【VIP专享】双向凝胶电泳
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
双向凝胶电泳
1.丙二醛的测定丙二醛(Malomdialdehvde，MDA)是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，形成的脂质过氧化物，测试MDA的营可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。
测定方法是利用过氧化降解产物中的丙二醛与硫代巴比妥酸(TBA)在高温和酸性条件下缩合，形成的红色产物甲川(3，5，5一三甲基恶唑2，4一二酮)于532nm 处有最大吸收峰来进行测定的。
2.脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX）活性的测定参照Axelrod等1981)的方法，反应温度为室温，反应体系为3ml(含有缓冲液2.930 ml，酶液25ul，底物45出)，加入酶液15 s后开始计时，记录3 min内OD值的变化，酶活性以ΔOD234／(gFW·rain)表示。
重复3次。
3.细胞膜透性的测定取每盆烟草植株中部叶片，采用浸泡法取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性，少含茎节)，用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉)，快速称取鲜样3份，每份0.1 g，分别置于10 ml去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12 h．用电导仪测定浸提液电导(R1)，然后沸水浴加热30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导(R2)．4.超氧阴离子相对含量的测定按王爱国等( 1990) O2- 对羟胺氧化的方法, 将氧化产物N O2-在对氨基苯磺酸和O2-萘胺中显色后的偶氮染料转移到等体积的乙醚中, 水相液在530nm 比色。
以NO2-作标准曲线, 根据NO2的浓度换算成O2 产生速率。
5.H2O2含量测定按Kar 等( 1987)的方法, 5%Ti ( SO4) 2 与待测提取液中的H2O2反应形成过氧化物—钛复合物沉淀, 离心后弃去上清液, 沉淀用冷丙酮洗涤2 次, 用lmol/ L H2SO4溶解沉淀, 在420nm比色。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
双向电泳的
IPG IEF 中pH梯度的选择 pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性， 先短后长，预试验确定。
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备 双向电泳 凝胶中的蛋白 混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 蛋白质质量 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 N端测序 端测序 图像分析 溶液中的蛋白
双向电泳的 技术流程和样品制备
史须 北京大学人类疾病基因研究中心
基因组学与蛋白质组学
基因组学： 蛋白质组学：可视为分子生物学的大规模筛选 技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分 布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明 它们的关系与功能。 上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究 了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供 了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强 的且带有系统性相互关系。
增加样品溶解性的手段
变性剂： 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂： 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基 团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG 等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂： 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
双向电泳的原理及步骤
双向电泳的原理及步骤
双向电泳是一种分离蛋白质的方法，基于蛋白质在电场中的电荷和大小的不同进行分离。
以下是双向电泳的原理及步骤：
原理：
双向电泳是将蛋白质样品首先进行等电聚焦，然后再进行垂直于等电聚焦方向的SDS-PAGE电泳，从而获得更高的分离效率。
等电聚焦可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离，而SDS-PAGE电泳可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
通过这两个步骤的组合，可以更加准确地分离出蛋白质。
步骤：
1. 等电聚焦：将蛋白质样品加入到等电聚焦电极中，该电极包含有一系列等电点缓冲液。
在等电聚焦过程中，电极会产生一个电场，该电场会将带有不同电荷的蛋白质分子朝向不同方向移动，最终在等电点处停留。
这样可以将蛋白质按照等电点的不同进行分离。
2. SDS-PAGE电泳：在等电聚焦完成后，将电极旋转90度，使其与等电聚焦电极垂直。
然后将电极中的蛋白质样品注入到SDS-PAGE凝胶中，并进行电泳。
在SDS-PAGE电泳中，蛋白质会在电场中移动，但由于SDS的存在，蛋白质会被完全线性化。
这样可以将蛋白质按照分子量的大小进行分离。
3. 结果分析：通过电泳分离，可以得到一系列不同的蛋白质带，每个带代表一个蛋白质。
通过比对蛋白质带的大小和位置，可以鉴定蛋白质的分子量和等电点，从而确定蛋白质的特征。
红色红曲菌蛋白质组双向凝胶电泳体系的建立
红色红曲菌蛋白质组双向凝胶电泳体系的建立红色红曲菌（Monascus ruber）是一种重要的微生物资源，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
为了深入研究红色红曲菌的蛋白质组，建立了一种双向凝胶电泳体系。
双向凝胶电泳是一种常用的分离和鉴定蛋白质的方法，可以根据蛋白质的分子量和等电点进行分离。
该体系由等电聚焦电泳（IEF）和SDS-PAGE两个步骤组成。
首先，为了获得具有较高分离能力的等电聚焦电泳胶，优化了等电聚焦电泳胶的配方。
通过调整凝胶中缓冲液、表面活性剂和聚合物浓度等参数，得到了最佳的等电聚焦电泳胶配方。
此外，还优化了蛋白质样品的制备方法，以提高蛋白质的溶解度和稳定性。
