壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究
壳聚糖表面胰蛋白酶分子印迹聚合物的制备及性能的研究
壳 聚 糖 表 面 胰 蛋 白酶 分 子 印 迹 聚 合 物 的 制 备 及 性 能 的研 究
张 莹 苏 立 强
（ 齐齐 哈 尔大学 化 学 与化学 工程 学 院 ， 黑龙 江 齐齐 哈 尔 １１０ ） ６０６
摘 要 在壳 聚糖表 面通过 希夫 碱反应 嫁接一层 戊二 醛 ， 成核 一壳结构 微球。然后 在这 个核 一壳微球上 ， 形 以胰 蛋
白酶为模板分子 ， 氨基苯硼酸为 功能单 体 ， 了胰蛋 白酶分 子印迹聚合 物 ， 过静态 吸附法 ， ３一 制备 通 研究了聚合 物的吸
附性能 。结果表 明， 印迹聚合物对模板分子有较 高吸附容 量和特异选择性 。为从 蛋 白质 混和溶液 中分离富集胰 蛋 白
酶提供 了新 的材料和方法 。 关键词 分子 印迹聚合物 胰蛋 白酶 壳聚糖 戊二醛
ｍｉｒ ｓ ｈ ｒ ｓ Ｔ ｒ ｕ ｈ ｓａ ｃ ａ ｓ ｒ ｔｏ ａ ｄ ｔ ｅ ａ ｓ ｒ ｔ ｎ ｐ ｏ ｅ ｔｅ ｆｔ ｅ ｐ ｌ ｍｅ ｓｓｕ ｉ ｄ ｂ ｔｔｃ ａ ｓ ｒ ｔ ｎ ｃ ｏ ｐ ｅ ｅ ． ｈ ｏ ｇ ｔｔ ｄ ｏ ｐ ｉｎ， ｎ ｄ ｏ ｉ ｒ ｐ ｒｉｓ ｏ ｏｙ ｒｗａ ｔ ｄ ｅ ｙ ｓ ｉ ｄ ｏ ｉ ． ｉ ｈ ｐ ｏ ｈ ａ ｐ ｏ
Ｉ ｓ ｒ ｖｄ ｓａ ｎ ｗ ｔ ｒａｓ ａ ｄ ｍｅ ｏ ｆｔｅ ｅ ｒｃ ｍｅ ｔｏ ｅ ｌｔ ｌｃ ａ ｒ ｍ ｘｕ ｅ ｏ ｒ ｔｉ ｔａｏ ｐ ｏ ｉ ｅ ｅ ｍａｅ ｌ ｎ ｔ ｄ ｏ ｎ ｈ ｎ ｆｔｍｐ ａｅ ｍｏｅ ｕｌ ｆｏ ａ ｍｉｔ ｒ ｆｐ ｏ ｅｎ． ｌ ｉ ｈ ｈ ｉ ｒ
Ｓ ｌｃｉ ｅ Ｅｎ ｉｈ ｅ ｔｏ ｙ ｏ ｙ ｅ ｆｏ ｈ ｏ ｅｎ Ｓ ｍ ｐ ｅ ｎ ｔ ｅ ｅｅ ｔ ｒｃ ｍ ｎ ｆＩ ｓ ｚ ｍ ｒ ｍ ｔ ｅ Ｐｒ ｔｉ ａ ｖ ｌｓｉ ｈ Ｍ ｏ ｅ ｕ ａ ｌ ｍ ｐ ｉ ｔｄ Ｐｏｙ ｅ ｙ ｔｍ ｌｃ ｌ ｒｙ Ｉ ｒｎ ｅ ｌｍ ｒ Ｓ ｓｅ
酶的固定化技术
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。
本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
甲壳素、壳聚糖作为固定化酶载体的研究进展
由于壳 聚糖具 有在 酸 性条件 下溶 解 ，碱 性条 件 下沉 淀 的特 点 ， 以将其 作 为 固定 化 酶的载 体 时 ， 所 先 把 壳聚 糖溶 解于稀 酸 中 ， 滤去不溶 物 ， 向滤液 中滴 加 氢 氧化钠 溶 液 ．收集沉 淀 物作 为载体 。 以下 介 绍 的 几种 固定 化 酶 的载 体一 壳 聚糖 ，是用 上述 方法 处理 的。这样 处 理能使 壳 聚糖有 更多 的 氨基参 与 固定化 反应 ， 因此 固定化 酶 的活力 回收率 较 高。 姜 涌 明… 等以 自制壳 聚糖 为载 体 ， 戊二 醛 为交 联 剂 ， 到固定 化木 瓜蛋 白酶 。活力 回收率 为 ４ ％ 得 ２
３ 舒 展 、 用 酶 促 水 解 改 进 大 豆分 离蛋 白 的乳 化 性能 应 学 报 ．９ ２．（ ）３ —４ １９ ７ ３ ：９ ８ ４ 翟瑞文 、 雁群 、 子林等 李 陈
业科技 １ ９（ ） ３ —４ ９ ７ ５ ：８ ０
中 国 辕 油
玉米 渣 中 蛋 白质 的 酶 水 解
食 品 工
许 多 固定化 酶 的成功 与否 要依靠 载体 的特性 ，因此
载体 的选 择便 成 了研究 的热 点 。
乙酰胺 基 ． 葡萄糖 单 元和 Ｂ（ ，）２ 氨 基 一 葡 萄 Ｄ 一１４．一 Ｄ
