微生物发酵产酶
第二章 微生物发酵产酶
曲霉、欧文氏菌 啤酒酵母、假丝酵母
水勇果于加工开，始果，汁、才果能酒找澄到清，成麻类纤维脱胶
功的路
制造转化糖
凝乳酶
米赫毛霉、大肠杆菌和真菌生产的重组酶 制造乳酪
脂肪酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶 青霉素酰化酶
曲霉、根霉、酵母等 青霉、曲霉 凝结芽胞杆菌，白色链霉菌 细菌、霉菌、放线菌
加酶洗涤剂，油脂加工，生物化工 食品去氧、除葡萄糖，测定葡萄糖 生产果葡糖浆 制造6-氨基青霉烷酸
第三节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
原生质体 固定化原生质体
培养基
保藏细胞 细胞活化 扩大培养
发酵 分离纯化
酶
固定化细胞
预培养 无菌空气
一、细胞活化与扩大培养
1、生产菌种的来源
（1）购买或筛选
向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）； 中国典型培养物保藏中心（CCTCC，又称武大保藏中心）
一、产酶菌种的要求
1、发酵周期短，产量高； 2、容易培养和管理； 3、产酶稳定性好，不易变异退化，不易被感染； 4、利于酶的分离纯化； 5、安全可靠，无毒性。（非致病菌）。
二、产酶微生物
菌种是发酵生产酶的重要条件。已经在自然界中 发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有 50～60种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放 线菌、酵母菌、霉菌。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶
α-淀粉酶
葡萄糖淀粉酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶
植酸酶
产酶微生物 枯草芽胞杆菌， 地衣芽胞 杆菌， 米曲霉
米曲霉，黑曲霉，米根霉 枯草芽胞杆菌，米曲霉
地衣芽胞杆菌 黑曲霉，毕赤酵母工程菌株
文档：酶的制备
酶的制备酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。
早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取的。
由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，因此原料的来源受到限制，不适于大规模的工业生产。
目前，人们正越来越多地转向以微生物作为酶制备的主要来源。
—、酶的微生物发酵生产法1.微生物发酵生产法的优点酶的品种齐全微生物种类繁多，目前已鉴定的微生物约有20万种，几乎自然界中存在的所有的酶，我们都可以在微生物中找到。
酶的产量高微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。
许多细菌在合适条件下20min左右就可繁殖一代，为大量制备酶制剂提供了极大的便利。
生产成本低培养微生物的原料，大部分比较廉价，与从动、医学教育|网搜集整理植物体内制备酶相比要经济得多。
便于提高酶制品获得率由于微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱变等方法培育出高产量的菌种。
另外，结合基因工程、细胞融合等现代化的生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产生出目的酶。
正是由于微生物发酵生产具有这些独特的优点，因此目前工业上得到的酶，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。
2.微生物发酵生产法中尚待解决的问题尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。
消除毒性微生物发酵法生产的酶制品中会带人一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此进行毒性实验是必需的。
优良产酶菌种的筛选、培育目前，大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。
只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。
3.微生物发酵生产法的条件控制微生物酶的发酵生产是在人为控制的条件下有目的迸行的，因此条件控制是决定酶制剂质量好坏的关键因素。
条件控制包括以下几个方面。
第二章 (酶工程)微生物发酵产酶ppt课件
分解代谢物阻遏现象：