其次，为了实现蛋白质的二维分离，采用了SDS-PAGE作为第二个步骤。
在这个步骤中，使用聚丙烯酰胺凝胶作为分离媒介，根据蛋白质的分子量进行分离。
优化了SDS-PAGE胶的配方和电泳条件，以获得最佳的分离效果。
通过这种双向凝胶电泳体系，成功地分离和鉴定了红色红曲菌中的蛋白质。
利用质谱分析等技术，进一步鉴定了其中一些蛋白质的功能和结构。
这为深入了解红色红曲菌的代谢途径、抗氧化机制等提供了重
要的实验基础。
总之，红色红曲菌蛋白质组的双向凝胶电泳体系的建立为研究其蛋白质组成和功能提供了有效的手段。
这一体系的建立不仅有助于深入理解红色红曲菌的生物学特性，还为其在食品工业、医药领域的应用提供了基础。
蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳
(4)c. 图像分析及数据处理(3)经活检及病理证实，有 12 条为扩张型心肌病特有的蛋白。
(6)RA 和 OA ：类风湿关节炎 (RA) 是一种常见的慢性炎性关节疾病，本病侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症，细胞侵润，血管翳形成，软骨及骨组织侵蚀，导致关节结构的破坏，功能丧失。
而骨性关节炎 (OA) 其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性，破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一系列的关节症状和体征。
有研究者对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较 RA 与 OA 成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS) 蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，结果显示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化较 OAFLS 明显增多，其中以相对分子质量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 4227672 ± 8947 ，OAFLS 为 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度扫描值约为 OAFLS 的 6.5倍，两者具有非常显著性差异 (T= 2.820 ， P<0.01) 。
1980 年 Hunter 首先发现酪氨酸激酶 (PTK) ，许多生长因子受体都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因产物也具有 PTK 活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。
1992 年，Williams 等研究发现， RA 滑膜细胞中的 PTK 活性远远高于 OA ，这可能是导致 RA 滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键，作者推测RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突变，或多种生长因子受体的持续激活，从而导致转化细胞的外观表现并伴有 PTK 活性的增高。
双向电泳法问题回答
双向电泳法双向电泳法是一种用于分离蛋白质的方法，它可以将复杂的蛋白质样品划分成更小、更简单的部分。
通过该方法，人们可以更深入地研究蛋白质的结构、功能以及表达。
双向电泳法包括两个主要步骤：等电聚焦和SDS-PAGE。
等电聚焦利用电场的不同电势将蛋白质分离成在不同等电点停留的充电种类。
这些蛋白质将从水面通过凝胶的毛孔流动到其他场中。
最外部的电极会使凝胶中的这些蛋白质向相反方向移动，然后再进行SDS-PAGE步骤，通过蛋白质的大小来将它们分类。
尽管双向电泳法已经存在了很长时间，但它仍然是生物学研究人员中非常受欢迎的技术之一。
它可以用于各种样品，如人类组织、细胞培养物、微生物以及植物，这些样品都可以用来进行不同范围和实验室需求下的研究。
相比于其他蛋白质分析技术，双向电泳法具有许多优点。
例如：1. 高解析度。
双向电泳法可以将复杂的蛋白质混合物分离成百上千的谱带。
这使得研究人员可以在不同的谱带上针对不同的蛋白质进行研究。
2. 对小分子靶标进行优化。
一些较小的蛋白质，像激素和细胞因子，往往不能被其他分离技术轻易捕捉。
双向电泳法可以确保在凝胶中打出一个小谱带，并通过调整电泳参数来使这些小蛋白质也可以被检测到。
3. 无需标记。
使用双向电泳法，不需要先对样品进行标记，因为样品中的蛋白质被用电势和电压从样品移动到凝胶上。
虽然双向电泳法已经成为了研究蛋白质及蛋白质体系结构的主要方法，但是其也带来了许多挑战。
其中最重要的是凝胶表面的不均匀性，以及分子的截断现象。
凝胶表面的不均匀性会影响蛋白质的分离，而分子的截断现象则意味着某些蛋白质的片段可能比完整的蛋白质更容易被检测到。
总的来说，双向电泳法是对蛋白质研究进行更深入了解的重要工具。
它提供了高分辨率、高通量和无需标记的优点，仍在各种研究领域广泛应用。
随着基因和蛋白质测序技术的快速发展，相信它也将在不远的将来得到不断地改进和提升。
双向电泳的原理及其应用
双向电泳的原理及其应用1. 原理介绍双向电泳是一种在电场作用下将带电物质分离的技术。
它结合了传统的垂直电泳和水平电泳的优点，具有更高的分辨率和更好的样品分离效果。
双向电泳的原理基于两个关键因素：电场和凝胶。
首先，一个电场被建立在凝胶中，在两个方向上产生不同电位的电极驱动电荷的移动。
随着电荷在凝胶中的移动，带电的分子将根据其大小和电荷性质在凝胶中定位。
最终，分子将在凝胶中以特定的纵向和横向位置分离出来。
2. 双向电泳的步骤和操作双向电泳通常包括以下步骤：凝胶制备•准备凝胶材料（如聚丙烯酰胺凝胶）和所需的试剂。
•根据实验要求配置凝胶，将其倒入制备好的电泳室中。
•静置凝胶，等待其完全固化。
样品预处理•准备待测的样品。
•将样品溶解在适当的缓冲液中，以保持稳定的pH值和离子浓度。
•可根据需要，进行样品的预处理，如蛋白质的变性处理或DNA的限制酶切。
电泳操作•将样品加载到凝胶孔中。
•连接电极并注入电泳缓冲液。
•开启电源，建立电场，让电荷物质在凝胶中移动。
•根据需要，定时监测电泳进程。
凝胶染色和分析•停止电泳，拆下电泳装置。
•染色凝胶以增强待测物质的可视性。
•可通过分析软件对凝胶图像进行分析，定量检测分子的大小和浓度。
3. 双向电泳的应用领域双向电泳在许多生物科学领域得到了广泛的应用。
以下是一些常见的应用案例：1) 蛋白质研究双向电泳是研究蛋白质组学的重要技术。
它可以用于比较分析不同样品中蛋白质的表达差异，从而研究细胞过程和疾病发展的机理。
2) DNA分析双向电泳可用于DNA测序和DNA碎片的大小分析。
通过将不同长度的DNA片段与已知标准进行比对，可以确定目标DNA的大小，并推断出其序列。
3) 基因突变检测双向电泳可以帮助科研人员检测基因突变。
