第十一章 荧光分析法复习过程
第十一章荧光分析法复习过程
第十一章 荧光分析法、选择题1．荧光分析法是通过测定 ( ) 而达到对物质的定性或定量分析。
A 、激发光 D 、散射光2．下面 ( )分析方法不属于分子发射光谱法。
3．荧光发射光谱含有 ()个发射带。
A 、 1B 、 2C 、 3 4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是()A 、 荧光光谱的形状与激发光的波长无关B 、 荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C 、 荧光光谱属于分子的受激发射光谱D 、 荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合 5．下列叙述错误的是()A 、 荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B 、 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C 、 荧光光谱的形状与激发光波长无关D 、 荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激 发三重态， 再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级， 然后发出光辐射跃迁至基态的各个振 动能级，这种光辐射称为 ()。
A 、分子荧光B 、分子磷光C 、瑞利散射光D 、拉曼散射光 7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A 、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B 、振动弛豫属于无辐射跃迁C 、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动 能级D 、振动弛豫是产生 Stokes 位移的原因之一 8．荧光寿命指的是 ( )。
A 、 从激发光开始照射到发射荧光的时间B 、 受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C 、 从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D 、 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的 1/e 所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是()A 、 具有长共轭的 n~ ；跃迁的物质具有较大的荧光效率B 、 分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C 、 顺式异构体的荧光效率大于反式异构体 学习资料D 、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同 10．采用下列 ()措施可使物质的荧光效率提高。
第十一章 荧光分析法.ppt2
⑹磷光发射 激发态分子经过系间跨越到达激发三重态 后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态 (T1)的最低振动能级上，第一激发三重态分子 的最低振动能级上，第一激发三重态分子 经发射光子返回基态。此过程称为磷光。 经发射光子返回基态。此过程称为磷光。 磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T 磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T1→ S0) 属于“禁阻”跃迁， 属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要 长 的多，约为10 10s。所以， 的多，约为10-3s～10s。所以，将激发光从磷 光样品移走后，还常可观察到发光现象， 光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧 光发射却观察不到该现象。 光发射却观察不到该现象。
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁 该过程是激发态电子改变其自旋态， 该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。 重性发生变化的结果。 当两种能态的振动能级重叠时， 当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。 率增大。 S1→T1即是单重态到三重态的跃迁，即较低单 即是单重态到三重态的跃迁， 重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠， 重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠，这 种跃迁是“禁阻”跃迁。 种跃迁是“禁阻”跃迁。
⒉荧光发射光谱 通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定) 通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定) 波长所获得的荧光强度( 波长所获得的荧光强度(F)—发射波长(λem)的关 发射波长( 系的曲线为荧光发射曲线。 系的曲线为荧光发射曲线。 荧光光谱反映了在相同的激发条件下， 荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同 波长处分子的相对发射强度。 波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱可用于荧光物质的鉴别， 荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧 光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。 光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。
