(优选)实验七营养缺陷型菌株的筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
筛选营养缺陷型菌株的方法
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同。
关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
（一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。
1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。
2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。
处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。
将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
大肠杆菌营养缺陷型
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选陈瑞州201110424108一.实验原理以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如维生素）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株称为营养缺陷型。
常用的诱变法是紫外线照射诱变法。
但是，经处理后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细菌。
因为抗生素能杀死生长的细菌而对不生长的细菌没影响，而缺陷型菌株在基本培养基中不能生长，由此通过含有抗生素的基本培养基即可淘汰野生型细菌，保留缺陷型细菌。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后，将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上，凡是在基本培养基上不长，而在完全培养基上生长的菌落就是营养缺陷型。
二.实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌三.实验器具和药品1.用具：灭菌培养皿（9cm），灭菌三角瓶（150ml），灭菌离心管。
2.培养基1)肉汤液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100ml，Ph7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。
2)肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水50ml，Ph7.2，高压灭菌锅15磅/英寸215分钟。
3)基本液体培养基：葡萄糖2g，蒸馏水98ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟4)基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
5)无N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
6)2N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
营养缺陷型菌株的筛选
CM
MM
３、夹层法
先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基， 凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒 一 薄 层 MM 琼 脂 培 养 基 ， 培 养 24h ， 将 出 现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养 基，再培养。这时第二批长出的菌落就可 能是缺陷型。
此法缺点是，结果有时不明确，而且将
（4）将CM和MM在恒温箱中培 养。
（5）二平皿相同方位进行比较， 即 可 发 现 在 MM 平 皿 上 长 出 的 菌落少于CM平板上的。MM上 未长而相应于CM上长出的那几 个菌落就可能是缺陷型。
此法要求平皿上菌落不能太多，
菌落之间应有一定间隔。
CM
MM
２、点种法
用接种针或牙签将CM上长出的菌 落在MM和CM两副平板上接种，依 次在相应位置点种，然后一起培养， 观察其生长情况。
MM
MM+F
无营养缺陷
CM
其他营养 缺陷
１、影印法
将一较平皿直 径小1cm的金 属圆筒蒙上一 层灭菌的丝绒， 用金属夹夹住， 灭菌。
完全培养基上 长出的全部菌 落在丝绒上轻 轻一压，使之 成为印模，标 记方位。
将基本培养基 平皿和完全培 养基平皿在标 记的同一方位 上先后轻轻一 压，此菌印模 即复印于上。
1、野生型菌株（wild type strain） 2、营养缺陷型（auxotroph）：
指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如 氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基 本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长 的变异株。 3、原养型（prototroph）：
营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生 的菌株，其营养要求在表型上相同。
与之有关的培养基有三类
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告
工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、实验材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