通过比较正常和突变样本中DNA片段的移动距离，可以确定是否存在基因突变，并进一步研究与其相关的遗传疾病。
4) 药物研发双向电泳可以用于药物研发中的蛋白质药代动力学研究。
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
转印至膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
第八课双向凝胶电泳-精品文档
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基 团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂 Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、 OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还 原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷 的三丁基膦（TBP）进行还原。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的 低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋 白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响 分离。现常用预分级＋窄 pH 胶的微制备 技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质 组亚群，再用 pH 梯度小于 2 个 pH 单位的 IPG胶进行窄pH范围的分离。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
• 是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。 • 溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质 复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽 的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物 可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单 个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必 须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和 核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品 在电泳过程中保持溶解状态。
蛋白检测篇6-双向凝胶电泳
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：。
双向电泳的操作步骤
双向电泳的操作步骤一、第一向等电聚焦1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液,置室温溶解。
2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。
3、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。
在槽两端各1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡。
否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。
5、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
确保胶条与电极紧密接触。
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。
同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
6、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
7、对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
8、聚焦结束的胶条。
立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
二、第二向SDS-PAGE电泳1、配制10%的丙烯酰胺凝胶两块,从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
2、配制胶条平衡缓冲液I。
3、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。
这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
4、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。
将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
5、配制胶条平衡缓冲液II。
6、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。
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第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration）
第二向 SDS 电泳（SDS-PAGE）
检测染色（Detection/Staining）
1
第一章 样品制备（Sample Preparation）
1.1 一般性原则：
样 品 制 备 是 双 向 电 泳 中 最 为 关 键 的 一 步， 这 一 步 处 理 的 好 坏 将 直 接 影 响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法 ，尽管处理方法是多种多 样， 但都遵循几个基本的原则：1 ）尽可能的提高样品蛋白的溶解度 ，抽 提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3 ） 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状 态。
目录
第一章 样品制备
2
1.1 一般性原则
2
1.2 样品制备程序
3
1.2.1 培养细胞样品处理方法
3
1.2.2 组织样品处理方法
3
1.2.3 文献报道较多的裂解液配方
4
第二章 第一向等电聚焦（IEF）
7
2.1 IPG 胶条的水化和电泳