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先 利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生 了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次 生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
腺苷酸 环化酶 cAMP
抑制
CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）
5'-AMP
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
三、提高酶产量的策略
（一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
(2)使阻遏型变为去阻遏型
C R P c A M P 复 合 物
C R P + c A M P
cAMP-CRP复合物的作用示意图
操纵基因（Operater gene）:
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基 顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋 白结合，操纵酶合成的时机与速度。
结构基因（Structural gene）:
决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为 mRNA，再翻译为蛋白质。
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
调节基因(regulator gene)：
可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) （一种变构蛋白），通过与效应物 (effector) （包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合 而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
精品医学ppt
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参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
微生物与食品发酵
微生物与食品发酵微生物是一类非常微小的生物体，包括细菌、真菌和酵母等。
在食品加工和制作过程中，微生物起着至关重要的作用，特别是在食品发酵中。
食品发酵是利用微生物的代谢反应来改善食品的品质、味道和保存性的过程。
一、微生物对食品发酵的作用1. 产生酶：微生物可以产生各种酶，例如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等。
这些酶可以分解食材中的复杂物质，将其转化为更简单的物质，方便人体吸收和消化。
2. 发酵代谢：微生物通过发酵代谢来改变食材的性质。
比如，乳酸菌发酵牛奶会产生乳酸，使牛奶呈酸性，增加其保鲜期。
另外，酵母菌的发酵可以产生二氧化碳，使面团膨胀发酵，制作出松软的面包。
3. 产生芳香物质：微生物在发酵过程中会产生各种芳香物质，如酮、醇、醛等。
这些化合物可以赋予食品特殊的风味和香气。
4. 抑制食材变质：一些微生物可以产生抑菌物质，抑制其他有害微生物的繁殖，延长食品的保鲜期。
二、常见的发酵食品及其微生物1. 酸奶：酸奶是利用乳酸菌对牛奶发酵制成的。
乳酸菌在发酵过程中将乳糖转化为乳酸，使牛奶变酸。
酸奶富含活性乳酸菌，有助于调节肠道菌群平衡，增强免疫力。
2. 白酒：白酒是利用酒曲中的酵母菌对谷物进行发酵制成的。
酵母菌在发酵过程中将谷物中的淀粉转化为酒精和二氧化碳，形成了酒精，赋予了白酒其特有的香气和味道。
3. 酱油：酱油是利用酱母对大豆和小麦粉进行发酵制成的。
酱母是一种含有多种微生物的发酵剂，包括大豆霉、面霉和酵母等。
在发酵过程中，这些微生物分解大豆中的蛋白质和淀粉，形成酱油中的氨基酸和糖类物质。
4. 咖啡：咖啡是利用咖啡豆发酵制成的。
咖啡豆在采摘后要进行发酵，以去除豆膜和豆浆，使豆子呈现出咖啡的独特风味。
5. 奶酪：奶酪是利用乳酸菌和霉菌对牛奶发酵制成的。
乳酸菌发酵使牛奶变酸，霉菌则负责产生特殊的风味和质地。
三、发酵过程的条件与控制成功的食品发酵过程需要合适的温度、湿度和发酵时间等条件。
1. 温度：不同的微生物对温度有不同的要求。
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理
发酵法生产酶的原理是利用微生物在特定条件下通过发酵过程生产酶。
发酵生产酶的一般步骤如下：
1. 选取适当的微生物：根据所需的酶的类型和性质，选择合适的微生物菌株。
