免疫组化操作步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化基本步骤
免疫组化基本步骤免疫组化是一种研究细胞或组织中特定抗原表达的方法。
它是通过将已知抗原与未知组织或细胞的衍生物进行反应，然后通过可见光或荧光显微镜观察这些抗原的表达情况。
免疫组化的基本步骤如下：1.样本预处理：首先，需要对待检组织样本进行预处理。
这通常包括固定和包埋。
固定可以使用甲醛、乙醇等化学物质进行，目的是保持组织或细胞的形态结构和细胞膜完整性。
接下来，样本通常会被包埋在石蜡或冰冻剂中，以便进行切片。
2.切片制备：将处理后的样本切片。
通常可以使用切片机或超薄切片机将固定好的组织切成薄片，通常为4-10微米。
切片可以更好地展示组织结构和细胞的形态。
3.抗原恢复：根据需要，可能需要进行抗原恢复步骤。
抗原恢复是通过热或酶解的方法，来使抗原的免疫原性恢复。
这是因为在组织固定的过程中，抗原常常会被交联变性，丧失免疫反应性。
4.抗体染色：将待检样本与已知抗体进行反应。
已知抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
这些抗体具有对特定抗原的亲和力。
反应通常在生物素-链霉亲和素体系或酶-抗酶（如辣根过氧化物酶）体系中进行。
通过这些反应，待检抗原会与抗体结合，形成抗原和抗体的复合物。
5.检测标记物：接下来，需要对已形成的抗原-抗体复合物进行检测。
这通常涉及到糖基化酶物质（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记抗体。
检测标记物的选择取决于研究者的需求以及所使用的设备和系统。
6.显色：根据使用的检测标记物不同，需要进行相应的显色步骤。
对于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶体系，可以使用底物通过化学反应产生颜色信号。
对于荧光标记抗体，可以通过激光或紫外线照射来使其发出荧光光。
7.显微观察：将显色后的样本放置在显微镜下进行观察。
根据待检抗原的位置和表达情况，可以通过显微镜来观察和分析组织或细胞中抗原的分布和表达水平。
免疫组化技术在医学研究和临床诊断中发挥着重要的作用。
它能够帮助研究人员了解组织或细胞中特定抗原的表达情况，从而深入了解疾病的发生机制，并且可以用于辅助诊断和病理分析。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤一免疫组化（法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 32 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 52 次。
5. 滴加 V ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 52 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 52 次。
9 ．滴加 ( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 52 次。
11 ．滴加 ( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注：对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 52 次。
13 ．向 1 ( 或 ) 中滴加 1-2 滴（或） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗，浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。
滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。
（ 5 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）、冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育 10-30 分钟。
免疫组化操作方法步骤原理
免疫组化操作方法步骤原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过检测组织或细胞中的蛋白质表达来判断其状态的方法。
该技术被广泛应用于医学和生物学领域，用于诊断、研究和治疗疾病。
下面是免疫组化操作的步骤：
1. 标本采集和固定：对于组织样本，需要在切除后尽快固定，以保持其形态和蛋白质表达。
常用的固定剂包括福尔马林、乙醛和酒精等。
对于细胞样本，需要将其附着在载玻片上，使其保持完整。
2. 抗原修复：固定后的样本会导致抗原的变性和失活，需要进行抗原修复来恢复抗原的活性和可识别性。
常用的抗原修复方法包括热水浴、微波炉和酶处理等。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫染色前，需要阻断非特异性的结合，以避免假阳性的结果。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白、鱼肝油和酵母提取物等。
4. 抗体染色：将待测蛋白质与特异性抗体结合，形成免疫复合物。
常用的标记物包括酶标记、荧光标记和金标记等。
5. 信号放大：为了提高检测灵敏度，常使用信号放大剂来增加信号强度。
常用的信号放大剂包括多聚物和酶促反应等。
6. 显色：最后将样品显色，以显示出目标蛋白质在组织或细胞中的分布和表达情况。
常用的显色剂包括DAB、AP和HRP等。
免疫组化的原理是利用特异性抗体与待测蛋白质结合，形成免疫复合物。
该技术可以检测细胞和组织中的蛋白质表达，以研究它们在生理和病理过程中的作用和变化。
免疫组化技术的应用范围广泛，包括肿瘤诊断、药物研发和疾病机制研究等。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。
下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。
注意保护好标本的完整性和质量。
2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。
3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。
4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。
5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。
6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。
7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。
8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。
以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。
希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是用抗体识别特定蛋白质来检测组织和细胞中的蛋白质表达。
其可广泛应用于病理学、生理学和生物学等领域中。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