糖 单 元组成 的共 聚物 。壳 聚糖 属 多糖类 物质 。亲水
甲壳 素又 名几 丁质 、 多糖 ， 由 ２ 乙 酰胺 一． 壳 是 一 ２ 脱 氧葡 萄糖单 体 通过 口（ ， ） 一１ ４ 糖苷 键联 结起 来 的直
甲壳 素 、 聚糖 作 为 固定化 酶 载 体 的研 究 进展 壳
邢 晓薏 吕晓 砖 宫慧梅 黄 良 昌 天津轻 工业 学 院
固定化胰蛋白酶的制备研究
固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。
胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。
因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。
二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。
其中凝胶是最常用的载体。
2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。
其中，共
价键结合法是最常用的方法。
3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。
三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。
2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。
一般情况下，选择
40℃为最佳条件。
3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。
一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。
四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。
在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。
五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。
其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。
同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。
壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质
壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性质肖燕;王娟;周小华【期刊名称】《应用化学》【年(卷),期】2009(26)7【摘要】以具柔性亲水手臂的壳聚糖-精氨酸树脂为载体,用戊二醛交联胰凝乳蛋白酶,获得壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶. 最佳固定化条件为:m(酶)∶ m(载体)=20∶ 1 000、戊二醛体积分数为1.0%、pH=5.20、30 ℃交联60 min. 固定化酶活力达850 U/g,Km为1.83 mmol/L,比游离酶增大33.6%,比交联壳聚糖固定化酶低24.0%. 壳聚糖-精氨酸树脂固定化胰凝乳蛋白酶水解时间进程曲线与游离酶基本一致,均在反应30 min达到最大速率,最适温度为70 ℃,比游离酶升高10 ℃;在75 ℃时的半衰期可达6.0 h,比游离酶提高约4.3倍;最适pH值为5.92,比游离酶向酸性偏移2pH单位. 4 ℃贮存半衰期为49 d.