2. 培养微生物种子菌：将选定的微生物菌株接种进含有适宜营养物质和适宜温度、pH值的培养基中，进行预培养。
3. 大规模培养：将预培养的微生物菌液接种进大规模的发酵罐中，提供足够的营养物质和良好的培养条件，如温度、pH值和氧气供应等。
4. 酶的产生和积累：在培养过程中，微生物菌株通过代谢产生有益酶的合成。
合成的酶可被菌体细胞外排出，也可积累在菌体内。
5. 分离和提取酶：发酵结束后，通过离心、过滤或其他分离方法，将菌体与培养液分离。
然后，从菌体或培养液中提取酶。
发酵法生产酶的原理是基于微生物的生物代谢能力。
微生物通过合适的营养物质和培养条件，利用糖类、脂肪和蛋白质等有机物进行代谢，产生酶作为催化剂。
这些酶能够在特定的温度、pH值和底物浓度等条件下，促进生物化学反应的进行，从而转化底物为所需的产物。
微生物发酵产酶
抗体酶 （abzyme）
是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。
抗体酶制备的理论依据： 1948年， Pauling提出的过渡态理论； 1975年，Kohler和 Milstein发明的单克隆抗体制备技术； 1986年，Lerner和Schultz 分别获得具有催化活性的抗体酶。此 后，不少抗体酶被制备出来。
本章小结
1. 不是所有的微生物都能用于发酵产酶；
2. 微生物生长有4个时期，微生物培养产酶有4种方式，可根据 蛋白质生物合成理论、操纵子理论调节控制；
3. 影响微生物生长的环境因素有：培养基的组成、pH、温度、 溶解氧，精心调节，效益增加；
4. 固定化微生物发酵产酶是在传统方式上的一种新尝试，优点 很多。
一、酶生物合成的模式 二、细胞生长动力学 三、产酶动力学
酶生物合成的模式
细胞生长过程（4个阶段）： 调整期、生长期、平衡期、衰退期。
酶生物合成模式（4种）： P60图2－9 ➢ 同步合成型 ➢ 延续合成型 ➢ 中期合成型 ➢ 滞后合成型 结论：最理想的合成模式是延续合成型。
第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 第六节 固定化微生物原生质体发酵产酶
P53
调节pH值的必要性: 培养基的pH值与细胞的生长、繁殖以及 发酵产酶关系密切。
pH值变化的原因：
细胞的生长和代谢产物的积累；
细胞特性；
培养基的组成成分；
P54
发酵工艺条件。
调节pH值常用的的方法：
改变培养基的组分或其比例； 使用缓冲液； 通过流加适宜的酸、碱溶液到培养 基中。
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产生一种阻遏 决定酶的合成
蛋白，由多个 是否开始，有
亚基组成。 两个位点：一
酶工程--酶的微生物发酵生产 ppt课件
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养
种子罐培养 培养基 发酵罐
分离纯化 酶
无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
DNA
转录
RNA
微生物的发酵与产酶过程
微生物的发酵与产酶过程微生物的发酵与产酶过程是一种重要的生物技术，在食品工业、药品制造以及环境保护等领域扮演着重要角色。
微生物发酵通过利用微生物的代谢作用，将有机废弃物转变为有用的化合物，产酶则是指微生物在发酵过程中产生并分泌的特定酶类。
本文将从微生物发酵和产酶的定义、发酵与产酶的应用以及发酵与产酶的前景等方面来探讨微生物的发酵与产酶过程。
一、微生物发酵和产酶的定义微生物发酵是指在合适的条件下，利用微生物的代谢活动，通过控制发酵过程，获得所需产物的一种生物技术。
微生物发酵一般分为液态发酵和固态发酵两种形式。
液态发酵常用于大规模工业生产，而固态发酵则更适用于小规模生产和特定产品的制备。
产酶是微生物在发酵过程中分泌的特定酶类，这些酶能够催化特定底物的转化反应。
产酶的种类很多，包括脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等。
这些酶在医药、食品、化工等行业中具有重要的应用价值。
二、发酵与产酶的应用1. 食品工业中的应用微生物发酵在食品工业中被广泛应用。
例如，嗜酸乳杆菌可以发酵牛奶，制成酸奶。
酸奶中的乳酸菌有助于改善肠道菌群，增强人体免疫能力。
此外，假丝酵母菌的发酵可以产生酵母、面包、啤酒等食品。
2. 药品制造中的应用微生物发酵在药品制造中也起到重要的作用。
通过微生物发酵，可以产生多种药用物质，如抗生素、肽类药物等。
其中，青霉素是一种广泛应用的抗生素，通过青霉菌的发酵生产得到。
3. 环境保护中的应用微生物发酵还可以应用于环境保护领域。
例如，利用微生物发酵处理有机废弃物，可以将废物转化为有机肥料或生物柴油。
这种方法不仅能减少废弃物对环境的污染，还能获得可再利用的资源。