2014第十一章荧光分析法解析
A. 长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。 B. 分子的刚性越强，荧光强度越小。 C. 给电子取代基可导致荧光增强。 D. 吸电子取代基可导致荧光增强。
Cx
Fx Fs
F0 F0
C s
31
第三节 荧光分光光度计和分析新技术
滤光片荧光计 滤光片－单色器荧光计 荧光分光光度计
32
一、荧光分光光度计
1. 主要部件
源发光源（氙灯）、激发单色器、样品池、发射单色器、检测系统
荧光分光光度计结构示意图 1.光源
2、4、7、9. 狭缝 3.激发单色器
5.样品池 6.表面吸光物质 8.发射单色器 10.检测器 11.放大器 12.指示器 13.记录器
内部能量转换
当两电子激发态能量相差较小以致其振动能级有重 叠时，受激分子由高电子能级转移致低电子能级的 过程。
（振动失活在同样多重态间进行，如S2* S1*）
5
术语
外部能量转换 激发态分子与溶剂或其它溶质碰撞，以热能的形 式释放能量的过程。
体系间跨越 处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的 多重性发生变化的过程，如S1* T1*
率即为1/ f。
F t F 0 e Kt F 荧光强度
K 衰减常数
F f F0 / e F0e K f
1 / e e K f
K1 1
K 1 f
F 0 / F t e Kt e t / f ln F 0 t
Ft f
12
荧光效率
发射荧光的光子数
f 吸收激发光的光子数
物质的荧光效率在0～1之间，0.1～1时有分析价值。
第十一章 荧光分析方法
在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随着自 旋方向的改变，这时分子的两个电子的自旋方向 相同，自旋量子数都为1／2，总自旋量子数s等 于1，这时分子处于激发三重态(2s+1＝3)。 S0+hν→T1
6
激发单重态与激发三重态的区别：
激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 态分子是顺磁性分子；
激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 生，属于禁阻跃迁。
23
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系
能够发射荧光的物质同时具备两个条件：即有 强的紫外—可见吸收和一定的荧光效率。 1．长共扼结构 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂 环、因为芳香环和杂环分子具有长共轭的π—π* 跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度(荧光效率) 越大，而荧光波长也长移。
24
31
5．散射光
当一束平行单色光照射在液体样
品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光
子与物质分子相碰撞，使光子的运功方向发生
改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
光子和物质分子发生弹性碰撞时，发生能量
的交换，仅仅是光子运动方向发生改变，这种
散射光称为瑞利光。其波长与入射光波长相同。
32
光子和物质分子发生非弹性碰撞时．在光子 运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发 生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分 子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入 射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。 散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入 射光波长更长的拉曼光。
12
② 磷光(phosphorescence)发射：经过体系间跨越 的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动 能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活 一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出 光辐射，这种光辐射称为磷光。 T1→S0+hνp 磷光发射时间较长，约10-4-10s。 激发光停止后，磷光可持续一段时间。 电子由S0→T1为禁阻跃迁，需由S1经过体系间跨越 转化为T1。 同一分子的S1→S0 比T1→S0 的能级差大，磷光 的波长比荧光波长长
仪器分析课件12荧光分析法
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章荧光分析法.ppt
散射光干扰及消除
散射光：当一束平行光投射在液体试样上，大部分 被吸收或透过，小部分由于光子和物质分子相碰撞， 使光子的运动方向改变，而向不同方向散射形成的 光。
散射光包括瑞利散射光和拉曼光