【总页数】6页(P780-785)【作者】肖燕;王娟;周小华【作者单位】重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044;重庆大学化学化工学院,重庆,400044【正文语种】中文【中图分类】O636.1;O629.7【相关文献】1.α-胰凝乳蛋白酶在相转移Fe_3O_4纳米粒子表面的固定化 [J], 吴侠;韩玉顺;曹敏花;胡长文;任玲;葛广路2.用于α-胰凝乳蛋白酶固定化的氨基超顺磁纳米凝胶光化学合成与表征 [J], 洪军;徐冬梅;孙汉文;宫培军;董黎;姚思德3.α-胰凝乳蛋白酶的固定化及其对DL-苯丙氨酸的光学拆分 [J], 刘立建4.PNIPAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 陈元安;付建伟5.PAM/HEMA固定化α-胰凝乳蛋白酶的研究 [J], 付建伟;庄银凤;王国伟;彭颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甲壳素和壳聚糖作为酶和细胞的固定化载体的研究进展
已用多种载体研究了 D 2葡萄糖异构酶 的固定化并已用于工业生产 , 但寻找更理想 的载体材料的研究工作依然在进行, 甲壳素 和壳聚糖是研究的重点之一。
D 2葡萄糖异构酶在甲壳素上的固定, 可
把葡萄糖淀粉酶通过戊二醛键合固定在 甲壳素上后, 具有很好的操作特性。 制备方法 如下 [ 7]: 每份粉状甲壳 素 ( 含水 50% ) 与三 份葡 萄糖淀 粉酶 ( 水 剂 ) 混合 , 加 入液 体总 体积
5 D - 葡萄糖氧化酶
蒸馏水充分洗涤 , 得到的颗粒状的固定化酶 被浸泡在 pH4 的 0. 1 m o l� L 乙酸钠缓冲中 保存。 该固定化酶的活力为游离酶的 67% 。 用 DEA E 2甲壳素固定化葡萄糖 淀粉酶 ( 99. 4 m g �g ) , 具有原酶 1�3 的活力 [8, 9 ]。
3 Β- 葡萄糖苷酶
已经有 D EA E 2Sep hadex A 225、 Duo lite 2 7 、 活性氧化铝、 硅胶等固定化葡萄糖氧化 A 酶, 但制备方法较麻烦, 而甲壳素作载体却要 简单得多 [ 13]。 将蟹壳甲壳素用 2. 5% 戊二醛 处理 3 h, 用 蒸馏 水洗涤 , 然后 加入 酶溶 液 中, 在 5 ° C 放置 过夜 , 过滤 , 洗涤 , 浸泡 在 2 m o l� L KC l 溶液中 , 使用前重新洗涤 , 其活力 保持 100% 。 在制备过程中 , 最佳的 pH 范围 是 5. 0 ～ 8. 0, 更好的是 6. 0。 最佳的使用温度 是 30 ° C , 在 40 ° C 时活力 还有 70% , 而原 酶 在此温度下的活力已很小。
作者简介: 蒋挺大, 男, 1940 年生, 研究员 。
以这样操作 [ 2]: 取 1%～ 10% 甲醛 或戊二 醛 溶液 10 m l, 加 入 50 m g 粉 状甲 壳素 ( 控制 pH 8. 5) , 在室温下搅拌均匀后放置 1 h , 其间 不时搅动一下 , 使甲壳素交联 , 然后用蒸馏水 洗涤 , 除去多余的甲醛或戊二醛。
固定化壳聚糖酶膜的初步研究的开题报告
固定化壳聚糖酶膜的初步研究的开题报告
标题：固定化壳聚糖酶膜的初步研究
研究背景：
壳聚糖酶是一种能够水解壳聚糖的酶类，具有广泛的应用价值。
然而，由于壳聚糖酶具有易失活、易受污染等缺点，在工业上应用受到了一定的限制。
因此，如何提高壳聚糖酶的稳定性和重复使用性已成为一个重要的研究方向。
研究内容：
本研究旨在将壳聚糖酶固定化在膜上，从而提高其稳定性和重复使用性。
具体来说，先将壳聚糖酶与适合的载体材料混合，然后将混合物涂覆在膜上，制成固定化壳聚糖酶膜。
在这个过程中，需要对载体材料、混合物的比例、涂覆工艺等进行优化，并测试膜的稳定性和催化效率。
研究方法：
（1）筛选合适的载体材料，如聚苯乙烯、聚丙烯等；