三、发酵与产酶的前景微生物的发酵与产酶技术在许多领域都显示出广阔的应用前景。
随着科学技术的不断发展，微生物的发酵与产酶技术也在不断创新和改进。
以下是展望微生物发酵与产酶技术的几个发展方向。
1. 高效产酶菌株的筛选与改造在微生物发酵过程中，寻找和改造高产酶菌株是提高产酶效率的关键。
微生物发酵类型
微生物发酵类型
微生物发酵是一种重要的生物技术，它用微生物代谢产生的酶和代谢产物来生产有用的化学物质。
微生物发酵可以分为不同的类型，包括：
1. 无氧发酵：在缺氧条件下，微生物利用有机物质代谢产生乳酸、醋酸、酒精等有机化合物。
这种发酵常用于食品和饮料制造。
2. 好氧发酵：在充氧条件下，微生物利用有机物质代谢产生二氧化碳、水和能量。
这种发酵常用于废水处理和土壤修复。
3. 产酸发酵：微生物代谢产生酸性代谢产物，如柠檬酸、苹果酸和乳酸。
这种发酵常用于食品、药品和化妆品制造。
4. 产酶发酵：微生物利用代谢产物产生酶，如纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶。
这种发酵常用于生物燃料、生物降解和纤维素加工。
5. 产气发酵：微生物代谢产生气体，如甲烷、氢气和二氧化碳。
这种发酵常用于生物燃料、废物处理和能源生产。
总之，微生物发酵在生产、环境保护和能源领域有着广泛的应用前景。
- 1 -。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
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《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展概述脂肪酶是一种重要的酶类，在工业生产中具有广泛的应用价值。
它能够在水和油脂界面上催化水解和合成酯化反应，常用于食品、医药、皮革、纺织等行业。
微生物发酵生产脂肪酶是目前最主要的脂肪酶生产方式之一，由于其生产过程易于操作、生产成本较低，且酶活性高，因此备受关注。
本文将对微生物发酵生产脂肪酶的研究进展进行探讨。
微生物来源微生物种类的选择对脂肪酶的生产具有非常重要的影响。
目前常用的产脂肪酶的微生物种类包括真菌、细菌和酵母菌等。
真菌是脂肪酶生产的重要来源之一，如青霉菌、曲霉菌、酵母菌等，这类微生物具有较高的脂肪酶产量和较高的酶活性。
细菌属和酵母属中也有一些菌株能够高效产生脂肪酶。
选择合适的微生物来源是微生物发酵生产脂肪酶的首要条件。
发酵条件的优化发酵条件的优化对脂肪酶的产量和酶活性有着直接的影响。
在微生物发酵生产脂肪酶的过程中，温度、pH、培养基成分和发酵时间等因素均会对生产效果产生影响。
研究人员通过对这些因素的调控和优化，以提高脂肪酶的产量和酶活性。
通过利用实验设计方法，对微生物发酵生产脂肪酶的影响因素进行系统优化，可以得到最佳的发酵条件，从而提高脂肪酶的产量和酶活性。
基因工程技术的应用随着基因工程技术的不断发展，将其应用于微生物发酵生产脂肪酶已成为目前的研究热点之一。
通过对脂肪酶基因的克隆、表达和改良，可以获得产量更高、酶活性更强的脂肪酶。
利用重组DNA技术将脂肪酶基因导入高产酶的真菌或细菌中，可以显著提高脂肪酶的产量和酶活性。
还可以通过对脂肪酶基因进行改良，获取具有更适应工业生产需求的脂肪酶。
提高产酶菌株的筛选筛选高效产酶菌株是微生物发酵生产脂肪酶的关键一步。
传统的筛选方法主要依赖于培养基中蛋白质、酯酶可诱导表达的碳源。
近年来, 一些研究人员通过利用高通量筛选技术, 对大量菌株进行筛选, 以获取具有高脂肪酶产量和较高酶活性的微生物菌株。
例如, 利用背景荧光素分子检测技术, 可以对高产酶菌株进行快速筛选, 从而提高了筛选的效率。
微生物发酵生产蛋白酶
妥善保存，才能保证其产酶特性不异、不死亡、
不被杂菌污染。
❖ 2）菌种活化：产酶菌种在使用钱必须接种于斜
面培养基上，在一定条件下，进行培养，以恢复
细胞的生命活动能力。
❖ 3）扩大培养：活化了的菌种，一般还要经一级 至数级的扩大培养。
❖ 4）分离纯化：发酵结束后得到的酶可能含有一些杂
微生物发酵生产 蛋白酶
一、蛋白酶
❖ 定义：催化蛋白质中肽键水解的酶。根据酶 的活性中心起催化作用的基团属性，可分为： 丝氨酸/苏氨酸蛋白酶(编号：EC 3.4.21.-/EC 3.4.25.-)、巯基蛋白酶(编号：EC 3.4.22.-).、金 属蛋白酶(编号：EC 3.4.24.-)和天冬氨酸蛋白酶 (编号 ：EC 3.4.23.-)等。
❖ 1、从菌种保存机构和有关研究部门获得 ❖ 2、通过筛选获得
五、培养基的配制
❖ 枯草杆菌ASL.398中性蛋白酶发酵培养基：
❖ 玉米粉8%，豆饼粉4%，麸皮3.2%，米 糠1%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钠 0.03%.