1. 组织处理首先，需要采集样本组织，常见的样本来源包括活体组织、固定组织和石蜡包埋切片。
不同的组织来源需要采用不同的处理方法。
对于新鲜的活体组织，可以通过切片、离心、冷冻等手段进行处理。
而对于已固定的组织，需要进行脱水、清洗、去蜡等前处理步骤。
同时，还需要注意保护蛋白质的完整性，以免影响后续细胞学的表达情况。
2. 抗原修复样本经过前处理后，可能会发生抗原损失或失活现象。
为了提高蛋白质的表达和稳定性，需要进行抗原修复处理。
一般采用的方法包括微波处理、煮沸处理、酶切处理等。
3. 样本烘干对于已经进行过前处理和抗原修复的样本，需要进行烘干处理，以免影响后续染色结果。
常见的方法包括空气干燥、乙醇除水、真空蒸发等。
4. 抗体选择根据实验需求，选择合适的一抗和二抗。
一抗是特异性识别目标抗原的抗体，一般是单克隆或多克隆的小鼠、兔、鸡等动物来源。
二抗是与一抗特异亚型相对应的抗体，主要用于增强信号。
二抗一般来自于不同阳性动物中。
5. 抗体稀释选定好的一抗和二抗，需要进行适当的稀释。
稀释倍数应根据抗体的浓度来控制，以获得最佳的信号与噪声比。
6. 组织切片将已处理好的组织切片成合适的大小，并摆放到载玻片上。
可以选用切片机、剪刀、切片钳等工具进行处理。
7. 抗体染色将稀释好的一抗液滴加到组织切片上，尽量润滑整个切片表面。
然后将切片在湿润的环境中孵育2-6小时，让一抗充分和目标蛋白质结合。
之后，将二抗液滴加到组织切片上，孵育30-60分钟。
通过荧光、酶标记、颜色标记等方式进行检测。
8. 洗涤处理组织切片在染色过程中会出现背景颜色可能会较强，影响实验结果的情况。
为了去除这些杂质，需要对切片进行洗涤处理。
一般采用的方法为不同性质的缓冲液进行多次反复的洗涤处理。
9. 封片组织切片染色完毕后，需要经过封片过程。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.溶解和固定样本：首先，将需要检测的细胞或组织样本固定在载玻片上。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇，固定时间可根据样本类型和大小来决定。
2. 渗透化处理：固定后的样本往往会产生较大的凝胶，渗透化处理是为了增加抗体的进入和细胞膜蛋白的释放。
渗透化处理一般使用皂类化合物如Tween-20、Triton X-100或SDS。
3.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要进行阻断。
使用一种含有蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）的缓冲液，将玻片上的固定样本浸泡数十分钟至数小时。
4.抗原恢复：一些蛋白质长时间固定后可能会导致其变性或掩盖其一些结构域，这种情况下需要进行抗原恢复。
抗原恢复有两种常见方法，热水浴和酶消化。
前者将玻片放在含有缓冲剂的热水中，后者则经过酶消化处理，例如使用胰酶。
5.抗体孵育：将特异性一抗加入到含有抗体绑定缓冲液中，然后将其滴加到玻片上，孵育在温和的条件下一段时间（通常为1小时至过夜）。
抗体结合到样本中的特定抗原上。
6.洗涤：洗涤步骤是为了去除非特异性结合的一抗和其他蛋白质。
使用含有适当洗涤缓冲剂（如磷酸盐缓冲液或PBS）的盛满容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次。
8.再次洗涤：同样地，使用含有适当洗涤缓冲液的容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次，去除非特异性结合的二抗。
9.信号放大：添加一种可视化或发光的底物使得免疫反应可见。
通常使用的方法有酶标记二抗、荧光染料标记的二抗或放射性标记的二抗。
10.显微镜观察：在光学显微镜下观察和记录实验结果。
使用显微镜观察样本，根据信号强度和位置对阳性和阴性结果进行评估。
这些步骤是一般免疫组化实验的基本步骤，但每个实验都有特定的条件和需求，可能需要对步骤进行修改和优化。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化步骤
1.石蜡切片, 60摄氏度烤片1小时.2.脱蜡: 依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精, 二甲苯浸泡10分钟, 酒精浸泡5分钟.3.抗原修复: 在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温. 或用高压锅煮沸3分钟后冷却至室温。
4.灭火内源性过氧化氢酶：在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min。
5.血清封闭：将载玻片置于PBS中5min，洗2次，马上加上山羊血清封闭液。
6.加一抗：如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。
加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
MG7 使用浓度为2ug/ml左右; MG5使用浓度为3ug/ml左右(推荐1:100)；7.加二抗：PBS中洗3次，每次5min，加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
8.加显色剂：PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。
镜下观察组织染色情况，适可而止。
9.复染：将显色后的片子用清水冲洗15分钟后，浸泡于苏木精中染色，一般为1-3分钟。
10.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗5分钟后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。
每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
11.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
抗体保存：分装后10-20ul/支存于-80摄氏度。
使用后剩余抗体存于4摄氏度不超过一周。
避免反复冻融。
免疫组化的步骤
免疫组化的步骤免疫组化是一种在细胞和组织中检测特定蛋白质的方法。
它是通过使用特异性抗体来标记和检测目标蛋白质的存在和定位。
免疫组化在生命科学研究和临床实验室中被广泛应用，可以用于研究细胞周期、诊断疾病以及评估药物治疗效果。
本文将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步：取样和固定组织对于免疫组化分析，需要提取组织样本。
常见的样本来源包括组织切片、细胞培养物或动物实验的组织。
确保样本经过适当的处理和固定，以保持目标蛋白质的形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
第二步：抗原修复抗原修复是为了恢复固定样本中的蛋白质的原始结构和形态。
常见的修复方法包括热处理、酶消化等。
热处理是将样本在高温水浴中加热，以使蛋白质重新展开。
酶消化是通过酶的作用，去除样本中的一些交联或修饰物质，以恢复抗原的可识别性。
第三步：抗体的选择和标记在免疫组化中，选择一个适当的抗体是至关重要的。
抗体可以选择单克隆或多克隆抗体。
单克隆抗体可以与目标蛋白质结合的特异性更高，但价格相对较高。
多克隆抗体则具有更广泛的适用范围。
抗体可以标记有不同的标记物，如荧光染料、酶或金标记等。
