接法：ABC法 S-P法
三、较常用的免疫组织化学方法
❖免疫荧光法 ❖免疫酶标方法 ❖免疫胶体金技术
免疫荧光法
1.原理：抗原抗体特 异性结合 用荧光素标 记I抗进行反应。
1.原位性 2.显色反应 3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强 6.敏感性高
1.原位性 原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆
细胞器层面
2.显色反应
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
3.形态、代谢和功能三结合 形态—显色反应 代谢、功能—抗原含量及位置
综合两门技术，并借助显微镜检测各种物质。
本质：组织化学染色+原位示踪技术
发展历程：免疫荧光法---酶标抗体技术—酶抗酶复 合物技术—胶体金标记技术以及亲和标记技术--出现原位杂交技术及PCR技术。
（二）免疫组织化学原理（重点掌握）
1.（回顾）理论基础： （1）抗原（antigen）
是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生 抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴 细胞在体内或体外特异性结合的物质。
最后一步：结果判读
❖结果判读要考虑以下几个方面 ❖ A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，
细胞间质 ❖ B、阳性细胞数 ❖ C、染色强度
光学显微镜下结果判断判读举例：
食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳 性表达，表达位置：细胞质
乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表 达
在有转移的HCC中，VEGF呈 强阳性表达 ABC ×200
化作用，从而保护蛋白质免受破坏）
2.组织包埋
目的：使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片 方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等
3.制片
切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附 于载玻片。
烤片： 70℃ 2h，目的---充分贴附
4.脱蜡
脱蜡：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二 甲苯
10.滴加底物
采用的方法不同，底物有一定差异.
后面详细分析
11.滴加显色剂
11、滴加显色剂： ❖如DAB ，室温，5min左右。 ❖注意：光镜下掌握染色时间； ❖流水冲洗 5min
12.复染
苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化
13.“成片”
流水充分冲洗 梯度酒精脱水 中性树胶固定，封片，晾干后镜检。
肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为 腺癌。（ CK7和CK20联合应用）
免疫组化：协助临床诊断！
某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗
作用靶点 肿瘤类型
Tratugumab(赫赛 HER2 汀）
乳腺癌和胃癌
Cetuximab（艾 EGFR 比妥）
结肠癌，非腺癌
Bevacizumab（ VEGF 阿瓦斯汀）
制作 内容
医学免疫学
Company
LOGO
第27章 免疫组织化学技术
主讲教师：王兴名
指导教师：王洪江老师
2014-04-15
实例
35岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫 描未发现原发灶？临床如何处理？
活检：提示为腺癌（转移性）
行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-）， CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠 来源。
原与抗体结合的高度特异性 2.借助化学显色方法
具体的反应原理?
提取靶蛋白（作为抗原）
获得鼠I抗
实验 动物
标标记记性性II抗I抗
DAB
酶或生物素
显色
获得II抗
二、免疫组织化学分类
根据标记抗体种类不同
根据染色步骤分类
根据结合方式：抗原抗体结合： 如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法） 亲和连接
根据标记抗体不同：
+
–
– (但常会黏液腺癌 + 阳性表达)
– (但黏液型可以阳 + 性)
❖EBV ❖HPV ❖HBsAg 和HBCAg ❖MCV
病原体的标记
※举一反三 融会贯通（了解）
小拓展--免疫组织化学（酶联免疫组织化学） 的延伸：
❖荧光标记---荧光标记免疫组织化学 ❖血清中抗原检测---酶联免疫吸附试验（
7.血清封闭
封闭后勿洗涤！
目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源 性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）
方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清
8.特异I抗孵育
适当比例稀释I抗，37℃孵育1h或4℃冰箱过夜。 ❖PBS洗涤 2min*3次
9.II抗孵育
滴加生物素化II抗工作液50-100ul室温孵育 20分钟，PBS洗涤2min*3次
4.定性、定量及定位三位一体
存在吗？ 在哪里？ 有多少？