瑞利散射光：无能量的交换，λ散射≈λ激发
拉曼光： 有能量转移， λ散射> <λ激发
干扰的消除
1）改变激发光的波长；
单色器1
样品池
单色器2
垂直方向
放大 与
记录
检测器
荧光仪特点
与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，
常用氙灯（波长： 250-700nm） C、激光光源 2 单色器
闪耀光栅
3 检测器 光电倍增管
5.弱荧光的芳香族化合物也可与荧光试剂作用生成 强荧光衍生物以提高测量灵敏度。
故药物中的胺类、抗菌素、维生素、甾体类均可 用荧光法测定。该法在体内药物定量分析中应用甚 广。
思考题
• 1.荧光和磷光在产生机制上有什么不同？
• 2.何谓荧光量子效率？哪些结构物质有较高荧光效率？
• 3.以下物质中可能有最强荧光的物质是（ ）。
6.（）荧光光谱形状与激发光的波长无关。
7. 荧光光谱的特征？
1. 所谓荧光，即指某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射 出比入射光( )。
A. 波长长的光线
B. 波长短的光线
C. 能量大的光线
D. 频率高的光线
2. 下列说法正确的是(
)
A 荧光发射波长永远大于激发波长
B 荧光发射波长永远小于激发波长
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
第十一章荧光分析法PPT学习教案
会计学
1
2021/8/18
荧 光 分 析 法 ：是基 于被测 物质的 荧光谱 线位置 及其强 度进行 的 分 析 方 法 （属于 发射光 谱法） 。 应 用 对 象 ： 一般是 能产生 强荧光 的分子 或某些 特定离 子 本章重点： （ 1） 分 子 荧 光产生 的过程 （2） 荧光与 分子结 构关系 （ 3） 分 子 荧 光定量 方法
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S 为 电 子 自旋 量子数 的代数 和(要 么为0要 么为1 )； S = 0 时 M=1， 此时电 子所处 的能态 为单重 态用符 号S表示 。 S = 1 时 M=3， 此时电 子所处 的能态 为三重 态用符 号T表 示。 平 行 自 旋 比 成对自 旋稳定 (洪特规 则)， 三重态 能级比 相应单 重态能 级低； 大多数 有机分 子的基 态处于 单重态 用S0表 示；
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它只能用来校正溶剂中的荧光物质，适合于不被荧光杂质 沾污的荧光化合物的直接测定。（3）采用试剂空白则更好 一些，由于试剂空白除含溶剂之外，还含有与标准及试样 溶液中相同浓度的各种试剂，因而它可以校正试剂中的杂 质所引起的吸收和发光，可用于间接测定法。（4）但这两 种空白都无法校正原已存在于试样中的基体和沾污物，有 时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合 物可特效地猝灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于 真实的空白溶液。如测VB2时用连二亚硫酸钠Na2S2O4
kEC
kP
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2.有机化合物分子结构与荧光关系
（ 1） 跃 迁 类 型：* → 的 荧 光效 率高， 系间跨 越过程 的速率 常数小 ，有利 于荧光 的产生 ； （ 2） 共 轭 效 应：提 高共轭 度有利 于增加 荧光效 率并产 生红移 （ 3） 刚 性 平 面结构 ：可降 低分子 振动， 减少与 溶剂的 相互作 用，故 具有很 强的荧 光。如 荧光素 和酚酞 有相似 结构， 荧光素 有很强 的荧光 ，酚酞 却没有 。 （ 4） 取 代 基 效应： 给电子 基 如 － NH2、 － OH、 － OCH3 使 荧 光 增 强 ，波长 长移； 吸 电 子 基 如 － NO2、 －F、－ Cl 使 荧 光 减 弱 或熄灭 。
[化学]荧光分析法
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3
第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第二节 第三节 荧光定量分析法 荧光分光光度计和其他荧光分析技术
4
第十一章 荧光分析法
第一节 荧光分析法的基本原理
第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一） 荧光的产生 1. 分子的能级与跃迁
物质分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级 室温时，多数分子处在电子基态最低振动能级（S0），当 受到一定辐射能的作用时，就会发生能级之间的跃迁。 基态(S0)→激发态(S1*、S2*、激发态振动能级)：吸收特 定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；（吸收） 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、 激发态寿命最短的途径占优势； （发射）
─(CH=CH)2─
φf =ห้องสมุดไป่ตู้.28 φf =0.68
21
─(CH=CH)3─
第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃
lex lem f
苯 205nm 278nm 0.11
萘 286nm 321nm 0.29
发射荧光的光子数 φf 吸收激发光的光字数
一般物质的f在0~1之间 荧光量子产率与物质吸收的能量以何种形式释 放有关，若能量都以无辐射跃迁形式释放，外转换 过程速度快，则不出现荧光发射。