六、发酵工艺流程
保藏菌种 菌种活化 种子扩大培养
发酵 分离纯化
酶
七、剖析：
❖ 蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果 实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、 细菌，其次由酵母、放线菌生产。
二、酶发酵的方式
❖ 1、固体培养发酵 ❖ 2、液体深层发酵 ❖ 3、固定化细胞或固定化原生质体发酵
三、各种发酵方式发酵模式：
❖1、固定培养发酵：
❖ 以麸皮、米糠等为培养基的主要原料，加入 其它必需的营养成分而制成的固体或半固体 的麦曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株， 在一定条件下，发酵产酶。
第二章 微生物产酶
滞后合成型
• 1）细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始酶 的合成，又称非生长偶联型。
• 2）许多水解酶属于此合成模型。 • 3）阻碍物存在延缓了酶的合成。 • 4）酶的mRNA稳定。 • 5）滞后合成型↔延续合成型。
6）典型例子：黑曲霉培养合成羧基蛋白酶
图2-11，黑曲霉细胞生长约 24h后，几乎进入平衡期， 此时羧基蛋白酶才开始合成， 直至80h，酶的合成还在继 续。
④最好分泌胞外酶，产量高且易纯化。
⑤能利用廉价原料，营养要求低，对培养基要 求不苛刻，发酵周期短、原料利用率高、易于 培养。
采用一个新的产酶菌时，应有大量病理或动物 喂养实验数据作基础。美国FDA认定可用于食 品医药工业的生产菌有：曲霉（黑曲霉、米曲 霉）、枯草杆菌、某些芽孢杆菌、某些酵母、 根霉等。
5）典型例子：米曲霉培养生产单宁酶
图2-8 所示，单宁酶的生物合成与米曲霉细胞生长同步，属于同步合成 型（生长偶联型）
延续合成型
1）酶的生物合成伴随细胞生长开始，当细胞进入 平衡期后酶还可以继续合成。
2）酶的生物合成可以被诱导物诱导，一般不被细 胞代谢物阻碍。
3）酶的mRNA相当稳定。在平台期仍然可以翻译成 酶。
4）典型的例子， 黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶（图2-9A）。
图2-9A，以半乳糖醛酸为诱导物的情况下，培养一段时间以后（约40h）， 细胞生长旺盛，半乳糖醛酸酶开始合成；当细胞生长达到平衡期（约 80h），此酶继续合成，直至约120h以后。呈现延续合成型模式。 图2-9B，以粗果胶（含葡萄糖）为诱导物时，细胞生长较快，但是聚半乳 糖醛酸酶的合成被推迟。 因此，酶合成受到分解代谢物阻遏，葡萄糖被细胞利用完之后，酶才开始 合成，细胞进入平衡期，酶的合成还在继续。呈现滞后合成型模式。
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2、发酵条件的控制
（1）pH值的控制
培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生 长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培 养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。 通常培养条件： 细菌与放线菌：中性或碱性范围（pH6.5～8.0） 酵母菌和霉菌：偏酸性(pH4～6)
寻找酶要依据微生物的生境
不同环境中的微生物具有与各自生理特征和代谢类型相对应的独 特的酶；
产酶微生物的发现通常包括分离和筛选两个环节。
分离是通过分离技术将目标微生物从其生存的各种环境中分离出来；
筛选是以性能为目标确定合适的菌株。
3.3.1 常规酶筛选的一般策略
依据酶促反应过程和目标产物确定所需要的酶；
绿色植物 （自养）
二氧化碳 无机氮化物 利用日光能 不需要 无机盐 水
培养基的设计原则
1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较
培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同；
不同阶段，培养条件也有所差异。
葡萄糖异构酶
米苏里游动放线菌、二球状节杆菌、凝结 芽孢杆菌、树枝状黄杆菌、橄榄色产色链 霉菌、白色链霉菌、鼠灰色链霉菌、锈赤 色链霉菌
目前主要商品酶制剂及其来源
葡萄糖氧化酶
黑曲霉、生机青霉、尼崎青霉
半纤维素酶
橙皮苷酶 菊粉酶
黑曲霉
黑曲霉 假丝酵母、曲霉属
脂肪酶