（2）制备壳聚糖酶和载体材料的混合物；
（3）将混合物涂覆在膜上；
（4）优化涂覆工艺，如溶液浓度、涂覆时间、温度等；
（5）测试固定化壳聚糖酶膜的稳定性和催化效率。
预期成果：
通过本研究，可制备出稳定性较高、重复使用性较好的固定化壳聚糖酶膜，并研究其催化性能。
这将为壳聚糖酶在工业上的应用提供新思路和方法。
壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究的开题报告
壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究的开题报告
一、背景
随着生物技术和生物医学领域的发展，酶在许多应用中都发挥着重
要作用。
然而，自由酶在使用过程中面临着稳定性、重现性等问题，无
法实现长期稳定的储存和使用。
因此，固定化酶成为了一种重要的解决
方案。
固定化技术可以提高酶的稳定性，延长使用寿命，并且可以更方
便地进行回收和重复利用，实际应用和经济效益均有很大的优势。
壳聚糖是一种天然产物，由于其良好的生物相容性、生物降解性和
再生性等特点，成为了固定化酶的优秀载体。
胰蛋白酶是消化蛋白质的
一种常用酶，广泛应用于食品、医药等领域。
二、研究目的
本研究的目的是利用壳聚糖微球作为载体，固定化胰蛋白酶，并对
其进行性质和稳定性的研究。
三、研究内容和方法
（1）制备壳聚糖微球
以壳聚糖为主要原料，采用溶液交联-乳化凝胶化法制备壳聚糖微球，通过控制反应条件和调节配方，得到粒径分布较为均匀、表面光滑的微球。
（2）固定化胰蛋白酶
将制备好的壳聚糖微球与胰蛋白酶进行反应，使其在微球表面固定化。
（3）性质和稳定性研究
通过对固定化胰蛋白酶的工作效率、催化活性、稳定性等进行测试，比较其与自由酶的差异，并进一步探讨其在应用中的优势和局限性。
四、研究意义
胰蛋白酶的固定化研究对于优化酶催化的条件、提高催化效率和稳
定性、推动酶在医疗、生物技术等领域的应用具有重要意义。
本研究可
以为固定化技术的发展和在实际应用中的推广提供理论依据和实践经验。
壳聚糖微球固定化胰蛋白酶的研究
关键 词 ：胰 蛋 白酶 ； 聚糖 ； 球 ； 壳 微 固定 化
中图分类 号 ： ５ Ｑ ５ 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｔｈｅ Ｉ ｍｏ ｉｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｙ ｓ ｎ ｏ ｉｏ ａ ｉ ｒ ｓ ｈｅ ｅ ｍ ｂ ｌｚ ｔｏ ｆ Ｔｒ ｐ ｉ ｎ Ｃｈ ｔ ｓ ｎ Ｍ ｃ ｏ ｐ ｒ ｓ
ｌ ｖ ｌ． Ｔｈ ｔｍｕｍ ｏｎ ｔｏｎ ｒ ｓ ｆ ｌｏ ｅ ｅｓ ｅ ｏｐ ｉ ｃ ｄｉｉ ｓ ｗｅ ｅ ａ ｏ ｌ ｗｓ： ． １ ２ ６ ｓ ｕｔｏ ｌ ｔ ｒ ｌ ｈｙ ｅ，ｄ ｓ ｅ ｓ ｎ ｏｒ ｏｌ ｉ ｎ ｇ ｕ ａ ａｄｅ ｄ ｉｐ ｒｉ ｇ ｆ
Ｍ ａ ． ２ ０７ ｙ ０
文章 编号 ：６ ３１８ （０ ７ ０—０ ６０ １ ７—６ ９ ２０ ）３０ ４—５
壳聚糖微球固定化胰蛋 白酶 的研究
谭 丽 ， 夏 文 水
（ ．江 南大学 食 品科 学 与安 全教 育部 重点 实验 室 ， 苏 无锡 ２ ４ ３ ；２ １ 江 １ ０ ６ ．武 汉工 业学 院 食 品科 学
与工 程 学院 ，湖北 武 汉 ４ ０ ２ ） ３ ０ ３
摘
要 ：以壳聚糖 为 载体 ， 胰蛋 白酶 固定化 ， 过优 化其 制备 条件提 高活力 回收 。首 先利 用反 相 将 通
悬浮 交联 法制 得 壳聚糖微 球 并用 于胰蛋 白酶 的 固定 ， 采 用 中心复合 设 计及 响 应 面分 析 法优 化 固 后 定 化条件 ， 果表 明 ， 二醛 体积 分数 为 １ ． ， 结 戊 ６ ２ 分散 时 间 为 ９ ｎ 给酶 量 １ｍｇ ｇ载 体 时 ， ８ｍｉ， ／ 固定