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第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理
二、荧光与分子结构 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 1. 共轭效应 * → 跃迁 芳香族化合物、五元杂环上取代苯基 共轭程度越大,荧光效率越大，波长长移
21第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系跃迁芳香族化合物五元杂环上取代苯基共轭程度越大荧光效率越大波长长移chch028chch06822第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二荧光与分子结构二荧光与分子结构二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系ex205nm286nm356nmem278nm321nm404nm011029036维生素aex327nmlem510nm23第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系酚酞无荧光荧光黄1024第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系8羟基喹啉弱荧光红色荧光34苯并芘强荧光物质25第十一章荧光分析法第一节荧光分析法的基本原理二有机化合物分子结构与荧光的关系二有机化合物分子结构与荧光的关系取代基的作用给电子基增强荧光
第11章荧光分析法2012
顺式：非平面构型
反式：平面构型 强荧光体
非荧光体
40
• 3．取代基的影响：
• 第一类：-OH、-NH2、-OCH3等能增 加分子的π电子共轭程度，
f
化合物
↑，λem长移。
苯 苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
285~345 278~310 285~365 310~405 280~390
λ emmax (nm)
固定 ex 激发光波长
4800
4400
4000
3600
3200
2800
2400
2000
1600
1200 800 400
获得方法：先把第一单 色器的波长固定，使激 发的ex不变，改变第二 单色器波长，让不同波 长的光扫描，测定它的 发光强度，以I 为纵坐 标， em为横坐标得左 图，即荧光物质的发射 光谱
•
2. 比例法 在线性范围可选用比例定量法。
Fs F0 Fs F0 C s Cs 或 Cx Fx F0 Fx F0 C x
51
• •
3. 联立方程式法 对混合物在不同波长处，测F，利用F 的加合性联立方程求解。
52
第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术 • 一、荧光分光光度计 1.荧光光度计的主要部件
相对荧光强度
10
18
20
20
20
41
• 第二类：-NO2、-COOH、X-等吸电 子基团——减弱荧光。 • 第三类：-R、-SO3H——影响不大。
42
什么样的物质可以产生荧光呢？
• 两个条件： • 一、有强的紫外—可见吸收 • 二、有高的荧光效率 • 分子的长共轭或刚性共平面结构具有 高的荧光效率。
荧光分光光度法
11.1 概述
吸收
发射
热辐射
hν+基态 →激发态 →基态
光辐射
1、光致发光现象:
激发态电子回到低能级而伴随光的辐射
光致发光的分类：
磷光
X-射线荧光
光
原子荧光
荧光
原子 荧光
分子荧光 UV 荧光
光源
荧光:物质分子在激发态最低振动能级 返回到基态各振动能级时所发射出的光
2荧光分析法：利用物质的荧光谱线波 长和强度进行定性定量分析方法 。
2、温度 温度↗，碰撞机率↗ ，效率↘。热淬灭
3、 pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而 使其荧光效率受到影响。分子状态最强
OH NH+3
-
NH2 OH-
_ NH
H+
H+
pH 2
pH 7 ~ 12
pH 13
4、荧光熄灭剂：
引起荧光熄灭的形式：
①碰撞熄灭②化学反应淬灭③ 体系间跨越
自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生
最低能级，跃迁至基态而发生的光。
荧光\磷光产生过程：
磷光
基态→S1*→弛豫→跨越→T1*→T1V=0* →基态
基态→S2*→弛豫→跨越→S1*→S1V=0*→基态
荧光
二、激发光谱与荧光光谱
1. 荧光光谱(发射光谱):
激发波长λex和I0强度一定。F~λem
单色器
I0
I
λex
λem 单色器
表面吸 光物质
检测器
(1)不同强度的光照射物质所产生的荧光光 谱形状是否相同？ (2)不同波长的光照射物质所产生的荧光光 谱是否相同？ 答:光谱形状相同,强度I0和波长λex影响荧光强度 2、激发光谱：荧光λem不变;F~λeX F
第十一章 荧光分析法
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
第十一章 荧光分析法复习过程
