(整理)基因工程试验.
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
高中生物专项训练试题汇编47：基因工程(含答案详解)
高中生物专项训练试题汇编47：基因工程1．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如图。
为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是()①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A．①③B．①④C．②③D．②④答案：A解析：为了防止Ti质粒被切成多个片段而失去应有功能，每种限制酶只有一个酶切位点，①正确；若编码蛋白质的序列中，有限制酶酶切位点，会使序列不能合成蛋白质，②错误；酶切后形成的黏性末端不同，保证了G基因不发生自身环化，③正确；若形成的黏性末端序列相同，会使Ti质粒发生自身环化，④错误，因此选择的原则是①③，故A项正确。
2．用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。
以下叙述不正确的是()A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B．图2中酶切产物可用于构建重组DNAC．泳道①是用SalⅠ处理得到的酶切产物D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案：D解析：分析图1可知，XhoⅠ有2个酶切位点，SalⅠ有3个酶切位点，这些酶切位点不重合，所以图1中两种限制酶识别的核苷酸序列不同，故A项正确，不符合题意。
图2中的酶切产物可与用同种限制酶处理的载体构建重组DNA，故B项正确，不符合题意。
由图2可知，泳道①得到了四种酶切产物，说明泳道①是由具有3个酶切位点的酶处理后得到的，即用SalⅠ处理得到的酶切产物，故C项正确，不符合题意。
限制酶识别的是双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA，不是识别单链DNA，故D项错误，符合题意。
3．(经典题，6分)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述，正确的是()A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异答案：D解析：构建表达载体需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，故A项错误。
基因工程试验设计
基因工程试验设计基因工程是指通过基因操作技术对生物体的遗传信息进行改造和调控的一种技术手段。
在基因工程中，通过对目标生物体的基因进行剪接、插入、删除等操作，可以实现对生物体性状的改变和遗传特征的调控。
基因工程技术在医学、农业、环境保护等领域具有广阔的应用前景。
1.实验目的：明确实验的目的和预期结果，例如改变生物体的特定性状、提高生物体的产量或抗病性等。
2.选择目标生物体：根据实验目的选择适合的目标生物体，可以是细菌、真菌、植物、动物等。
3.确定基因操作的方式：基因工程技术有多种操作方式，如基因剪接、基因插入、基因删除等。
根据实验目的和目标生物体的特点选择合适的操作方式。
5.确定基因传递方式：确定基因将如何传递到目标生物体中，可以采用转染、转化、转基因等方式。
6.制备实验材料：根据实验设计制备所需的实验材料，包括目标生物体的培养基、基因操作所需的酶、载体等。
7.设计对照组和实验组：根据实验目的设计对照组和实验组，对照组不进行基因操作，实验组进行基因操作。
8.确定实验条件和时间：确定实验的条件和时间，包括温度、湿度、光照等条件，以及实验的持续时间。
9.设计实验步骤：根据实验目的和操作方式设计实验步骤，包括基因操作、培养、鉴定等。
10.实验数据的分析和解读：根据实验结果进行数据分析和解读，判断实验是否成功，预测实验结果对生物体的影响。
基因工程试验设计需要综合考虑实验的科学性、技术可行性和安全性等因素。
在设计过程中，需要进行充分的文献调研和数据分析，确保实验的有效性和可靠性。
同时，也需要遵循伦理规范和相关法律法规，保证生物安全和环境保护。
总之，基因工程试验设计是对基因工程技术进行验证和探索的重要过程。
通过合理的设计和操作，可以实现对生物体的遗传信息进行改造和调控，为生物科学研究和实践应用提供重要支持。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
高中生物实验大全(已整理好A4)
高中生物实验大全(已整理好A4)实验一：营养成分的定性检测实验所需材料：牛奶、蛋白质、蔗糖、淀粉、食盐、饭菜、水果等步骤：1. 取一定量的样品，分别加入一些化学试剂；2. 观察样品颜色的变化、气味的变化、沉淀的产生，可初步判断样品中是否存在对应的营养成分。
实验二：光合作用实验所需材料：苗叶、酒精、碘液、盐酸、取样器、滴定管、显微镜等步骤：1. 将新鲜苗叶置于室内或光源下；2. 通过取样器、滴定管等工具分别抽取叶绿素溶液、葡萄糖溶液、碳酸盐溶液，以及加入一些其他化学试剂；3. 在相应的试管中进行反应，并观察变化。
实验三：DNA分离实验所需材料：动物细胞、实验室试剂、离心机、显微镜等步骤：1. 从动物组织中取出细胞；2. 通过试剂对细胞进行破碎、提取DNA；3. 经过离心机离心，提取分离后的DNA，并进行观察和测量。
实验四：发酵实验所需材料：酵母、糖、面粉、水、试管、鱼缸等步骤：1. 将面粉、糖和水混合制成糊状物，加入酵母；2. 在试管或鱼缸中进行发酵；3. 观察发酵过程中气泡的产生和颜色的变化等。
实验五：细胞培养实验所需材料：培养皿、细胞培养基、移液管、显微镜等步骤：1. 选择适合的培养皿，添加细胞培养基；2. 将待培养的细胞加入培养皿中，封闭培养皿；3. 放入恒温箱中进行培养；4. 观察细胞的生长状况和数量变化等。
实验六：人类遗传与基因工程实验所需材料：血样、PCR试剂盒、电泳仪等步骤：1. 取血样提取人类基因；2. 通过PCR扩增目标序列；3. 将PCR产物进行电泳，观察条带的出现及大小等。
实验七：缩阴菌的筛选实验所需材料：不同来源的缩阴菌样本、琼脂平板、各种营养成分培养基、培养箱等步骤：1. 将各种缩阴菌样本分别制备到琼脂平板上培养；2. 观察不同缩阴菌的生长情况，选择生长状况最好的样本；3. 根据该菌株的特点，选择适合的营养成分培养基，进行后续培养。
实验八：炭水化合物和脂质的检测实验所需材料：红蜡笔、苯甲酸、酒精等步骤：1. 取一块白纸，涂上红蜡笔；2. 按照一定比例加入苯甲酸、酒精等溶剂，将溶液滴入红蜡笔上，观察颜色的变化，判断是否存在炭水化合物和脂质。
