同种异体骨移植修复过程中转化生长因子表达的实验研究详解演示文稿

材料与方法
一、实验设计 本研究采用2×2×4三因素析因试验设计方法。 根据供受体间主要组织相容性抗原是否相配将实 验动物随机分为两个大组，即主要组织相容性抗 原相配组和不配组。各大组再随机分为两个处理 组，分别是新鲜异体骨移植组和冷冻异体骨移植 组。
表1：实验动物分组情况及处理
二、实验动物选择
1．骨组织形态计量分析
每张HE染色组织切片随机选取5视野，经计算机自动图像处理系 统计算新生骨组织密度。 新生骨组织密度=新生骨组织面积/总骨 面积。
2．TGF-β1原位杂交结果图像分析 将原位杂交组织切片随机选取 5个视野，经计算机自动图像处理 系统提取图中表达阳性信号彩色阈值，计算平均光密度值。
四、动物模型建立
LEW大鼠48只做为受体。0.6%戊巴比妥钠（5ml /kg）腹腔注射麻醉，腹卧位固定，左后肢前外侧切 口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，沿肌间隙分 离，暴露股骨中段，口腔科高速裂钻截骨， 造成股 骨干中段3mm×4mm大小的骨缺损模型。 将移植骨 正位植入后，逐层缝合伤口。
五、主要试剂
※ 主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植：
⑴ 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。
⑵ 术后第2周，移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间 隙有新生骨样组织出现；4-8周时，板层骨、编织骨掺杂 出现且位置表浅，髓腔内有残余骨小梁。
⑶ 移植骨周围、髓腔及移植骨-宿主骨间隙增殖、分化 的成骨细胞、间充质细胞内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳 性。
同种异体骨移植修复过程中 转化生长因子表达的实验研 究详解演示文稿
（优选）同种异体骨移植修 复过程中转化生长因子表达 的实验研究
本研究采用免疫组化和原位杂交方法，观察分析 同种异体骨移植修复过程中，术后时间、移植骨处 理以及供受体间主要组织相容性抗原是否相配等因 素对移植骨局部内源性TGF-β1表达的影响，旨在为 进一步研究异体骨移植愈合机理以及临床合理使用 重组生长因子提供实验依据。
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※ 主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植：
⑴ 移植骨边缘有骨吸收现象，骨内有死骨成分。
⑵ 术后2周，新生骨样组织出现； 4-8周时，板层骨、 编织骨掺杂出现，位置表浅，与移植骨整合不紧密，髓 腔内有残余骨小梁。
⑶ TGF-β1蛋白及mRNA表达主要定为于新生骨组织表 面的成骨细胞、间充质细胞内。
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图9
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图 9．术后4周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（IHC ×100） 图 10．术后4周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（IHC ×100） 图 11．术后8周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（IHC ×100） 图 12．术后8周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（IHC ×100）
※ 主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植：
⑴ 骨吸收活跃，且移植骨周围有大量多核巨细胞 浸润。
⑵ 术后2周， 移植骨边缘及髓腔内有少量新生骨 样组织出现；至8周时，新生骨组织很少，移植骨内 仍有大片均质状死骨。髓腔无再通迹象。
⑶ 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞 内TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。
图5
图6
图7
图8
图 5．术后1周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（ISH ×100） 图 6．术后1周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（ISH ×100） 图 7．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（ISH ×100） 图 8. 术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（ISH ×100）
TGF-β1免疫组化试剂盒及TGF-β1原位杂交试剂 盒（武汉博士德生物工程公司提供）。
六、观察方法
取材后组织标本以10%中性福尔马林固定48-72小时； 10%EDTA脱钙2周，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石 蜡包埋，5um连续切片，分别进行HE染色，TGF-β1免 疫组化染色及原位杂交检测。光镜下观察各组移植骨 修复情况。
将已判定为阳性的组织切片，随机抽样做空白对照， 以PBS缓冲液代替一抗或杂交液。其他步骤不变。以 空白对照实验的染色程度确定是否阳性, ≤空白实验 染色强度为阴性,>空白对照染色强度为阳性。阳性表 达以组织和/或细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为判断标 准。以乳腺癌标本作为阳性对照。
七、图像分析和统计学方法
选用健康、成年近交系LEW大鼠 （主要组织 相容性复合体单倍体型Rt.1l）和近交系DA大鼠 （主要组织相容性复合体单倍体型Rt.1a），雄 性，体重270-320克。 北京大学医学部实验动物 中心提供。
三、移植骨的制备
LEW和DA大鼠各12只做为供体。无菌条件下取其双侧股骨， 除去骨髓及附着软组织， 修剪成3mm×4mm形状规则的半管 状皮质骨块，0.9%氯化钠注射液反复冲洗。 将其中24块皮质 骨（LEW、DA大鼠股骨各12块）装入双层无菌血浆袋中，热 压封口，置入-20℃低温冰箱中冻存2周， 制成冷冻异体骨， 植入前浸于30-37℃的0.9％氯化钠注射液中复温30分钟。 将另 外24块皮质骨做为新鲜异体骨，在2小时内植入受体。
图1
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图1．术后2周，主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植（HE ×100） 图2．术后2周，主要组织相容性抗原相配的冷冻异体骨移植（HE ×100） 图3．术后2周，主要组织相容性抗原不配的新鲜异体骨移植（HE ×100） 图4．术后2周，主要组织相容性抗原不配的冷冻异体骨移植（HE ×100）
以上数据统计学处理采用SAS软件，进行 2×2×4析因方差分析。
数据以均数±标准差表示，P﹤0.05有显著 性差异。
结果
一、组织学观察
※ 主要组织相容性抗原相配的新鲜异体骨移植：
⑴ 骨吸收不明显，死骨含量少。 ⑵ 术后1周，移植骨表面、髓腔及移植骨-宿主骨间隙 有新生骨样组织生成；2周时，移植骨浅表处生成编织骨； 4周，板层骨与编织骨掺杂出现； 8周，板层骨排列整齐 与移植骨紧密地整合在一起，髓腔再通。 ⑶ 上述部位增殖、分化的成骨细胞、间充质细胞内 TGF-β1蛋白及mRNA表达阳性。