中药与天然药物体内代谢的研究方法综述

中药与天然药物体内代谢的研究方法综述

摘要：

传统中药和天然药物及其制剂大都以口服和静脉注射给药为主，经过胃肠道和肝脏等的代谢，其直接发挥药效作用的化学成分和给药前药物中的化学成分相比，往往有显著的差异，药物的药效很可能是通过原形药物与代谢产物共同作用的结果。因此，对中药药效物质基础研究，和体外研究法相比，体内代谢法显得尤为重要。

药物的体内代谢研究是指在动物或人给药后，于不同的时间收集血液、尿液、胆汁或粪便等生物样品，运用HPLC、LC-MS等分析方法从这些样品中寻找代谢产物，并对其进行分析、分离和鉴定，确定药物在体内的代谢途径。因该方法考虑到各种体内因素对药物的影响，能够真实全面地反映体内药物代谢的整体特征，所以在阐明中药发挥药效机制的研究中应用广泛，本文就中药及天然药物体内代谢研究的基本方法作简要综述。

1 血清与血浆药理学

在药理学实验中，为了验证和评价药物的抗菌等疗效，往往运用含药血清对有效药物或药物的有效成分进行初步筛选，为探讨中药有效成分发挥药效的机制研究奠定基础。

1.1 含药血清的制备

1.1.1 给药量与含药血清作用强度关系

含药血清的血药浓度真实地反映了当时机体的血药浓度，在其它条件一致的情况下，主要与给药剂量有关，在一定范围内，给药剂量越大，进入血液循环的药物就越多，当然含药血清的药理作用就越强，但并非剂量越大越好，它亦受含药血清浓度的制约。抑菌试验一般以“通法”制备血清，即每天给药2次，连续3天，末次给药一小时后采血，具体情况要根据实验动物及药物而定。（中药血清药理学方法的研究现状）

刘建勋, 韩笑等人用不同剂量的双参通冠方给大鼠灌胃后采集血清，进行缺氧复氧实验，以LDH释放抑制率为指标，探讨了含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系，研究发现，体内给药量大所获得的药物血清其LDH释放抑制率并不一定高, 二者之间无明显量效关系。（含药血清药理作用强度与体内给药的量效、时效关系研究）

1.1.2 采血时间的确定

在采用血清药理学方法进行试验前，进行时效关系研究是必要的，以找出给药后采血的最佳时间，这样可以避免由于药效物质被代谢减少殆尽或尚未吸收造成的假阴性结果。

周明眉等人对最佳采血时间和时效关系进行考察，头风饮(TFY)对含药血清抑制血小板释放5-HT及阻滞内皮细胞钙通道作用最强时间的研究，得出最佳采血时间为30min，最佳采血时间要根据药物的不同具体而定。（中药血清药理学的方法学研究——采血时间的确定及时效关系研究）

1.1.3 血清预处理方法的研究

血清药理学的研究处于不断的发展中，含药血清的预处理是一项亟待解决的问题，不同的药物根据其水溶性的不同，血清预处理方法也存在很大区别。

余黎，王坚等人对坤血安含药血清分别进行加热处理、醇沉、加热后再醇沉、醇沉后再加热等处理方法，探讨不同处理方法对小鼠离体子宫的影响，发现以加热后再醇沉及醇沉后再加热2种方法所处理的血清对离体子宫的干扰最小,且对药物作用影响不大。（中药血清药理学研究中血清处理方法的探讨）周芝兰等人也进行了乙醇、丙酮、甲壳素及素及56℃灭活处理的血清抗Ach和抗His活性的研究。（中药血清药理学的方法学研究——含药血清低温保存和血清灭活的影响）

1.2 抑菌试验

含药血清参与体外抑菌试验时,血药浓度被稀释,可能出现假阴性结果，张红敏等人总结出三种可行方案：增加给药剂量、不增加给药剂量而增加血清添加量、采用血清冻干粉。（含药血清体外药理试验的评价）

梅林等采用平板法测试含金银花药物成分的血浆和含药血清（灭活和未灭活）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力，结果显示含药血清和含药血浆对二种菌均有较强的抑菌作用，且含药血清灭活与否不影响其MIC和抑菌活性。（血清中药指纹图谱的研究及应用）

1.3 血浆药理学的发展

血清药理学最早是由日本学者田代真一于1984年提出的（田代真一，“血清药理学”、“血清药化学”.现代东洋医学，1992，l3(1)：113～1l7.），近几年来，随着研究的不断深入，葛金文、贺蓉等人对血清药理学实验提出质疑，他们发现血清实验中干扰项较多，存在着严重的缺陷，进而导致实验结论不一定可靠，在抗凝剂不干扰检验结果的前提下，血浆药理学方法能较好的反应血中药效成分的变化。（关于中药血清药理学方法的再思考）。