基因工程实验报告
基因工程实验报告生命学院生技114班摘要：一、本次试验内容概况如下：（1）准备植物材料：小麦幼苗（2）对基因进行双酶切，准备的载体进行双酶切，转移Top10菌株。
（3）进行PCR检测，查看检测结果是否成功，成功则证明转入了BL21菌株，进行表达过程。
（4）进行电泳。
（目的蛋白的大小会知道，高诱导。
证明符合预期结果。
说明此区域该目的基因大量表达，其他区域目的基因没有大量表达。
）（5）用Weatern杂交去证明。
因为载体是已知的，在相应位置杂交出杂带，证明的该目的基因确实克隆到了载体上，并且蛋白质进一步进行了表达。
二、实验流程：用Trizol 法提取小麦总RNA→用RT-PCR技术扩增GAPDH截短体基因→用琼脂糖凝胶电泳进行片段胶回收→表达载体pGEX4T—1的构建→表达菌株转化→诱导表达→Western杂交关键词：RNA提取、RT-PCR扩增目的基因cDNA、琼脂糖电泳、质粒提取、表达载体的目的片段的酶切、载体和外源DNA的连接、感受态细胞的制备及转化、重组质粒的筛选、鉴定及转化、目的基因诱导表达、Western Blotting检测、DNA的传化与回收、培养基制备和细菌培养具体实验过程：一、<一>小麦总RNA提取1、材料设备：小麦幼苗、高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研体、剪刀、镊子。
2、试剂：（1）0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）（2）器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。
剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
（3）无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%的DEPC（体积/体积），处理过后高压灭菌。
（4）Trizol（5）75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
基因工程实验
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五、实验注意事项
1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，否则易溢出
2 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变 形，并减少漏胶的机会
加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清
加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙 醇，混匀。
置于-70℃冰箱约10min以上或者-20℃冰箱30min至 数个小时
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12000rpm离心15分钟（4℃），倒掉酒精，离心几秒，
用移液枪尽可能除去酒精
用0.5ml70 %酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉 酒精
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当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒 DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，它们之间交联形成不溶性网状 结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结 合沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA 及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂 的RNA可用RNaseA消除。再用酚／氯仿 处理，可除残留蛋白质
真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶 液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生 变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条 件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成 缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。
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2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点 答：异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异 丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去 盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。 异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实 验风险。其优点为：所需容积小且速度快，适用于 浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要 在低温条件下长时间放置。缺点为：易使盐类（如 NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙 醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐 类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处， 不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品 容积的95％乙醇可有效沉淀DNA。其缺点是总体积 较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同 时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶 解损失