黑曲霉、米曲霉、圆柱状假丝酵母、根毛 霉、无根毛霉、小球菌、类地青霉、胰脏、 山羊舌腺等
四、酶的发酵工艺条件与控制
1、培养基
各种生物对营养的需求
动物 （异养） 碳源 氮源 能源 生长因子 无机元素 水分
糖类、脂肪 蛋白质及其降解物 与碳源同 维生素 无机盐 水
微生物
异养 糖、醇、有机酸等 蛋白质及其降解 物、有机氮化物、 无机氮化物、氮 与碳源同 有些需要维生素等 生长因子 无机盐 水 自养 二氧化碳、碳酸盐等 无机氮化物、氮 氧化无机物或利用日 光能 不需要 无机盐 水
碳源
构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量 常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白 质及其降解物 异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用） 选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制
氮源
构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ） 氮源
有机氮源
无机氮源
蛋白胨、酵母膏、牛肉膏
橄榄色链霉菌(St.olivaceus)
葡萄糖异构酶
葡萄糖异构酶
二、 产酶菌种的保藏
1）低温保藏
2）干燥保藏
3）产酶菌种的退化与活化复壮
四、菌种的培养
固体培养法：以麸皮、稻草、米糠等农副产品作为 营养源，加少量水，使之呈固体形式的培养基，接 种，并在合适的温度下培养，使其生产并形成酶。 液体培养法：用三角瓶装适当的液体培养基，在摇 床振荡一定时间。
由葡萄糖制果糖
皮革脱毛
分解支链淀粉，支点的а-1，6- 10016 葡萄糖苷键，产物为直链淀粉 与糊精，与β-淀粉酶协同作用， 能降低β-界限糊精，显著提高β淀粉酶酶解程度
目前工业用主要酶的生产菌来源
微生物 类别 菌 名 产生 的酶 用途 所用菌号分离筛选 来源
AS3.3871,自北京 土壤分离得到
从自然界发现产酶微生物
一般按采样、富集、分离与初复筛等几个步骤；
产酶微生物及酶的高通量筛选。
单克隆菌落在平板上的固定、培养以及液体几种的自动化技术可以一
周筛选1000以上各菌落。
3.5 菌种选育
自然选育
自然环境或微生物自身代谢产生的诱变物质；
诱变选育
1）营养缺陷型突变株
2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株
一般产酶微生物的筛选原则：
发酵周期短,产酶量高； 微生物尽可能地利用便宜和方便的原料生产酶； 所产酶最好具有比较高的专一性，没有或很少有生产副产 物的杂酶； 所用微生物是不产生有害物质的非致病性的安全微生物； 微生物的遗传稳定性高。 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中 毒实验。
第三章 微生物发酵产酶
第一节 产酶微生物的发现及筛选
3.1 酶的来源与多样性：
80%以上的新酶来源于微生物，动物与植物 来源的只占8%和4%。 微生物的多样性与丰富的资源促成了酶的多 样性。 筛选微生物及其酶仍是目前发现新酶的有效 和主导的方法，特别是新酶发现的初期。
获取酶源的方式：
（1）生产菌可从菌种保藏机构和有关研究部门获得 菌种保藏机构 网址 美国模式培养物保藏所（ATCC） 德国微生物和细胞生产收藏中心（DSMZ）www.gbt.cle/DSMZ 中国微生物信息网 微生物菌种数据网(MSDN) .br/bdt/msdn 世界微生物数据中心(日本) wdcm.nig.ac.jp 大肠杆菌遗传收藏中心(CGSC) cgsc.biology.yale.edn/top.html （2）自然界是产酶菌种的主要来源 要获得生产某种酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集菌种样品。
调节pH的方法：
（1）调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；
（2）添加缓冲液，保持pH一定范围；
（3）调节通风量，使氧化还原电位保持一定的值； （4）发酵液pH高用糖或淀粉调节，过低通过氮调节。