第十一章荧光分析法一、选择题1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光B、磷光C、发射光D、散射光2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法B、荧光分析法C、磷光分析法D、化学发光分析法3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1B、2C、3D、不一定4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合5．下列叙述错误的是（）A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应C、荧光光谱的形状与激发光波长无关D、荧光波长大于激发光波长6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光B、分子磷光C、瑞利散射光D、拉曼散射光7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行B、振动弛豫属于无辐射跃迁C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
11章荧光分析法
引起荧光熄灭的原因如下：
（1）因荧光物质的分子与熄灭剂分子碰撞而损失能量。 （2）荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不 发光的配位位化合物。 （3）溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧 分子的顺磁性。，促进了体系间跨越，使激发单重态的 荧光分子转变至三重态。 （4）浓度大发生自熄灭现象。 荧光熄灭法： 利用荧光物质荧光强度的减弱和荧光熄灭剂的浓度 呈线性关系，测定荧光熄灭剂的含量的方法。
1) 振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶 剂分子的碰撞而将振动能量传递给溶剂分子，其电子返回到 同一电子激发态的最低振动能级的过程。 2) 内部能量转换：是当两个电子激发态之间的能量相 差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能 级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。 3) 荧光发射：分子由第一激发单重态的最低振动能级， 以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上， 这时发射的光量子称为荧光。
2、荧光光谱的形状与激发波长无关： 3、荧光光谱与激发光谱的镜像关系：
荧光光谱与激发光谱的镜像关系：
二、荧光与分子结构的关系
（一）荧光寿命和荧光效率 荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光 强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。 荧光效率：又称荧光量子产率，是指激发态 分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光 子数之比，常用φ表示。
F=Kc(荧光定量分析法的依据) 二、荧光定量分析方法
1、工作曲线法
2、比例法（对照法）
3、联立方程式法：用于多组分混合物的荧光分析 （同紫外法似）
第三节荧光分光光度计和其他荧光分析技术 一、荧光分光光度计
主要部件：
由激发光源、 激发单色器（置于样品前）和发射 单色器（置于样品后）、样品池及检测系统组成。结 构如下：
荧光分析法
基态时分子中的电子对填充在能量最低的轨道，
且自旋相反，即总自旋量子数s为0
电子能级多重性：M＝2s+1 单重态S M＝1 自旋相反 三重态T M＝3 自旋相同
4
基态
被激发跃迁过程中：
通常电子不发生自旋方向的改变,电子对自旋相反， 电子发生自旋方向的改变,电子对自旋相同，总自旋
总自旋量子数s为0,处于激发单重态。
第十一章 荧光分析法
（Fluorescence）
1
分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。
hγ
概述
M+ 能量 →M＊
M
2
分类
原子荧光 荧光 分子荧光 光致发光（PL） 紫外可见荧光 磷光 化学发光（CL） 红外荧光 X射线荧光 电致发光（EL） 生物发光（BL）
19
3）荧光光谱与激发光谱镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱
形状一样）成镜像对称关系
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振 动能级分布类似；
20
镜像关系?
固定em=620nm 固定ex=290nm (MAX)
IF
4 3 2 1
4800 4400
1→ 4 1→ 3
S1
4000
44
4.胶束增敏荧光分析 当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，
会缔合为球状胶束， 利用胶束溶液对荧光物质有
增溶、增敏和增稳的作用，对荧光物质进行保护
45
荧光分析法的应用 1.无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 2.生物与有机化合物的分析
分析化学第十一章荧光分析法
横坐标ex，纵坐标 发射光强度
fluorescence spectrum
横坐标em，纵坐标 发射光强度
溶液荧光光
谱的特征
Stokes shift 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
第十一章
荧光分析法
仪器分析
二、荧光与分子结构
第十一章
荧光分析法
仪器分析
三、影响荧光强度的外部因素
温度
溶剂
极性溶剂 溶剂粘度
pH值 荧光熄灭 散射光
荧光熄灭剂 荧光自熄灭
瑞利散射 拉曼上式
第十一章
荧光分析法
仪器分析
选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰
激 发 光（nm） 313 365 405 350 416 469 344 409 459 344 408 458 320 375 418 346 410 461
荧光寿命(f)和荧光效率 (f)