基因工程试卷及答案 (2)
基因工程试卷及答案一、名词解释题1.同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的黏性突出末端。
这些酶统称为同尾酶。
p222.星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。
p263.基因克隆：通过体外重组技术，将一段目的DNA经切割、连接、插入适当载体，并导入受体细胞扩大形成大量子代分子的过程。
p394.基因文库：由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库。
p395.包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起所形成的没有生物活性的、无膜裸露结构。
6.反义核酸：是指一些可以通过碱基互补原则与被感染细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能的人工合成的单链反义分子。
p3467.反义DNA:：称反义寡核苷酸，是一种人工合成的、能与mRNA互补的、用于抑制翻译的短小反义核酸分子。
p3478.RNA干扰（RNAi）：是指对应与某种mRNA的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）分子使mRNA发生特异性降解，导致其不能表达的转录后基因沉默现象。
p3509.限制性内切酶：是一种能识别双链DNA中的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核苷酸酶。
p1510.基因治疗：是将目的基因放进特定载体中导入靶细胞或组织，通过替换或补偿引起疾病的基因，或者关闭或抑制异常表达的基因来克服疾病的治疗方法。
二、选择题1、DNA分子SexAI每隔多少个碱基会出现一个酶切位点（D ）A、256B、1024C、4096D、163842、下列序列中认为哪一个最有可能是二类限制酶切位点（C ）A、GAATCGB、GCTATGC、AAATTTD、AGGGGCA3、下列当A260/A280=（A ）时，为纯DNA的是。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
基因工程实验报告2012
实验一植物总DNA的提取、纯化一、实验目的：掌握从植物的组织（细胞）中提取DNA的方法。
二、实验原理：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物。
在高盐浓度条件下，核酸以稳定形式与去污剂CTAB络合于溶液中，当降低溶液浓度到一定程度时，CTAB与核酸的复合物从溶液中沉淀下来，通过离心就可将该复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB溶于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB溶于乙醇中。
苯酚、氯仿、异戊醇混合液抽提更好，但是苯酚较难除去。
EDTA螯合Mg2+或Mn2+，抑制Dnase（DNA酶）的活性，防止降解DNA。
三、仪器、材料与试剂：材料：青皮的叶子（野外采集，冷冻于-20度的冰箱中）。
主要仪器：水浴锅、台式高速离心机、研钵、涡旋仪（避免破坏核酸链，震荡时间要短，混匀即可，可以用手来混匀）、移液枪等。
主要试剂和材料：CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）裂解液：2%CTAB（W/V）、20 mmol EDTA(pH8.0)、100 mmol Tris-HCl (pH8.0)、1.4 mol NaCl 。
氯仿：异戊醇（24：1）。
异丙醇，无水乙醇。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA。
四、实验步骤：1. 取2g左右的嫩叶子放入预冷的研磨中，第一次加入较多的液氮，开始先慢慢磨开后研磨中待液氮量较少时快速磨动，如发现液氮挥发完迅速加入液氮（加入时动作要轻，防止粉末溅起），重复两次。
2. 将粉末加入预冷1.5mlEP管中（约1/3）后，加入事先700ul65℃水浴的2%CTAB和30ul室温β-巯基乙醇（剧毒），轻轻摇动混匀。
放入65℃水中水浴40min，每10min取出震荡使沉淀散开。
3. 取出后冷却至室温，加入氯仿/异戊醇（24：1，V/V）至满管（加药品千万注意别让药品污染桌面及手上，有必要可带面罩），剧烈震荡后12000rpm离心10min，取上清加入500µl 氯仿/异戊醇12000rpm 离心10min。
基因工程操作注意事项
基因工程实验注意事项1．上实验课不能迟到。
2．一定要提前预习实验内容，弄懂实验原理，理清实验顺序。
根据实验内容和步骤制定一个详细的试验计划（没有计划或计划不合理者不能进入实验操作）。
3．实验指导中所写的实验一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。
各小组学生需要根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。
4．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
5．本实验课中的所有实验都属于从克隆到表达的整体流程，时间上没有上下午晚上休息等严格的作息安排，一切服从实验进度，但必须在10天之内完成。
6．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！7．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。
在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
8．写作实验报告一定要文字整洁，观察记录详细（包括操作的错误），分析现象透彻。
9．在实验室内不能大声喧哗。
10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
13．实验时损坏的任何物品都要按规定赔偿。
实验流程参考图12入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快速，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面离心管架，试管架，标签纸等，磁力搅拌机。