固定化胰蛋白酶的制备研究
2009年第2期胰蛋白酶(Trypsin )是一种蛋白水解酶(Protease )，专一作用于精氨酸、赖氨酸的羧基所形成的肽键，分子量为23800[1]。
在食品加工中，胰蛋白酶被广泛用于水解蛋白质，由于在蛋白水解液中要将胰蛋白酶分离去除，并希望提高催化效率，多次使用降低生产成本。
因此，有必要将该酶制成固定化酶[2]，目前已经将胰蛋白酶固定化于多种载体上[3、4]，但由于载体材料和形态的限制，载体的负载酶量较少，回收率不高。
壳聚糖(Chitos an )是一种天然的阳离子型多糖，其分子侧链上具有大量的游离氨基，对各种蛋白质的亲和力非常高，具有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，对人类无害并且对环境无污染；同时壳聚糖具有很好的成胶性质，易于形成膜、凝胶，可加工成多种形态；此外壳聚糖具有良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点[5]，因此壳聚糖是性能优良的固定化酶载体。
本文选用壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，首先将壳聚糖制备成微球，然后利用壳聚糖微球固定胰蛋白酶，既提高了载体的机械强度，也有利于提高固定化酶的负载酶量，提高固定化酶活力及其回收率，同时也使酶与水解产物易于分离。
1材料和方法1.1主要材料与试剂固定化胰蛋白酶的制备研究张黎明，袁永俊*，徐梦虬（西华大学生物工程学院，四川成都610039）摘要：以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用交联-吸附法对胰蛋白酶的固定化条件进行了初探。
实验结果表明：酶用量、戊二醛浓度、pH 值、温度等对壳聚糖微球固定化的胰蛋白酶活力有显著影响，最适固定化条件为：壳聚糖0.125g 、酶用量14mg ，交联剂浓度0.2%（v/v ），pH 值7.5，固定化温度35℃，交联时间2h ，吸附时间5h 。
在此条件下酶活力回收率为76.57%。
关键词：胰蛋白酶；壳聚糖微球；固定化；正交试验中图分类号：TQ925.TQ93文献标识码：A文章编号：1674-506X （2009）02-0018-0004The Study of Condition of Immobilized Trypsin on ChitosanMicrospheresZhang Liming,Yuan Yongjun *,Xu Mengqiu(School of Bioengineering of Xihua University,Chengdu,Sichuan 610039)Abstract:Immobilized trypsin was prepared with the Chitosan as matrix and glutaraldehyde as cross-linking agent through absorbing and crosslinking.The result of experiment manifested:the quality of enzyme,the concentration of the glutaralde -hyde,pH,temperature and so on conspicuously effect on the activity of immobilized trypsin on Chitosan Microspheres.The best condition of the immobilization of trypsin:The quality of