细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的 最适pH值。 有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过 控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量 比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基 的pH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pH 值为中性时， 主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件 下，则以生产酸性蛋白酶为主。
采用中间微生物宿主表达生产极端酶的时候，需要在类似 极端微生物生长的生境下才可以得到折叠成天然构型的酶。
极端微生物产培养基成分要接近生境。
3.3.3 不可培养微生物中酶的发现策略
不可培养微生物是地球上最大的尚未开发的自然资源； 采用分子筛选，从元基因组中筛选酶基因，然后克隆， 表达。
3.4 微生物和酶的一般筛选方法
（2）温度的控制
枯草杆菌的最适生长 温度为34～37℃ 黑曲霉的最适生长温 度为28～32 ℃
通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍， 所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影 响其生长和合成酶。
植物细胞生长的最适pH值为5～6
pH值对产酶的影响
在发酵过程中，微生物不断进行着各种代谢反应，代谢产物能直接影 响着pH值。培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性； C/N比低， 发酵液倾向于碱性。
通气量的影响：通气量足，糖、脂类物质能完全氧化，最后产物为 CO2和H2O；通气量不足，糖、脂类物质氧化不完全，则会生产中间 产物有机酸。 盐利用的影响：强酸类盐的利用会引起pH值下降，强碱类盐的利用 会引起pH值的上升。 碳源不足时，也会因利用氨基酸的碳架而引起pH值的变化。
3.2 微生物产酶的优点：
种类多、酶种丰富，而且菌株容易诱变，菌种多样； 生长繁殖快，容易提取酶，特别是胞外酶； 培养基来源广泛、价格便宜； 可以在线监控酶发酵生产过程，实现连续化、自动化， 经济效益高；
可利用基因工程手段，选育菌种、增加酶产量和开发新 菌种。
3.3 微生物酶的筛选策略
实验室的常用培养基：
细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）； 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉菌： 查氏合成培养基；
例如枯草芽孢杆菌： 一般培养：肉汤培养基或LB培养基； 自然转化：基础培养基； 观察芽孢：生孢子培养基； 产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
黑曲霉（A.mger)
米曲霉(A.oryzae)
米根霉(Rh.oryzae)
雪白根霉(Rh.niveus) 紫红被包霉(Morterella vinaceae) 粟疫霉(Endothia parasitica) 微小毛霉(M.pusillus)
а-淀粉酶、糖化酶、、果胶酶、
糖化酶 蜜二糖酶 凝乳酶 凝乳酶
寻找具有这种催化活性的酶或微生物；
1）从商品酶库中筛选，如Sigma、Novo Nordisk等，最快、最简 单，但品种有限； 2）从保藏微生物菌株中筛选，如CGMCC、ATCC、UKNCC等，此 外，可从一些公开的微生物数据库查阅有关酶源信息，如MINE、 MSDN、世界微生物数据中心等； 3）自然界发现和筛选产酶微生物，注意采样环境； 4）从基因克隆库中筛选。
3）组成型突变株，解除对诱导物的依赖 4）抗性突变株，特别是抗噬菌体菌株
第二节 微生物酶的发酵生产
一、优良的产酶微生物具备的条件：
（1）酶的产量高； （2）产酶稳定性好； （3）容易培养和管理； （4）利于酶的分离纯化； （5）安全可靠、无毒性等。
目前主要商品酶制剂及其来源
纤维素酶 右旋糖苷酶 а-半乳糖苷酶 β-葡聚糖酶 糖化酶 木霉（主要是里氏木霉）、绳状木霉 淡紫青霉、绳状青霉、毛壳霉 葡萄色被孢霉、黑曲霉、米曲霉、假丝酵 母、乳酸杆菌等芽孢杆菌 黑曲霉、曲霉属、枯草杆菌、青霉 黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、根霉
铵盐、硝酸盐
需要注意合适的碳氮比
无机盐
参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、 磷酸盐、氯化物 以及含有钾、钠、 钙、镁、铁等元 素的化合物。