嘿，你知道营养缺陷型菌株是啥不？这玩意儿在科研和生产中可有着大用处呢！那怎么筛选营养缺陷型菌株呢？首先，咱得有个出发菌株，就像要找宝藏得先有个起点一样。
然后通过诱变处理，这就好比给菌株来个大变身，让它可能产生新的特性。
接着进行淘汰野生型，把那些不需要的家伙踢出去。
再进行检出缺陷型，这就像在一堆沙子里找金子，得仔细着呢！注意啊，整个过程中可不能马虎，每一步都得精准操作。
要是弄错了，那可就白忙活啦！
说到安全性，只要操作规范，那基本没啥问题。
稳定性嘛，筛选出来的菌株如果保存得当，那还是挺稳定的。
就像你把宝贝放在一个安全的地方，它就不会轻易丢啦！
那营养缺陷型菌株有啥应用场景呢？在生物制药、食品工业等领域都能大显身手。
它的优势可不少呢！比如可以用来研究代谢途径，就像侦探破案一样，通过它能找到生命的奥秘。
还可以作为遗传标记，帮助我们更好地了解生物的遗传特性。
举个实际案例吧！有个实验室在研究某种抗生素的生产，通过筛选营养缺陷型菌株，大大提高了抗生素的产量。
哇塞，这效果简直太棒了！
所以啊，营养缺陷型菌株的筛选真的很重要。
咱可得好好利用这个强大的工具，为科研和生产做出更大的贡献。
营养缺陷型突变株的筛选
营养缺陷型突变株的筛选一、与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体①营养缺陷型：原菌株由于发生基因突变,致使合成途径中某一步骤发生缺陷，失了合成某种代谢产物的能力，必须在培养基中外源补加该物质才能生长，这类突变菌株，叫营养缺陷型突变株，简称营养缺陷型。
②野生型：变异前的原始菌株。
③原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产性的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，表示方法亦同野生型。
二、与筛选营养缺陷型有关的三类培养基①基本培养基：能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
②补充培养基：在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。
③完全培养基：可满足该菌种各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
三、筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法①诱变：变常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。
②淘汰野生型a)抗生素法某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。
如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。
b)菌丝过滤法适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。
在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。
将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10h-12h, 使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除,未萌发的缺陷型孢子能顺利通过,从而达到富集营养缺陷型的目的。
③检出缺陷型的常用方法a)逐个测定法(点种法)：把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离,将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上,凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
b)夹层培养法：经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平板中，待凝固后，再加上一层不含菌的基本培养基。
营养缺陷型菌株筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
营养缺陷型菌株的筛选方法课件
• 2、菌丝过滤法
• 真菌和放线菌等丝 状菌的野生型孢子 在基本培养基中能 萌发长成菌丝，而 营养缺陷型的孢子 则不能萌发。把诱 变处理后的孢子移 入到基本培养液中 ，振荡培养10h左右 ，使野生型孢子萌 发的菌丝刚刚肉眼 可见，用灭菌的脱
、限量营养法和影印接种法等
• 1、点植对照法：诱变后的孢子或菌体，经富集培 养，涂布分离在完全培养基平板进行培养，待菌落 孢子成熟后，用灭菌的牙签或接种针把每个菌落上 孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板 上的相应位置，同时培养，然后观察对比菌落生长 情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应 位置上生长的菌落，可能为营养缺陷型。挑取孢子 或菌体分别移接到基本培养基和完全培养基斜面上 ，进一步复证。该法可夹靠层性平板强法，但工作量大。
• 1、诱变培养
• 营养缺陷型的诱变方
• 2、淘汰野生型
• 3、检出营养缺陷型
• 4、鉴别缺陷种类，确 定生长谱
法和诱变因子与普通
诱变育种基本相同。
用于诱发营养缺陷型 的诱变剂有亚硝基胍, 紫外线,亚硝酸等,其中
亚硝基胍的诱发突变 率极高,一般可达10% 以上,另外,随着诱变剂
量的提高突变频率也 追加。
什么是营养缺陷ห้องสมุดไป่ตู้菌株？
• 经过人工诱变或自 然突变失去合成某 种营养（氨基酸， 维生素，核酸等） 的能力，只有在基 本培养基中补充所 缺乏的营养因子才 能生长的野生型菌 株。
营养缺陷型菌株的分离筛选及其原生质体融合