chitosan is 0.125g,14mg of enzyme,the concentration of the glutaraldehyde is 0.2%(v/v),pH=7.5,the temperature of immobilized enzyme is 35℃,the crosslinking time is 2hours,the absorption time is 5hours.The activity recovery of immobilized enzyme is 76.57%.Keywords ：trypsin ；chitosan microspheres ；immobilization ；orthogonal experiment doi ：10.3969/j.issn.1674-506X.2009.02-005收稿日期：2009-02-12作者简介：张黎明（1984-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。
壳聚糖酶的特性及其固定化研究的开题报告
壳聚糖酶的特性及其固定化研究的开题报告
一、选题背景与意义
壳聚糖（chitosan）是一种重要的天然产物，具有良好的生物降解能力、低毒性且具有较好的生物相容性。
壳聚糖酶（chitosanase）可将壳
聚糖水解成低聚物和单体，是壳聚糖降解的关键酶类。
因此，壳聚糖酶
的研究对于壳聚糖的高效利用、环境保护和生物医药等领域具有重要意义。
固定化壳聚糖酶可以增加酶的稳定性和重复使用性，降低生产成本
和环境污染，提高反应效率，因此具有广泛的应用前景。
二、研究内容
本文拟就壳聚糖酶的特性及其固定化研究展开探讨，包括以下部分：
1. 壳聚糖酶的来源、结构和分类；
2. 壳聚糖酶的催化机理；
3. 壳聚糖酶的特性研究，包括最适pH、最适温度、热稳定性、催化动力学参数等；
4. 壳聚糖酶的固定化方法，包括吸附、共价结合和包埋等；
5. 固定化壳聚糖酶的特性研究，包括催化活性、重复使用性、稳定性、抗污染性等。
三、研究方法
本文将采用实验和文献综述相结合的方法，通过文献综述了解前人
的研究成果和方法，评价其可行性与优点。
在此基础上针对本研究的目标、任务和方法进行实验设计和实验操作，评估实验结果的可操作性和
可信度，最终得出科学的研究结论。
四、预期成果和意义
通过研究壳聚糖酶的特性及其固定化，可以深入了解壳聚糖酶的催化机理和特性，为其在生产实践和环境治理中的应用提供理论和实验依据。
同时，对固定化技术的比较和选择，可为生物催化的产业化提供指导。
最终，具有高活性、高稳定性的固定化壳聚糖酶的制备，将为壳聚糖的高效利用和环境保护做出重要贡献，具有经济价值和社会效益。
酶学论文：壳聚糖固定化酶的研究与应用
壳聚糖固定化酶的研究与应用摘要：介绍壳聚糖作为固定化酶载体的3种主要情况：壳聚糖直接作为固定化酶载体；壳聚糖衍生物作为固定化酶载体；壳聚糖与其他物质共同作为固定化酶载体。
壳聚糖及其衍生物等固定化酶具有酶活性高、回收率高和耐贮藏等特点。
指出壳聚糖及其衍生物在固定化酶技术领域有着广阔的应用前景。
关键词：壳聚糖；衍生物；固定化酶壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是由大部分2-氨基一2一脱氧一β—D-葡萄糖单元和少量N．乙酰-2一氨基-2一脱氧一β一D一葡萄糖单元以β一1，4糖苷键连接的二元线性共聚物，相对分子质量通常在几十万到上百万左右。
壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，是一种生物相容性好、易生物降解、无毒、易得的天然功能高分子生物材料，易于制成粉、膜、多孔微珠、纤维、凝胶、纳米粒子等多种形态。
作为唯一一种碱性多糖，壳聚糖在固定化酶并保持其活性方面有独特的优点。