2 代谢指纹图谱学

对给药后出现在动物血浆中的中药成分和代谢产物及其消长过程进行的研究即代谢指纹图谱研究，是阐明中药药效成分作用机理的基础。中药作用的物质基础的研究长期以来一直采用体内外特别是体外活性筛选跟踪活性物质的分离提取，忽略了出现在体内的其它成分对活性成分药效作用的潜在影响，而代谢指纹图谱的研究可以全面的了解药效成分及其它辅助成分的全面情况，为中药药效物质基础的客观阐述提供依据。（常用中草药的代谢研究）代谢指纹图谱学的研究思路是：对中药提取物中的有效成分、空白血清、含药血清中的有效活性成分分别进行研究，得到三组药物有效活性成分的中药指纹图谱，通过比对，可以反映药物在体内产生药效后，生物活性成分发生改变的情况，进而采用先进的分析、分离方法对各色谱峰进行成分指认，进一步阐明中药在体内发挥药理作用的药效成分及具体代谢过程和途径。

梅林等在建立金银花色谱指纹图谱的基础上，应用血清药物化学方法，通过比较金银花药材提取液、给药及未给药家兔血清的色谱指纹图谱，筛选、研究金银花的活性成分及其作用机理，得出服用金银花药材后，药效成分绿原酸在其血中转移能力较差;并获得了葛根的MEEKC指纹图谱、HPLC指纹图谱和葛根血清药物化学指纹图谱，推断出葛根中的葛根素在体内吸收后，血中转移能力较差。（血清中药指纹图谱的研究及应用）

张金兰等首先采用HPLC-UV和HPLC-MS分析技术建立了丹参注射液中化学成分的指纹图谱分析方法，并对指纹图谱中11个主要共有色谱蜂进行了指认；然后研究了大鼠静脉注射丹参注射液后，血液中丹参注射液化学成分的代谢指纹图谱，结果表明除原儿茶醛外，其它成分均出现在血液中，丹参素及丹酚酸B消除较快，丹酚酸D、紫草酸、丹酚酸A在血中维持时间较长，其药理活性值得深入研究，同时也提出丹参注射液的质量控制仅以丹参素和原儿茶醛为指标，不够全面，还有待完善。（常用中草药的代谢研究）

将传统中药指纹图谱进一步向生物指纹图谱方向发展，揭示中药血清药理学谱效关系，即从某种程度上说明血清指纹图谱与药物效应之间的相互关系。通过图谱与药效的联系，阐明色谱中群体指纹峰与整体疗效的关系，将中药指纹图谱的“色谱化学特征”推进到“色谱药效表观特征”，进而达到“谱效结合”，这可能是今后的研究方向。（血清中药指纹图谱的研究及应用）（中药血清指纹图谱研究与应用展望）

3 代谢组学代谢组学及其研究方法和应用？

代谢组学(metabonomics) 方法, 由Nicholson等[1]（Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E.‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data [J]. Xenobiotica, 1999,29: 1181?1189.）最先提出, 主要利用高分辨核磁共振(nuclearmagnetic resonance, NMR) 或现代质谱技术, 对生物体液的内源性代谢产物进行测定, 结合模式识别等数值分析方法, 分析探讨机体在各种状态下的代谢表型,高通量、全景式、直观地研究生物体在生理、病理以及药物和毒物作用下发生的各种代谢动态变化, 从而有助于发现外源性物质作用的靶器官和靶点, 揭示其作用机制, 进而确定与之相关的生物标记物。（NMR 代谢组学法研究大蒜辣素对大鼠的作用机制）。

目前中药的代谢组学研究主要包括：单一活性成分的代谢研究、有效部位的代谢研究、单味药及复方制剂的研究。（代谢组学及其在中药体内研究中的应用）

代谢组学研究步骤包括样品制备、代谢产物分离检测与鉴定、数据分析与模型建立几个个部分。其研究样品主要是尿液、血浆或血清、粪便、胆汁以及肝脏等组织。（代谢组学与中医药现代研究）

3.1 分析样品的制备与富集

给药途径（灌胃、尾静脉注射及腹腔注射、肝脏等体外匀浆）

3.1.1 分析样品的制备

中药在体内发生代谢的部位主要是胃肠道、肝肾脏等组织器官，根据药物和研究内容的不同，可以选择适当的给药途径，最常用的给药方式为灌胃和尾静脉注射，除此之外，也偶见腹腔注射（LC/MS分析大鼠体内氧化苦参碱及其主要代谢物）和皮下注射给药，当然也可通过离体实验的代谢研究方法制备分析样品，陈怀侠等人（液相色谱2串联质谱法分析樟柳碱大鼠肝匀浆代谢产物）将樟柳碱与大鼠肝匀浆在富氧条件下温孵，采用LC-MS法在樟柳碱的大鼠肝匀浆培养液中鉴定出了2种代谢物。