• (三) 原生质体融合 • 取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合， 放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃 上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混 匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀， 置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离 心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。
• ２．２菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其 原理是在基本培养基中，野生型的孢子能 发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此 将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养 一段时间后，再进行过滤。 如此重复数次后，就可以除去大部分野生型 菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目 的。
３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
２淘汰野生菌的方法
• ２．１抗生素法是利用野生型菌株能在MM 中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变 处理液在MM中培养短时让野生型生长，处 于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于 “休眠状态”，这时，加入一定量的抗生 素，结果活化状态的野生型就被杀死，保 存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以 用青霉素，酵母可用制霉菌素。
第二部分 原生质体的融合
• 一、目的要求 了解原生质体融合技术的原理。 学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技 术。
二、基本原理
• (一) 原生质体融合步骤 • (1) 选择亲本 选择两个具有育种价值并带有 选择性遗传标记的菌株作为亲本。 • (2) 制备原生质体 经溶菌酶除去细胞壁，释 放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定 。 • (3) 促融合 聚乙二醇加入到原生质体以促进 融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强 制性的促进原生质体融合。在有a2+ 、 Mg2+离子存在时，更能促进融合。
适用表解法概括一下营养缺陷型菌株的主要步骤和方法
适用表解法概括一下营养缺陷型菌株的主要步骤和方法以下是营养缺陷型菌株筛选的主要步骤和方法：
1. 诱变处理：使用诱变剂处理细菌，使其发生基因突变。
这一步通常与一般的诱变处理相同。
2. 淘汰野生型：通过特定的方法淘汰野生型菌株，如抗生素法和菌丝过滤法。
抗生素法能够杀死野生型菌株，达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
菌丝过滤法则利用野生型菌株和营养缺陷型菌株在孢子发芽成菌丝方面的差异，通过滤孔较大的檫镜纸过滤，除去大部分野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。
3. 检出缺陷型：通过特定的方法检出营养缺陷型菌株，如夹层培养法、限量补充培养法和逐个检出法等。
4. 鉴定缺陷型：利用生长谱法对检出的缺陷型进行鉴定，确认其营养缺陷性。
这些步骤和方法仅供参考，请注意在实际操作时还需要考虑各种因素。
同时建议阅读微生物学相关书籍或请教专业人士，获取更准确的信息。
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选
工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选工业微生物菌种的选育——营养缺陷型菌株的筛选来源：青岛海博关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
（一）、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。
1、营养缺陷型的诱发营养缺陷型的诱变方法和诱变因子与普通诱变育种基本相同。
2、淘汰野生型在诱变后的存活菌体中营养缺陷型菌株的数量很少，一般仅占存活菌体的百分之几或千分之几，而野生型细胞却大量存在，因而要采取一些措施，尽量淘汰野生型细胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于检出。
淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。
（1）抗生素法：细菌用青霉素法：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。
处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处休止状态的细菌。
将诱变处理后的菌悬液分离加有抗生素的基本培养基上，培养后野生型细胞由于正常生长繁殖而被杀死，营养缺陷型细胞因不能生长而被保留下来，达到富集目的。
酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。
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第四步：鉴定营养缺陷型（此步因时间关系不再 进行）
实验材料
菌种：大肠杆菌 实验培养基：肉汤液体培养基（CM） ；肉
汤固体培养基（CMA）； 2倍肉汤液体培 养基（2×CM） ；基本液体培养基 （MM） ；基本固体培养基（MMA） ；无 N基本液体培养基（无N） ；2倍含N基本 液体培养基（2×N） 实验试剂：生理盐水；青霉素钠 实验器材：10mL带盖离心管、10mL吸管、 90mm培养皿、15×150mm试管（带硅胶 塞）、1mL刻度吸管（或微量加样枪和吸头）