Ft = F0 e
f=
-t /f
F0 ln Ft
发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数
一般物质 f 0~1之间
第十一章
荧光分析法
仪器分析 刚性和共平面性 取代基
第十一章
荧光分析法
仪器分析
荧光试剂
荧光胺 Dansyl-Cl 邻苯二甲醛(OPA) 测定无机离子的荧光试剂
溶剂 水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
248 271 267 267 —— ——
436 511 500 499 450 502
第十一章
荧光分析法
仪器分析
第二节
荧光定量分析方法
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第十一章荧光分析法
一、选择题
1．荧光分析法是通过测定( )而达到对物质的定性或定量分析。
A、激发光
B、磷光
C、发射光
D、散射光
2．下面( )分析方法不属于分子发射光谱法。
A、紫外一可见分光光度法
B、荧光分析法
C、磷光分析法
D、化学发光分析法
3．荧光发射光谱含有( )个发射带。
A、1
B、2
C、3
D、不一定
4．下列关于荧光光谱的叙述错误的是（）
A、荧光光谱的形状与激发光的波长无关
B、荧光光谱与激发光谱一般是对称镜像
C、荧光光谱属于分子的受激发射光谱
D、荧光激发射光谱与紫外吸收光谱重合
5．下列叙述错误的是（）
A、荧光光谱的最长波长和激发光谱的最长波长相对应
B、荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应
C、荧光光谱的形状与激发光波长无关
D、荧光波长大于激发光波长
6．激发态分子经过振动弛豫回到第一电子激发态的最低振动能级后，经系间窜越转移至激发三重态，再经振动弛豫降至三重态的最低振动能级，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称为( )。
A、分子荧光
B、分子磷光
C、瑞利散射光
D、拉曼散射光
7．关于振动弛豫，下列叙述中错误的是( )。
A、振动弛豫只能在同一电子能级内进行
B、振动弛豫属于无辐射跃迁
C、通过振动弛豫可使处于不同电子激发态的分子均返回到第一电子激发态的最低振动能级
D、振动弛豫是产生Stokes位移的原因之一
8．荧光寿命指的是( )。
A、从激发光开始照射到发射荧光的时间
B、受激分子从第一电子激发态的最低振动能级返回到基态所需的时间
C、从除去激发光光源至分子的荧光熄灭所需的时间
D、除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1／e所需的时间9．关于荧光效率，下面叙述不正确的是（）
A、具有长共轭的π→π﹡跃迁的物质具有较大的荧光效率
B、分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大
C、顺式异构体的荧光效率大于反式异构体
D、共轭体系上的取代基不同，对荧光效率的影响不同
10．采用下列( )措施可使物质的荧光效率提高。
A、适当降低溶液浓度
B、降低溶剂极性
C、加入重氮化合物
D、剧烈搅拌
11．下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）
A、苯
B、联苯
C、萘
D、蒽
12．萘在下列( )溶剂中的荧光强度最强。
A、1一氯丙烷
B、1一溴丙烷
C、1一碘丙烷
D、1，2一二氯丙烷
13．苯胺在( )条件下荧光强度最强。
A、pH=1
B、pH=3
C、pH=10
D、pH=13
14．荧光素钠的乙醇溶液在( )条件下荧光强度最强。
A、0℃
B、-10℃
C、-20℃
D、-30℃
15．一般要在与入射光垂直的方向上观测荧光强度，这是由于( )。
A、只有在与入射光垂直的方向上才有荧光
B、荧光是向各个方向发射的，可减小透射光的影响
C、荧光强度比透射光强度大
D、荧光发射波长比透射光波长长
16．荧光法测定硫酸奎宁时，当激发光波长为320nm时, Raman光波长为360nm；当激发光波长为350nm时，Raman光波长为400nm。
若最大发射波长为448nm，则进行荧光测定时应选择( )。
A、λex=320m，λem=400nm
B、λex=320nm，λem=360nm
C、λex=350nm，λem=448nm
D、λex=320nm，λem=448nm
17．荧光分光光度计常用的光源是( )。
A、空心阴极灯
B、氙灯
C、氘灯
D、硅碳棒
18．用波长为320nm的入射光激发硫酸奎宁的稀硫酸溶液时，将产生320nm的( )。
A、荧光
B、磷光
C、Rayleigh光
D、Raman光
19．激发光波长和强度固定后，荧光强度与荧光波长的关系曲线称为（）
A、吸收曲线
B、激发光谱
C、荧光光谱
D、工作曲线
20．采用激光作为荧光光度计的光源，其优点是（）
A、可以有效消除散射光对荧光测定的干扰
B、可以提高荧光法的选择性
C、可以提高荧光法的灵敏度
D、可以避免荧光熄灭现象的产生
二、填空
1．荧光光谱的特征是--------、---------和-----------。
2.激发态分子经过--------回到第一电子激发态的最低振动能级后，以-----发射光量子跃迁回到基态的任一振动能级，这时所发射的光量子称为荧光。
3．荧光物质的------和--------是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的条件。
4．荧光物质的激发光谱可能含有-----吸收带，但其发射光谱却只含有------吸收带。
5．能够发射荧光的物质应具备的两个条件是：物质分子有强的------和---------。
------、--------
具有较高的荧光效率
三、简答题
1．哪些因素会影响荧光波长及强度?