4．试剂pET-his质粒载体菌,pMD18-T-NK载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（solution I），NaOH/SDS溶液(solution II)，KAc溶液（pH4.8）(solution III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。
基因工程精选全文完整版
– 可直接表达不含任何原核序列的外源 蛋白（原核表达载体）
– 以融合蛋白的形式进行表达（原核基 因融合表达载体）
表达载体
真核表达载体含有：
– 原核基因序列 – 真核转录单位
真核表达载体：有两类
– 不带病毒复制子 – 带病毒复制子
质粒（plasmid）
存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息
质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型
松弛控制型
(stringent control) (relaxed control)
基因工程操作流程
基因重组示意图
基因工程上游技术基本过程
选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
载体（vector）
质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）
载体的条件
分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志
法将允许克隆人体器官
法国总理若斯潘（2000年9月28日） 表示：
– 法国政府将允许对人体器官克隆技术 进行用于医疗目的的研究
基因工程技术
上游技术（upstream）
– 重组子的构建 – 工程菌的构建及高效表达
下游技术（downstream）
– 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 – 新型生物反应器的研制 – 高效分离介质及装置的开发 – 分离纯化的优化控制 – 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 – 超滤、反渗透技术的应用
(整理)基因工程复习提纲-完善
复习提纲1．什么是基因？基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
2．基因工程的诞生基因工程诞生于1973年。
1973－1974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试验。
试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。
人类进入了激动人心的基因工程时代。
3．基因工程的定义及三大基本元件。
定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
三大基本元件：限制性核酸内切酶（restriction enzymes）/DNA连接酶（ligase）/基因工程载体（vector）4．基因工程的研究内容(1) 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；(2) 在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子;(3) 将重组DNA分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞);(4) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆;(5) 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。
5．基因工程的技术准备及技术支撑。
技术准备技术支撑：核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR）技术5．基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2. 生物降解7．核酸酶的分类1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）/DNA酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease）；3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8．细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。
基因工程整理版
Chapter1 基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程关系1, 1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构;2，遗传学的兴起与发展, 特别是发现DNA是生命遗传信息的物质基础, 从而导致分子生物学的诞生;3，分子生物学: 从分子水平或核酸水平对生命现象和本质进行阐述和研究的生物学学科, 内容包括: DNA和RNA的结构、复制、表示、调控、遗传和变异等4，基因操作: 是研究分子生物学的手段, 同时也用来改造基因或者及其相关的大分子或者生物体, 目的是为人类的需求服务, 基因操作的内容包括: 分离、分析、改造、检测、表示、重组、转移等5，基因克隆和基因重组: 是基因操作中最重要的环节。
PCR技术为基因的体外扩增提供了强大的工具。
6，基因工程: 在各种酶的作用下, 将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接, 形成重组的DNA分子, 以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞, 并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。
基因工程具体的操作过程包括: 1目的基因的获得;2目的基因连接到克隆载体或表示载体, 形成重组DNA分子;3重组DNA分子转化受体细胞, 并与之增殖;4筛选受体细胞克隆, 表示目的基因。
