TUNEL法检测细胞凋亡

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针对问题2( TUNEL法的实验原理是什么?):

基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内,在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合,再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子),最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

工作原理:简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是;生物素(biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'-OH末端,并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。

针对问题3(TUNEL实验中几个关键步骤是什么?):

1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min,再用二甲苯两次5~10min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀;

2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10~30min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2h,但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。

的充分清洗。我个人认为,在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外,内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。

针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法?

1. 蛋白酶K是消化膜蛋白,从而起打孔作用,增加膜通透性,使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应;

2. 蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml,可用PBS配制,也可用蛋白酶K缓冲液(100mM Tris HCl +50mM EDTA);

3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min,具体时间长短与切片厚薄有关,4um左右的片子可以用10 min,但30 um左右的可用30 min,最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中,因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低,可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来;

2. 免疫组化中经常使用抗原修复,因为它的原理主要是抗原和抗体反应,通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合,避免假阴性结果;

3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合,故不需抗原修复;

4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1h,或者延长时间即可

1. PROMEGA公司去年是40t要3300元(按100ul/片,实际可根据切片大小,加到30ul/pian);而roche公司一般10t国内分装1300元(同样也是100/pian);

2. 两个公司试剂盒内均没有PBS试剂,也不含DNase(以制作标准对照片);

3. 我一般用4%PFA多聚甲醛,至少浸泡24 h后进行石蜡包埋、制片。此外,Promega公司在操作步骤中加了两步4%PFA以固定组织,试剂盒内无PFA,但提供了配制方法。

再次请教:

1.我做TUNEL复染用苏木素几秒钟,请问还用不用1%盐酸究酒精分化了?

2.我想用罗氏的TUNEL试剂盒做荧光显像,请问用什么封片,配方?

针对你的问题,我分析如下:

1. 盐酸酒精分化的目的:一方面是分色;另一方面是减弱过强的苏木素核染色。所以你若把握好苏木素着色,也可不分化。

2. 分化时间不能过长,否则阳性着色也褪色。

3. 一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可,若需长期保存,也可用无色指甲油片周围封固(必要性不大)。

这是我的操作步骤(Promega公司),看完后就知道了:

1. 脱蜡:用二甲苯浸洗5 min×2次;

2. 水化:用梯度乙醇(100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min);

3. 浸洗:%NaCl×5 min→PBS洗5 min;

4. 固定:浸入4%多聚甲醛15 min;

5. 浸洗:PBS 5 min×2次;

6. 细胞通透:用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15(10~30) min RT;

7. 浸洗:PBS洗5 min;

8. 固定: 浸入4%多聚甲醛5 min;

9. 浸洗:PBS 5 min×2次;

10. 平衡:加100 ul平衡液,湿盒平衡10(5~10) min;

11. 制备TUNEL反应混合液:处理组用1 μl rTdT+1 μl 生物素标记的dUTP+98 ul 平衡液混匀;而阴性对照组不加rTdT,改为三蒸水;阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓

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