7
2.1.1 仪器
7
2.1.2 试剂
7
2.1.3 实验步骤
7
2.2 IPG 胶条的平衡
3
三氯醋酸 －丙酮沉淀法（ TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总 蛋白程序：
（1） 在液氮中研碎叶片； （2） 悬浮于含 1 0％三氯醋酸 （ TCA）和 0.07% ß- 巯基乙醇( 可用 D T T
替代)的丙酮溶液在－20 oC 的冰浴； （3） 让蛋白质沉淀过夜然后离心（ 4oC，4 0 , 0 0 0 g , 1 h）， 弃上清 ； （4） 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的 冰预冷丙酮溶液里 ； （5） 离心（4 oC，40,000g, 1 h） 后真空干燥沉淀； （6） 用（A）或 （B）裂解液溶解沉淀 ，离心 （4oC ，40,000g, 1h）。 （7） Brandford 法定量蛋白 ，然后分装至 Eppendof 管里保存在-78oC
温振荡 1 h， 使其充分溶解 ； （5） 4oC，40 ,000g， 离心 1 h； （6） 吸取上清并用 Brandford 法定量蛋白，然后分装至 Eppendof 管里
保存在-78oC 备用。
1.2.2 组织样品处理方法 ：
对大多数 从动物或植物组织里提取总蛋白质而言 ，同样没有一种通用 的程序 。但遵循的原则基本相同 。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法 。
根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂 (chaotropes), 主要包括尿素（ Urea ）和 硫 脲（ thiourea）；表面活性剂 （sufactants）， 也称去垢剂，早期常使用 NP -40 、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年 较多的改用如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂 （reducing agents ）， 最常用的是二硫苏糖醇 （D T T ）， 也有用二硫赤藓 糖醇（DTE ）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入 Tris-base,蛋 白 酶 抑 制 剂 （ 如 EDTA 、 PMSF or Protease inhibitor cocktails ） 以及核酸酶 。
核酸的去除可采用超声或核酸 酶处理，超声处理应控制好条件，并防 止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上 。脂类和多 糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以 采取凝胶过滤或沉淀 /重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。
因此， 处理方法必须根据不同的样品 、所处的状态以及实验目的和要 求来进行选择。
其他常用的裂解缓冲液如下： (B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor; (C) 加入 0.3 -1% SDS 在 95 oC 煮样品 5mins ，冷却后加入至少 5 倍体积的（A）或（B）裂解液。
2
1.2 样品制备程序：
1.2.1 培 养 细 胞（ culture cell） 样品处理方法 ：
培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接 加入裂解缓冲液 （Lysis buffer）抽提总蛋白 。裂解缓冲液有多种配方， 本实验室主要采用如下成份：
(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（ w / v）CHAPS ，40mM Tris- Base ， 40mM DTT，2 ％ Pharmalyte pH 3-10.
总蛋白抽提程序：
（1） 培养细胞的收集； （2） 用磷酸缓冲液（PBS ）洗 细 胞 3 次（室 温，1000g， 各 2 m i n）； （3） 将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的 PBS； （4） 加入裂解缓冲液 （1.5x106 个细胞大约加入 100µL 裂解液 ）， 在室
9
2.2.1 仪器
10
2.2.2 试剂
10
2.2.3 实验步骤
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第三章 第二向 SDS 电泳
12
3.1 垂直 SDS-PAGE
12
3.1.1 溶液
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3.1.2 灌胶步骤
12
3.1.3 电泳步骤
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第四章 2-DE 胶蛋白质点的检测
15
4.1 考马斯亮兰染色
15
4.1.1 经典的考马斯亮兰染色程序
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4.1.2 Neuhoff 胶体考染法
15
4.1.3 热考马斯亮兰染色及二次染色法
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4.2 硝酸银染色
16
Appendix I Troubleshooting
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Appendix II Solutions
23
2DE 分析流程：
样品制备（Sample preparation）
固相 pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration）
样 品 的 来 源 不 同， 其 裂 解 的 缓 冲 液 也 各 不 相 同 。 通 过 不 同 试 剂 的 合 理 组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。 在对样品蛋白质提取的过程中，必 须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质 ，比如核酸、 脂、 多糖等大分子以及盐类小分子。 大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过 高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 I P G 胶条 ；这样都会造成 2 -DE 的 失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。