2．在什么条件下荧光强度和荧光物质的浓度成正比?
3．分子结构与荧光的关系。
4．为什么在室温下溶液很少呈现磷光?在什么条件下才能检测到磷光?
5．为什么荧光分析法的灵敏度高于紫外一可见分光光度法?
6．哪些物质容易发生电子由单线激发态到三线激发态的体系间跨越？
7．荧光和磷光在产生机制上有何不同？
8．如何测定激发光谱和荧光光谱？
四、计算题
1．用荧光法测定复方炔诺酮片中炔雌醇的含量时，取本品20片(每片含炔诺酮应为0．54～0．66mg，含炔雌醇应为31．5～38．5μg)，研细溶于无水乙醇中，稀释至250mL，过滤，取滤液5mL，稀释至lOmL，在激发波长285nm和发射波长307nm处测定荧光强度。
如炔雌醇对照品的乙醇溶液(1．4μg／mL)在同样测定条件下荧光计读数为65，则合格片的荧光计读数应在什么范围?
2．用荧光分析法测定食品中维生素B2的含量：称取2．00g食品，用lOmL氯仿萃取（萃取率100%），取上清液2．00mL，再用氯仿稀释为lOmL。
维生素B2氯仿标准溶液浓度为0．100μg／mL。
测得空白溶液、标准溶液和样品溶液的荧光强度分别为：F O=1．5，F S=69．5，F X=61．5，求该食品中维生素B2的含量。
（μg／g）
参考答案
一、选择题
1．C 2．A 3．A 4．D 5．A 6．B 7．C 8．D 9．C 10．A
11．D 12．D 13．C 14．D 15．B 16．D 17．B 18．C 19．C 20．C
二、填空题
1．荧光发射波长总是大于激发光波长，荧光光谱形状与激发光波长无关，荧光光谱与激发光谱成镜像关系
2．振动弛豫，辐射形式
3．最大激发波长，最大发射波长
4．几个，一个
5．紫外一可见吸收，一定的荧光效率，长共轭分子、刚性平面结构分子
三、简答题
1．影响荧光波长及强度的因素有温度、溶剂、酸度、荧光熄灭剂、散射光。
2．在低浓度时荧光强度和荧光物质的浓度成正比。
3．分子结构与荧光有如下关系：①长共轭分子具有л→л﹡跃迁的较强紫外吸收，л电子共
轭程度越大，荧光强度越大，而荧光波长也长移。
②刚性平面结构分子具有较高的荧光效率，在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面越大，荧光效率越大，并且荧光波长产生长移。
③共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度也有很大影响。
4．由于荧光物质分子与溶剂分子间相互碰撞等因素的影响，处于激发三重态的分子常常通
过无辐射过程失活回到基态，因此在室温下很少呈现磷光，只有通过冷冻或固定化而减少外转换才能检测到磷光。
5．荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，即在黑暗背景下检测所发射光的强度信号，因此可采用增强入射光强度或增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度。
在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度，而吸光度A=lgI 0/I,如果增大入射光强度，相应也增大了透射光强度，所以其比值不会变化，如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度也同时增大，同样不能提高其比值，也就不能达到提高灵敏度的目的。
所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高。
6．7．8．略
四、计算题
1．解 测定液中炔雌醇的浓度范围在
mL
mL mL g mL mL mL g 105250205.38~105250205.31⨯⨯⨯⨯μμ 即1.26～1.54μg ／mL 之间为合格。
1．4μg ／mL 的对照品溶液的荧光计读数为65
由s
x s x c c F F =，得合格片的荧光计读数应在58．5～71．5之间。
2．解 F s -F O =K·C s ， F x -F 0 = K·C x
将F O =1．5，F S =69．5，F X =61．5，C s =0．100μg ／mL 代入方程中解得 C x =0．088μg ／mL
食品中维生素B 2的含量=C x ×00
.20.1000.20.10⨯μg/g=22μg/g。