中国农业大学遗传学 09 基因工程和基因组学

EcoR I: 5’ 3’
GAATTC CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
3’ 5’
5’ 3’ Hind III:
AATTC G
G CTTAA
3’ 5’
AAGCTT 5’ 3’ TTCGAA
AAGCTT 3’ 5’ TTCGAA
5’ 3’
AGCTT
A
3’ TTCGA 5’
A
Pst I 5’ 3’ CTGCAG GACGTC G ACGTC CTGCAG GACGTC CTGCA G 3’ 5’
5’ 3’ Sma I 5’ 3’
3’ 5’
CCCGGG GGGCCC GGG CCC
CCCGGG GGGCCC CCC GGG
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
四、 载体（vector）
类型：质粒（含粘粒）、病毒（噬菌体）、 YAC、BAC、PAC 等 条件：
1. 具有复制原点（ori），在宿主细胞中能自我复制并带动 外源DNA复制，稳定保持。 2. 具有多克隆位点（MCS－multiple cloning sites ），即 有多种限制酶切位点，各种位点是唯一的，且与载体的 复制原点和标记基因位点无关。
Leabharlann Baidu
载有外源DNA 的金粉颗粒
（三）转基因动物
发展缓慢。 非病毒介导：显微注射、电穿孔 病毒介导电穿孔等 （四）基因治疗 概念：将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体 内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 分类：1、基因矫正 3、基因增补 2、基因置换 4、基因失活
第二节 基因组学
一、概念
1. 基因组（genome）：是指一个细胞全部的 DNA分
（1）T-DNA：左右边界之间的DNA序列。
a. LB和RB正向不完全重复，可以携带其间的DNA插入到 植物基因组中去 b. 致瘤基因－（CTK 基因）失去分化能力 disarm c. 冠瘿碱合成基因：其启动子 nos 可用。
（2）Vir区：控制 T-DNA 转移、整合
感染柳 树产生 冠缨瘤
2. Ri 质粒： 发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）中的质粒，可以诱发假根发 生。
第九章 基因工程和基因组学
第一节 基因工程
（一）基因工程的概念
1. 遗传工程 广义： 细胞工程 ------如体细胞、原生质体的培养与杂交 细胞器工程------细胞核的移植： 回交，克隆羊 染色体工程------整条染色体或染色体片断的切割或转移。 基因工程 狭义：基因工程 ：体外不经过有性繁殖，有目的地使DNA发生重 组的技术体系。故又称重组DNA技术。 2. 克隆（clone） n. 无性繁殖系：无性繁殖系，遗传物质来源和组成完全相同。 v. 获得无性繁殖系的过程－即获得某种特异DNA片段，并大量 扩增的过程。
– 带有可选择标记基因的载体：
标记基因：抗生素抗性基因等
载体：Ti、Ri质粒等。
Methods：
抽真空
（1）生物学方法：农杆菌介导
（2）物理方法：DNA直接吸收。
— 电穿孔法：（Electroporation）
— 去膜稳定性法（PEG，干燥） — 微注射法（Microinjection） — 基因枪法（Particle bombardment）
（2）特点 – 低拷贝数 – 可以容纳 300 Kb 的插入片段 – 可以蓝白选择 – 由于是一种质粒，所有容易操作 – 稳定 – 嵌合性低 （3） 应用： – 适合高度生物大基因组的克隆、作图
（二）转基因载体
1. Ti质粒： 根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）中的致瘤质粒 （tumor-inducing ，Ti）。 结构：
RNA-cDNA
5’ 3’ DNA聚合酶 5’ 3’ DNA连接酶 5’ cDNA（ds） 3’
2. 文库的筛选方法 （1）菌落杂交 （2）噬菌斑杂交 （3）其它方法（如 PCR 法基因芯片等）。 关键：杂交用的探针： DNA（荧光、放射性同位素标记） 蛋白质抗体