二、基因工程的诞生与发展1、60年代末－70年代初: DNA 连接酶, 限制性核酸内切酶;2、1972年P.Berg (80年获得诺贝尔化学奖) 完成世界上第一个体外重组DNA:对(SV40 +λphage) DNA→EcoRI↓T4 ligaseSV40 λ重组分子3、1973年S.Cohen 和N.Boyer 完成第一个细菌克隆, 用R6-5(Kanr)+pSC101(Tetr) →EcoRI↓T4 ligase转化E.coli→Kanr, Kanr 转化子↓分离转化子, pSC101完整, R6-5部分4、1974年异源真核生物基因在 E.coli中表示, S.Cohen, H.Boyer用非洲爪蟾的编码核糖体基因与pSC101重组导入E.coli, 分析转化子, 在E.coli细胞内有外源的mRNA转录产物。
高中生物选修三“基因工程”综合练习(20题含答案)
高中生物选修三“基因工程”综合练习(20题含答案)请回答下列有关克隆技术和基因编辑的问题：1）克隆技术是指通过人工手段复制出与原体完全一样的生物体。
目前，克隆技术主要分为三种：体细胞核移植克隆、胚胎分裂克隆和基因克隆。
其中，最常见的克隆方法是。
2）基因编辑技术是指通过改变生物体的基因序列来实现对其性状的调控。
CRISPR/Cas9系统是目前最常用的基因编辑技术之一，其中CRISPR指的是，Cas9则是。
3）基因编辑技术的应用非常广泛，其中包括疾病基因治疗、农业生产、生物安全等领域。
以疾病基因治疗为例，基因编辑技术可以通过修复或替换患者体内的有缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。
目前，基因编辑技术已经被用于治疗包括血友病在内的多种疾病。
答案：（1）体细胞核移植克隆（1分）（2）“类细菌重复间隔簇”、“CRISPR相关蛋白9”（1分）（3）血友病（1分）逆转录病毒载体是目前应用较多的动物基因工程载体之一。
它可以将外源基因插入到受体细胞染色体中，使外源基因随染色体DNA一起复制和表达。
研究发现逆转录病毒基因组（RNA）的核心部分包括三个基因：gag基因（编码病毒的核心蛋白）、pol基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。
位于这些基因的两端有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。
下图展示了构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的过程。
1）逆转录病毒的遗传信息储存在RNA中，其中包含四种核苷酸排列顺序中的四种脱氧核苷酸。
2）过程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的启动子后，其主要目的是控制外源基因的表达。
3）过程③中，导入病毒蛋白编码基因（gag，pol和env）的目的是合成组成病毒的蛋白质。
4）过程④中，逆转录病毒载体感染的细胞一般选择内细胞团细胞，因为这类细胞能发育成新个体的各种组织器官（具有发育的全能性），处于囊胚期。
5）在胚胎移植前，需要对母鼠进行处理，才能使其生殖器官（子宫）适于早期胚胎的植入和正常发育。
基因工程实验操作规程
生化与分子生物学实验操作规程：基因工程实验操作规程1.学生要按时进入实验室，穿上试验服，带上预习报告及有关文具。
2.学生在实验室须保持安静，不大声喧哗，不做与实验无关的事情。
3.进行植物组织、动物组织基因组DNA的提取，细菌质粒提取，质粒及基因组DNA的酶切，PCR扩增, 大肠杆菌感受态的制备及质粒转化等实验。
4.使用PCR仪、超低温冰箱等贵重仪器时，要进行登记5.正确使用高速离心机等仪器，爱护仪器，发现问题应及时向老师汇报6.实验涉及到有毒物品时，须小心操作，用完后的容器及残余试剂须放到老师指定的位置。
7.做有关细菌实验时，须谨慎操作。
用后的废弃物及容器等应妥善处理，不得随意丢弃。
严禁在细菌繁殖的场所吃饭、喝水、休息等。
8.实验完毕后，打扫卫生，检查水电，经老师同意后方可离开实验室。
酶与蛋白质工程实验操作规程1.学生要按时进入实验室，穿上试验服，带上预习报告及相关文具。
2.学生在实验室须保持安静，不大声喧哗，不做与实验无关的事情。
3.进行蛋白质的提取、纯化、检测，蛋白酶的纯化及活力测定，蛋白酶抑制剂的提取及抑制活力测定。
4.在使用液相层析纯化系统等精密仪器时，需在老师的指导下正确操作，使用时要登记，须定期维护，清洗仪器5.本实验室所涉及的实验，试剂昂贵，学生须精心设计，合理安排，杜绝浪费6.在进行SDS-PAGE等接触有毒物品的实验时，须注意安全，避免接触皮肤或污染其他物品。
生化药物制备实验操作规程1.学生应按时进入实验室，穿上实验服，带好预习报告；2.进入实验室后，打开门窗，保证实验室良好的通风环境；3.在实验室内保持安静，不得大声喧哗，不做与实验无关的事；4.进行常规蛋白质提取、酶活分析等实验；5.所用血清为校医院化验后的正常血清，有新生入学体检的大量新鲜血液或平时化验者的正常血清；6.开设细胞色素C的提取、测定，血红素的提取、精制、测定及人血清凝血酶的制备综合性实验。
7.在使用离心机、组织捣碎机等仪器时，小心正确操作，发现问题应及时向老师汇报生物化学与分析检验实验操作规程1.学生应按时进入实验室，穿上实验服，带好预习报告及实验柜钥匙；2.进入实验室后，打开门窗，保证实验室良好的通风环境；3.在实验室内保持安静，不做与实验无关的事；4.认真听讲，确保清楚实验内容后再进行实验；5.提取测定粗脂肪、测定血清中总胆固醇的含量、观察糖的旋光及变旋现象、测定蛋白质浓度、进行氨基酸纸层析、分离血清蛋白质、提取测定RNA及测定 -淀粉酶活力等实验；6.在使用离心机等危险仪器时，要注意安全，严格按照说明进行操作；7.使用电子分析天平等精密仪器时，要做好登记工作，记录仪器使用情况，保持仪器干净，注意防潮，使用完毕后盖好布罩；8.使用完药品、器皿后放回原处；9.节约药品、水、电，爱护仪器、用具，损坏要赔偿；10.一切药品未经老师许可，不得擅自取用或借与他人；11.实验完毕后，交回实验报告，清点自己的仪器，经老师许可后方可离开实验室。
基因工程经典例题
基因工程经典例题解析一、例题1（一）题目已知一种限制酶能识别DNA分子中的GAATTC序列，并在G和A之间进行切割。
现有一段DNA分子序列为：- 5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’- 3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’若用该限制酶对其进行切割，会产生几个黏性末端？这些黏性末端的碱基序列是什么？（二）解析1. 识别切割位点：-该限制酶识别GAATTC序列，在DNA分子中有两处该序列，分别是5’—GGATCCGAATTCCTTAAG—3’中的GAATTC和3’—CCTAGGCTTAAGGAATTC—5’中的GAATTC（注意DNA两条链的反向平行关系）。