取上一步骤处理好后的菌悬液0.1mL加入到 5mL灭菌溶化后冷却至45-50 ℃基本固体培 养基（MMA）中（试管），快速搓动混匀 后（快速） ，倒入上述有底层的培养皿中， 铺满铺平，冷却凝固。——第二层
冷却凝固后，再倒入5mL灭菌溶化后冷却 至45-50 ℃基本固体培养基（MMA） ，铺 满铺平，冷却凝固。——第三层
实验步骤
1、菌种培养收集洗涤 2、诱变剂处理 3、淘汰野生型，浓缩缺陷型——基本培养
基
抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素 适用于真菌
菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放 线菌 4、检出缺陷型——夹层培养法 5、鉴定营养缺陷型（此步骤因时间关系不 再进行）——下学期《微生物学实验》中 有相关内容学习
吸取上述洗涤悬浮好的菌悬液3mL，放至 60mm培养皿中，摇晃成薄层。
将上述培养皿（连盖）放在40W的紫外灯下， 距离30厘米（处理前先开紫外灯稳定30分 钟），灭菌1分钟，然后开盖处理5分钟。照 射完毕后，先盖上皿盖，再关紫外灯。
吸取3毫升2倍肉汤培养液到上述处理后的培 养皿中。置于37℃恒温培养箱内，避光培养 12小时以上。——诱变后DNA复制形成纯合 子过程。
放入37 ℃恒温培养箱中，培养48小时。
培养好后，仔细观察培养皿，标记已生长出的菌 落。
标记好后，倒入5mL灭菌溶化后冷却至45-50 ℃肉 汤固体培养基（CMA） ，铺满铺平，冷却凝 固。——第四层——第六天内容
放入37 ℃恒温培养箱中，培养48小时。——第八天内容 再次仔细观察培养好培养皿，前后对照标记，找
补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷 突变株生长需要的组合或半组合培养基。
营养缺陷型的用途
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途 很大，主要有两方面应用：
1、是作为研究代谢途径和遗传规律及 育种技术不可少的标记菌种；
2、可直接用于生产氨基酸、核苷酸等 代谢产物——目的在于切断某些代谢途径 以积累中间代谢产生或切断一条代谢途径 而积累另一分支途径的末端产生。 ——解除代谢途径中的反馈抑制和阻遏。
（优选）实验七营养缺陷型菌 株的筛选
与营养要求有关的3种遗传型关系
培养基的基本概念 （按营养需求成分分）
与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养 基：
基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的 野生型菌株生长所需要的最低成分的组合 培养基。——不同菌株的要求不同，此试 验要先确定，非常重要。
完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺 陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
3、淘汰野生型，浓缩缺陷型 （第三天）
（4）培养24小时后，按1∶1加入2N基本培 养液5毫升（含青霉素钠盐2000单位/毫 升），使青霉素钠在菌液中的最终浓度约 为1000单位/毫升，再放入37℃温箱中培 养。——利用青霉素只作用于生长的细胞， 杀死在基本培养基中生长的野生型，留下 休眠不生长的缺陷型。
（5）培养24小时后， 3500转/分离心10分 钟，用基本液体培养基重复离心洗涤三次， 悬浮于5mL基本培养液，备用。——去除 青霉素钠（第四天内容）
4、检出缺陷型——夹层培养法
（第四天）
取1无菌培养皿，倒入5mL灭菌溶化后基本 固体培养基（MMA） ，铺满铺平培养皿皿 底，凝固后形成底层。——第一层
注意紫外线防护（不要长时间暴露在其下）。
3、淘汰野生型，浓缩缺陷型 （第二天）
（1）吸5毫升紫外线处理过并重新培养的菌 液，放入已灭菌的15mL离心管，3500转/分 离心10分钟。
（2）倒去上清液，加入5mL生理盐水，打 散混匀沉淀，如此重复离心洗涤三次，加 生理盐水到原体积（5mL）。
（3）吸取经离心洗涤的菌液0.1毫升于5毫 升无N基本培养液，37℃培养12~24小 时。——缺营养情况下休眠菌体（饥饿处 理）。
1、菌种培养收集洗涤 （第一天）
大肠杆菌接种于肉汤液体培养基，37℃静 止培养18~24小时（老师处理）。
无菌取10mL培养液放入无菌15mL离心管中， 3500转/分钟离心10分钟，弃上清液，留下 菌体沉淀。
在上述沉淀中加入5mL无菌生理盐水，悬 浮沉淀（均匀），备用。
2、诱变剂处理（第一天）
未发生突变的野生型在两种培养基上都能 生长。
——筛选的理论Leabharlann 据实验原理 ——营养缺陷型筛选的四个环节
第一步：诱变剂处理
第二步：淘汰野生型，浓缩缺陷型——基本培养 基（使营养缺陷型由少数变为多数）
抗生素法：青霉素适用于细菌；制霉菌素适用于 真菌
菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌
高温杀菌法：利用芽孢和营养体对热敏感性的差 异。
本次实验利用紫外线进行诱变处理（主要是形成 嘧啶二聚体，引起后续DNA复制错误，达到诱变 的目的）。
诱变后需要暗培养（防止光复活作用）。
紫外线剂的控制——紫外灯的功率、照射距离、 照射时间。——（需要前期试验确定，杀菌率在 70%左右）
实验原理 ——营养缺陷型的培养生长情况
营养缺陷型在完全培养基（CM） 上生长良 好，而在基本培养基（MM） 上则不生长；
目的要求
1、了解应用物理、化学因素对细菌进行诱 变的方法。
2、初步掌握诱变产生营养缺陷型菌株的筛 选与鉴定的方法技术。体会其相应的科学 理念。
实验原理 ——诱变及诱变剂说明
利用化学、物理等诱变手段诱发突变是遗传学研 究和育种工作的常用手段。
主要有DNA碱基化学性质改变引起置换、插入移 码、大片段畸变、碱基二聚体形成等。最终引起 遗传信息在复制中的改变。