标记抗体的选择应基于实验目的和检测方法。
第四步：抗体和样本的孵育将选择好的抗体加入到固定样本中，使其与目标蛋白质结合。
这一步又称为孵育步骤。
孵育时间和温度取决于抗体的亲和性和实验要求。
通常，较长的孵育时间会提高目标蛋白质与抗体的结合效率。
第五步：洗涤洗涤步骤的目的是去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质，以减少背景信号的干扰。
洗涤缓冲液的选择应根据实验要求和样本特点进行调整。
洗涤次数和时间应根据具体情况进行优化。
第六步：二级抗体的添加和孵育二级抗体是与一级抗体（与目标蛋白质结合）结合的抗体。
一级抗体通常是与标记物结合的特异性抗体，而二级抗体则是对一级抗体产生反应的抗体。
二级抗体可以标记有荧光染料、酶或其他可视化标记物。
添加二级抗体的目的是通过放大信号来增强目标蛋白质的检测。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。
-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。
2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。
常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。
-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。
3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。
-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。
4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。
-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。
5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。
-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。
6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。
-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。
7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。
二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。
-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。
-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。
8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。
-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。
-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。
9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。
-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。
10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。
-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。
注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。
-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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免疫组化操作流程
试剂准备
1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L，KH2PO4 L。
2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。
即抗原修复液
: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST
4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。
操作流程
免疫组织化学染色
SP法：
1. 脱蜡、水化：
脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。
从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；
无水乙醇中浸泡3分钟；
95%乙醇中浸泡3分钟；
70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；
50%乙醇中浸泡3分钟；
自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡
2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）
高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。
电磁炉1000W 2min。
3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略
4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。
5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。
目的为阻断内源性过氧化物酶)；
6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)
7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。
用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。
8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。
4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
）。
9. PBST洗3次各3分钟；
10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥
的超敏二步法免疫组化检测试剂。
11. PBST洗3次各3分钟；
12. DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。
13. PBST或自来水冲洗10分钟；
14. 苏木精复染20秒，自来水分化；
15.自来水冲洗30分钟；
16. 酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。