2. 切割产生黏性末端：-在G和A之间切割后，产生的黏性末端为：- 5’—G AATTC—3’- 3’—CTTAA G—5’- 5’—CTTAA G—3’- 3’—G AATTC—5’-共4个黏性末端，碱基序列分别是5’—G AATTC—3’和5’—CTTAA G—3’（另两条链的反向互补序列与之相同，只是方向相反）。
二、例题2（一）题目在基因工程中，将目的基因导入受体细胞是一个关键步骤。
现有以下几种受体细胞类型：植物细胞、动物细胞、大肠杆菌细胞。
若目的基因是一种编码胰岛素的基因，应选择哪种受体细胞最为合适？为什么？（二）解析1. 分析受体细胞特点：-植物细胞：可以通过农杆菌转化法、基因枪法等方法导入目的基因，但植物细胞中没有胰岛素加工的相关内质网、高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行正确的加工和分泌。
-动物细胞：具有内质网、高尔基体等细胞器，能够对胰岛素进行正确的加工和分泌，适合胰岛素基因的表达。
-大肠杆菌细胞：是原核细胞，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行糖基化等加工，且胰岛素基因中可能含有大肠杆菌不能识别的密码子等，表达出的胰岛素可能没有活性。
2. 得出结论：-应选择动物细胞作为受体细胞最为合适，因为它能对胰岛素进行正确的加工和分泌，使胰岛素具有生物活性。
（整理）基因工程试验.
（整理）基因⼯程试验.基因⼯程实验流程实验⼀丹参总DNA的提取实验⽬的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的⽅法。
实验材料：丹参叶⽚实验器材：台式离⼼机，恒温⽔浴锅，电泳仪，研钵和杵，离⼼管，微量移液器，枪头实验步骤：第⼀次使⽤前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加⼊指定量的⽆⽔⼄醇，充分混匀，加⼊后请及时在⽅框打钩标记已加⼊⼄醇，以免多次加⼊!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使⽤前加⼊β-巯基⼄醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或⼲重组织30 mg）在研钵中加⼊液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到⼀个1.5ml离⼼管，不要解冻，加600µl 65℃预热的裂解液PL (确认已加⼊β-巯基⼄醇⾄2%)，剧烈涡旋振荡混匀，⽤⼤⼝径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加⼀个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃⽔浴20-60分钟，在⽔浴过程中颠倒离⼼管以混合样品数次。
可选如果组织⼲燥或者产量低，可以适当延长⽔浴时间。
如RNA残留多，可在⽔浴前加⼊6µlRNA酶（20mg/ml）。
4.加⼊700µl氯仿/异戊醇（体积⽐24：1混合），颠倒充分混匀⼏分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离⼼5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前⽤等体积酚/氯仿（1：1）抽提⼀遍。
5.⼩⼼吸取上清到⼀个新的1.5ml离⼼管，注意不要吸到界⾯物质。
如上清⽐较浑浊，则需要重复步骤4⼀遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加⼊1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加⼊⽆⽔⼄醇!）后⽴刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上⼀步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加⼊⼀个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - ⼊收集管中）13,000rpm离⼼30秒，倒掉收集管中的废液（先加700µl离⼼，弃废液，再加⼊剩余的溶液，再次离⼼）。
高中生物选修三《基因工程》单元测试题(含答案)
专题1 《基因工程》单元测试题一、单选题(每小题只有一个正确答案)1.在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是( )A．限制酶和DNA连接酶B．限制酶和水解酶C．限制酶和载体D． DNA连接酶和载体2.下列说法正确的是( )A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B．用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌C．质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体D．利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程不能称为“克隆”3.某研究小组为了研制预防禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。
其简要的操作流程如下图。
下列有关叙述错误的是( )A．步骤①所代表的过程是反转录B．步骤②需使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶C．步骤③可用CaCl2处理大肠杆菌，使其从感受态恢复到常态D．检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原—抗体特异性反应试验4.与“限制性内切酶”作用部位完全相同的酶是( )A．反转录酶B． RNA聚合酶C． DNA连接酶D．解旋酶5.转基因抗虫棉的研制过程中，为了检测抗虫基因是否成功导入，最简捷有效的方法是( )A．用DNA探针检测受体细胞中的目的基因是否存在B．用DNA探针检测受体细胞中的目的基因是否转录出相应的mRNAC．直接将培育出的棉株叶片饲喂原本的棉花害虫D．检测标记基因是否正常地表达出来6.下列哪项不是表达载体所必需的组成( )A．目的基因B．启动子C．终止子D．抗青霉素基因7.下列说法正确的是( )A．限制性核酸内切酶的识别序列是GAATTC，只能在G和A之间切断DNAB． DNA连接酶能够将任意2个DNA片段连接在一起C．质粒是能够自主复制的小型双链环状DNA分子D．基因工程的载体只有质粒一种8.应用生物工程技术培育人们需要的生物新品种或新产品，提高了经济效益。