蛋白质
抗体*
基因芯片(Gene Chip, DNA Chip)，
AFLP：Amplified Fragment Length Polymorphism
SSR：Simple Sequence Repeats DNA
（三）人工合成基因 SOE-PCR： SOE：Splicing by using overlapped extension，重叠延伸 拼接。 20 / 100
又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定 位置在固相载体（玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素 膜、尼龙膜等）上很小面积内固定千万个核酸分子所组成 的微点阵阵列。在一定条件下，这些核酸分子可以与来自
样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片
段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信 号。 – 特点：无可比拟的高效、快速和多参量。 – 应用：基因克隆、基因表达分析、基因诊断等。
五、基因的分离与鉴定
（一）基因文库中分离
1. 文库种类： （1） 核基因组文库： （2） 染色体文库：单条染色体激光微切割连接载体文库 （3）cDNA文库： 3’ AAAAAAA 5’ mRNA
5’ TTTTTTTT 3’ AAAAAAA 5’ TTTTTTTT RNaseH 3’ AAAAAAA 5’ TTTTTTTT 3’ AAAAAAA 5’ TTTTTTTT 3’ AAAAAAA 5’ TTTTTTTT 逆转录酶 3’ 5’ 3’
r Tc
5. YAC（Yeast Artificial Chromosome）
（1）结构 来自酵母： 染色体着丝粒：CEN4
白赭
复制起始点：ARS1
选择基因：TRP－色氨酸合成基因 URA3－尿嘧啶合成基因
Ampr
Sup4（tRNAtyr）
来自嗜热四膜虫： 端粒：CEL
来自细菌：
复制起始点：Ori 选择基因：ampr 克隆位点： EcoRI （Sup4） 填充序列：His 3
3. 有可以作为重组DNA分子筛选的标记基因。至少一个，
寄主没有这种基因。 4. 容易从寄主中分离回收。
常见的载体
（一）克隆载体
1. 质粒（plasmid） pBR312－缺点：拷贝数低 承载量小：3-4 Kb pUC19 －a. 本身较小：2.6－2.7kb，
可插入5-12Kb
b. 高拷贝数：500 c. 可以 LacZ 基因蓝白斑筛选（蓝斑不一定没有插 入，但白斑一定有插入） IPTGLac Z表达X-gal分解蓝色
（二）聚合酶链式反应（PCR）扩增基因
PCR：Polymerase Chain Reaction －聚合酶链式反应
Taq 酶：嗜热杆菌中提取，72C活性最高，94 C半衰 期达到近半小时。 94 C 变性 ＋ 35~65 C 复性 72 C 延伸 ＋ n 个循环扩增2n
常见基于PCR的分子标记： RAPD：Random Amplified Polymorphism DNA
2. 噬菌体（ phage）
（1）EcoR I 酶切 左： 头、 尾 右： 复制、裂解。 中间：去除不影响繁殖、裂解等。 （2）易操作、阳性克隆多 （3）承载15-23 kb 3. 粘粒（柯斯质粒－cosmid）
（1） 结构： 噬菌体cos＋质粒ori 既可以包装成噬菌体，又可以在细菌中大量复制。 （2） 承载：～50 kb 克隆真核生物的基因、作图。
二、基因工程的内容与步骤
基因组DNA cDNA mRNA
机械或者限制性内切酶切割
DNA片段（包括某目的基因的片段） 将DNA片段连接到载体 重组DNA分子
导入到合适的受体细胞，重组DNA分 子在受体细胞中增殖。
筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞
鉴定出带有目的基因片段的克 隆，回收、纯化、分析该片段。
3. 阳性克隆的鉴定
（1）限制性酶图谱：
将阳性克隆DNA回收，用不同的限制 性内切酶酶切、电泳，再根据电泳片段拼
接整个DNA，并标示酶切位点。然后 与