不同类型的药物其在体内的代谢部位有所差异，如对于黄酮类化合物，段坤峰等（中药与天然产物中有效成分的体内代谢研究进展）指出，大部分经口服后，在胃肠道内即发生代谢、吸收，而对于静脉注射的黄酮类化合物，则主要在肝脏中发生生物转化。

针对代谢物的分离制备，在药物体内代谢动力学研究中，往往以血浆、尿液、胆汁、粪便及肝脏等组织为研究对象。肖兰（清开灵注射液中黄芩苷在大鼠体内代谢动力学的研究）等通过研究清开灵注射液中黄芩苷在大鼠体内的代谢动力学，发现静注清开灵后,对血样进行分析发现黄芩苷迅速分布至效应器官肺、肝中,黄芩苷为清开灵注射液的肝肺效应物质基础之一；张铁英（灯盏花素化学组成及在大鼠体内代谢研究）等采用ODS柱色谱法对灌胃灯盏花素后大鼠尿液中的代谢物进行分离，从中得到了几个代谢产物；李志（大鼠胆汁中β2榄香烯代谢产物的研究）等人采用质谱、核磁共振、红外、紫外分析法对静注β-榄香烯后大鼠胆汁样品进行分析，确定了一个代谢产物，说明β-榄香烯在体内存在生物转化过程；王俏（天麻素在大鼠脑、肝、肾及脑不同区域组织匀浆中的代谢研究）等采用体外匀浆孵育，高效液相法测定天麻素代谢物，研究发现天麻素在非酶体系中稳定，在肝、肾、脑组织匀浆中天麻素可被代谢为天麻苷元。

3.1.2 分析样品的富集

代谢产物包括Ⅰ相、Ⅱ相和Ⅲ相代谢产物, Ⅰ相反应主要由细胞色素P450 (CYP)催化；Ⅱ相反应即结合反应,除与葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽结合外，还有甲基化、N-乙酰化、氨基酸结合等；Ⅲ相反应是通过结合反应使药物变为水溶性，提高其与毛细血管膜转运的亲和性，易排泄到胆汁（中药药物代谢研究概述）。在样品的富集过程中，要特别注意保存条

件，特别是二相代谢物，如某些葡萄糖醛酸和硫酸结合物在样品中很不稳定，易发生降解；一些在碱性条件下不稳定的代谢产物，会因尿液放置时间过长，PH值升高，发生转化。通常对代谢物样品可采用冷冻或冷藏保存（浅谈中药成分体内代谢研究）。

3.2 代谢产物的分离制备

代谢物极性跨度大，一、二相代谢物，通过萃取，再制备液相。

液液萃取、固相萃取、直接沉淀去蛋白、固相微萃取、搅拌棒吸附萃取

3.3 代谢产物的检测与鉴定

3.4 数据分析与模型建立

代谢产物的检测

采用反相HPLC 结合二极管阵列检测器, 便于在较广泛的色谱峰中搜寻可能出现的代谢物, 而且,药物代谢转化成代谢物后, 一般是水溶性增大, 在HPLC 分析过程中, 代谢物峰保留时间在原型药峰之前, 用原药色谱峰作为分析过程结束的指标, 易于判断。由于药物代谢转化多数是对母体结构的修饰,未改变原核的骨架, 不影响药物分子的整个光谱波形。采用二极管阵列检测器在线检测, 可在样品分析过程中同时进行多波长检测, 记录色谱峰的紫外图谱, 用计算机对所出现色谱峰的紫外光谱进行比较、分析, 再配以相应的空白对照试验, 可较快地确认代谢物的色谱峰及纯度, 如五味子醇甲、海南粗榧新衍生物HH07A 的代谢研究。

电喷雾质谱(ES I2M S) 对于代谢物的检测和结构的确定是一有用工具。采用多级串联质谱M S n ,可选择分子、离子进行裂解得到碎片质谱, 再选择碎片峰进行裂解, 如此反复可获得复杂分子的许多结构信息, 如对人参皂苷Rb1 的代谢研究就采用了ES I2M S 技术[21 ]。

但是体内代谢法的难度比较大，许多药物在生物体内的分布都比较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度都比较低，代谢产物的检测具有一定的难度