下图表示培育生物新品种的过程，请据图判断下列叙述中不正确的是( )A．图中①～⑤过程中都发生了碱基互补配对现象B．图中①过程需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶C．将PrG导入细胞Ⅱ，则Ⅱ最可能是浆B细胞D．图中⑤过程需要的培养基中一定含有植物激素和无机养料9.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是( )A．化学合成法B．基因组文库法C． cDNA文库法D．多聚酶链式反应10.中国新闻网报道，阿根廷科学家近日培育出了世界上第一头携带有两个人类基因的牛，因此有望生产出和人类母乳极其类似的奶制品。
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基因工程实验流程实验一丹参总DNA的提取实验目的：掌握从植物或动物的组织（细胞）中抽提DNA的方法。
实验材料：丹参叶片实验器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，研钵和杵，离心管，微量移液器，枪头实验步骤：第一次使用前请先在漂洗液WB和结合液PQ中加入指定量的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!取所需适量裂解液PL放置在65℃预热，使用前加入β-巯基乙醇到终浓度2%。
1.取适量植物组织（新鲜组织100mg 或干重组织30 mg）在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2.转移细粉到一个1.5ml离心管，不要解冻，加600μl 65℃预热的裂解液PL (确认已加入β-巯基乙醇至2%)，剧烈涡旋振荡混匀，用大口径枪头轻柔吹打帮助裂解。
如果组织裂解困难，可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。
3.65℃水浴20-60分钟，在水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
可选如果组织干燥或者产量低，可以适当延长水浴时间。
如RNA残留多，可在水浴前加入6μlRNA酶（20mg/ml）。
4.加入700μl氯仿/异戊醇（体积比24：1混合），颠倒充分混匀几分钟（或者涡旋混匀），13,000rpm 离心5分钟。
若提取的植物组织富含多糖多酚，可以在第4步前用等体积酚/氯仿（1：1）抽提一遍。
5.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管，注意不要吸到界面物质。
如上清比较浑浊，则需要重复步骤4一遍，直到得到透亮上清。
6.较精确估算上清量，加入1.5倍体积结合液PQ （请先检查是否已加入无水乙醇!）后立刻涡旋，充分混匀。
此时可能出现沉淀，但不影响实验结果。
7.将上一步所得混合物（包括可能出现的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放- 5 - 入收集管中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液（先加700μl离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心）。
8.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
9.加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10.加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
11.将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟12,000rpm 离心1分钟。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果预计和需要产量高，可增大洗脱体积，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
13.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20 ℃。
按照植物总DNA提取试剂盒操作说明。
1%琼脂糖凝胶电泳检测注意事项：1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm 的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。
3.需要自备氯仿/异戊醇（体积比24：1混合）、无水乙醇和β-巯基乙醇。
4.结合液PQ 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.不同来源的植物组织材料中提取DNA的量会有差异，一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。
6.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。
也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。
用水洗脱DNA应该保存在－20℃。
实验结果：本组实验结果是第九孔和第十孔，其中第九孔的DNA 提取效果较第十孔提取效果好。
两空之间的差异可能是由于两个离心管中添加的植物量不一样，所以最后提取的量不一样。
实验结果分析：1.在液氮研磨叶片的时候，研磨不够充分，且在向离心管中添加的时候，添加的量不多，速度慢，导致氧化，对提取效率造成很大影响。
2.可能是因为在提取DNA的最后步骤向吸附管中添加的洗脱液太多150ul，导致DNA的浓度过低，所以条带不亮。
3.在第九步中，将吸附柱放置室温晾干，可能晾置时间不足，导致添加的有机溶剂没有完全挥发，而有机溶剂影响了DNA的提取。
实验二质粒DNA的提取及酶切检测实验目的：学习和掌握小量提取质粒的方法。
实验原理：质粒提取（碱裂解法）根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH12.0-12.6的碱性条件下，线性的染色体DNA变性，双螺旋解开，而共价闭环质粒DNA仍保持双链紧密缠绕的状态。