分子标记（如 RFLP）对照。 分析方法： 单酶切：Not I
12.2 2.8
双酶切找共有带：Not I + Sal I 2.8 kb 与Not I 单酶切相同，说明 Sal I 是在 12.2 内有酶切点 另一个单酶切： 产生 10.2 ＋ 4.8 10.2 2.0 2.8
（4）基因组的进化 （5）构建基因组的转录图谱（Transcrptome） （6）基因组功能分析 （7）功能基因组 （8）代谢组 …………
二、遗传图谱的构建
1. 遗传图谱：生物的遗传性状或标记的连锁图，并定位到 染色体上。 性状标记：形态、生理等表型。 数目有限，不够用 分子标记：蛋白质标记（同工酶） DNA标记 2. DNA标记的类型： （1）RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）
Sal I Not I
（2）核酸分子杂交： a. Southern 杂交—— 检测某段特征 DNA 序列： DNA探针与DNA的杂交。 b. Northern杂交 —— 检测基因RNA表达水平 DNA探针与 RNA 的杂交。
（3）核酸序列测定：
Sanger（1977）双脱氧终止法：
dNTP（100）＋ddNTP（1） Gilbert（1977）化学法： （4）核酸序列分析： 利用计算机软件、互联网数据库以及搜索引擎，结合 实验对基因的功能进行预测和验证。
（2）特点 – 承载大：1000kb – 嵌合率高 – 插入片段不稳定 – 生长慢
–
–
操纵难
适合高等生物大基因组的克隆、作图
（3）应用：
6. BAC（Bacterial Artificial Chromosome）
（1）结构 – 最小的F 因子（因此是质粒）：7Kb
– 复制起始：Ori
– 控制拷贝数基因：repE – 质粒分配：parE、 parA、 parB – 选择性基因：Cmr – 多克隆位点
子，包括核基因组和细胞器基因组。 2. 基因组学（genomics）：
（1）global：所有基因及其产物（RNA和蛋白质）
（2）of high throughput：高通量 （3）dynamic：相互作用、代谢、生理等。
3. 基因组学研究内容：
（1）构建基因组的遗传图谱（genetic map） （2）构建基因组的物理图谱（physical map） （3）构建基因组DNA全序列（DNA sequencing）
六、基因工程的应用
（一）工业： 生产胰岛素、表皮 生长因子、生长素、干 扰素、基因工程疫苗。
（二）植物基因工程：
Requirements：
– 可再生植株的植物组织培养体系
– 带适当启动子的目的基因：
启动子：CaMV 35S 目的基因：抗除草剂基因（Bar）、抗虫基因 （Bt）、 作物品质、产量、果实成熟控 制基因等（ACC）、生物反应器
r
Ori－ 质粒复制原点，可以在细菌中扩增
SV40 Ori－噬菌体复制原点，可以在病毒中复制
cos－噬菌体包装 Neor－新潮霉素抗性基因
Ampr－氨苄霉素抗性基因
4. 穿梭载体（shuttle vector） （1）定义：能在两种不同生物中复制的载体。 一种：原核生物（E.coli） 一种：真核生物 （酵母） （2）结构： a. 复制原点：ori --------------------------------- E.coli ARS（自主复制序列）------- 酵母（2 ） b. 选择标记：两种宿主不同的标记。 酵母：URA3（尿嘧啶合成基因） 细菌：ampr、Tcr （3）应用： 在细菌中克隆基因 在酵母中表达。
转基因
Cos L
Cos R λ
Bam H I Sau 3A
gDNA (cDNA)
Cos L
Cos R
连接 重组DNA分子 体外装配 基因克隆 基因文库的构建
重组噬菌体感染E.Coli 基因文库 cDNA文库 筛选
+
质粒 酶切
连接
转基因
三、限制性内切酶
定义：限制性、内切酶 类型： I 型： 特异识别位点，但切割位点随机。需要ATP、 Mg2+等。基因工程中无用：EcoB; EcoK II 型: 特异识别位点和切割位点。只需Mg2+。 识别位点：回文对称序列（palindrome） 粘性末端：EcoR I Hind III：5’突出 Not I Pst I 3’突出 平头末端：Sma I