将pH 调至中性并保持高盐浓度的条件下，染色体DNA之间形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而共价闭环质粒DNA保持可溶状态，经离心可将大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质除去，质粒DNA留在上清液中，用酚、氯仿抽提，可进一步纯化质粒DNA。
实验材料：含有pET28a质粒的大肠杆菌H5а；构建好的含有目的基因SRP的pET28a-SRP质粒的大肠杆菌DH5а实验器材：离心机、水浴锅、电泳仪、离心管，微量移液器，枪头，等实验步骤：质粒提取按照试剂盒操作说明。
1．用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。
12,000rpm离心1min，弃上清。
应根据所培养菌体的浓度与质粒的拷贝数，确定收集的菌液量。
菌量过大可能导致溶菌不充分，纯化时会影响质粒纯度。
菌体的体积与质粒拷贝数参见注意事项。
2．250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。
室温静置1-2min。
初次使用本试剂盒时，请将RNaseA全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。
可保存6个月。
●不要残留细小菌块。
菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。
●室温静置1-2min是为使溶液中的RNA被充分降解。
3．加入250μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀6-10次。
室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
●若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。
待恢复至室温后使用。
沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
●不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。
●此步骤不宜超过5min。
4．加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
此时会出现白色絮状沉淀。
5.12,000rpm室温离心10min，收集上清。
6．将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
●如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（800μl），可将上清分次加入DNA纯化柱中。
7.12,000rpm离心1min，弃滤液。
●此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。
8．加入500μl溶液PB/PE（去蛋白液），12,000rpm离心1min，弃滤液。
●此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
9．加入500μl溶液WB，12,000rpm离心1min，弃滤液。
●溶液W初次使用前用无水乙醇按1:1.5稀释，即含60%乙醇。
10．加入500μl溶液W，12,000rpm离心1min，弃滤液。
11.12,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
12．将DNA纯化柱置于新的离心管中。
向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2min。
●12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。
质粒DNA 于-20℃保存●溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。
溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
酶切反应体系：载体pET28a-SRP 30ulXho I 1ulHind III 1 ul双酶切buffer 5 ul超纯H2O 13ul37度，3小时。
电泳检测分析注意事项;1.使用前往准备好的solution中加入RNaseA；2．浓缩的wash buffer用乙醇稀释；3．所有步骤都在室温下操作。
实验结果：实验结果分析实验三目的基因的克隆[实验目的]通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
[实验原理]多聚酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。
在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1，变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5，+3，方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。
[仪器、材料与试剂] ·(一)仪器1．PCR热循环仪2．琼脂糖凝胶电泳系统 3. 吸头、0.2ul PCR管，微量移液器，(二)材料：质粒(三)试剂1．2×PCR Master Mix (含dNTP，Tag酶，缓冲液)2．质粒DNA3．引物（上、下游引物浓度均为约10umol/ul）F:5-CCC AAGCTT CTTTTTAATCCTTCCCTCAAATATC-3（Hind III）R: 5-CCG CTCGAG GGGACAATGAAAAAGCTGATAAC-3 (Xho I) 4．灭过菌的millipore 水5．琼脂糖6．DNA相对分子质量标准物DL2000[实验方法]1．学习PCR仪的使用，设定反应程序：反应程序为：94℃变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1min20s，30个循环；72℃延伸8 min。
4℃保存2．加样（冰上操作）：50ul反应体系，其中上游引物1ul，下游引物1ul，丹参DNA 模板2 ul或质粒DNA模板1ul，2×PCR Master Mix 25ul, 灭菌水21或22ul。