1 壳聚糖直接作为固定化酶载体。
壳聚糖本身是一种多孔网状天然高分子粉粒材料，耐热性好，其分子中的羟基和氨基可形成活泼界面，对蛋白质有显著的亲合力，可将酶吸附通过离子键、氢键及范德华力而与载体结合。
John等将壳聚糖研磨成粉状，与粉状胰蛋白酶混合研磨，通过吸附作用周定胰蛋白酶，结果表明：研磨时间越长，固定化效果越好。
李志国等以壳聚糖为载体，用物理吸附固定化脂肪酶，对影响固定化过程的各种因素进行考察，确定最优条件，结果表明：固定化酶的可操作性优于游离酶。
以壳聚糖为载体通过吸附制备固定化酶，酶不易失活，但酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落，因此，多数情况下用吸附一交联法以提高其稳定性。
最常用的交联剂是甲醛和戊二醛，但更多采用戊二醛。
周纪宁采用甲醛活化交联壳聚糖固定L-天冬酰胺酶，其活力回收可达20％一25％。
岳振峰等将粉末状壳聚糖制备成微球形多孔载体，采用吸附——交联的方法进行固定化，在最佳固定化条件下，酶活力回收率为78．1％，具有较好的强度。
胰蛋白酶的固定化技术及其在水产加工中的应用分析
摘要作为功能性材料的壳聚糖、脱乙酰壳聚糖，由于其一系列独特的性质作为固定化酶载体材料已经广泛应用于酿酒工业、制糖工业、渔业、废水处理、环境污染的定点测控等研究领域。
固定化酶比游离酶具有多方面的优点。
本文以多孔壳聚糖球为载体，戊二醛为交联剂制备固定化胰蛋白酶，研究了多孔壳聚糖球载体的制备条件、固定化反应中戊二醛浓度、给酶量、pH值、温度、固定化时间对固定化胰蛋白酶活力的影响。
并进一步对固定化胰蛋白酶的性质，固定化胰蛋白酶水解鲢鱼蛋白的条件，以及鲢鱼蛋白的水解度，水解产物中可溶性蛋白得率，氮溶指数进行了研究。
通过研究确定了制备多孔壳聚糖球载体的最佳条件为：壳聚糖浓度3％，凝结液为：4％NaOH：95％乙醇(4：1)，室温处理3h。
固定化胰蛋白酶的条件为：每克载体加入交联剂(用pH值7．0缓冲液配制戊二醛)5mL，浓度为0．50％，活化温度为25℃，150rpm条件下振荡活化2h，酶液的浓度为7mg／mL(用pH 7．0缓冲液配制)，加酶量5mL／g载体，固定化温度15"C，150rpm振荡固定化24h。
在此条件下固定化胰蛋白酶活力472．39u／g 固定化酶，固定化效率42．9％。
固定化胰蛋白酶的最适反应温度范围30"C---60"C，游离胰蛋白酶的最适反应温度50"C；·固定化胰蛋白酶的最适pH值范围7．0"--'9．0，游离胰蛋白酶最适pH值范围7．0"--'7．5。
固定化胰蛋白酶的热稳定性和pH值稳定性比游离酶有所提高。
固定化酶的Km值为9．89mg／mL，游离酶的米氏常数Km值为8．99mg／mL。
利用固定化胰蛋白酶水解鱼肉蛋白，重复4次后，其活力为初始活力的46．06％。
以20％的鲢鱼蛋白为底物，水解时间120min，温度40"C，最大水解度8．73％，可溶性蛋白得率69．55％，水解物的氮溶指数62．24％。
壳聚糖固定化Asl.398中性蛋白酶稳定性的研究
化 酶 的 性 质 进 行 了讨 论 ， 实验 结 果 显 示 ， 戊二 醛 质 量 浓 度 为 ４ ， 克 载 体 给 酶 量 ２ ｍ ％ 每 ５ ｇ时 ， 活 力 回 收 为 ６ ４ ， 定 化 酶 的 热 酶 ５ ％ 固 稳 定 性 、Ｈ稳 定 性 及 乙 醇 的 稳 定 性 均 高 于 游 离酶 。 ｐ
壳 聚 糖 固定 化 Ａ ．９ ｓ ３ ８中 性 蛋 白 酶 稳 定 性 的 研 究 １
万 洪善
（ 连云 港职业技术 学 院 化工系 ， 江苏 连云港 ２ ２０ ） ２ ０６
摘
要 ： 究 了以 中空球 形 壳聚糖 固定 Ａ １３８中性蛋 白酶 的方 法 ， 研 ｓ ．９ 分析 了戊二醛 浓度 、 酶 量对 固定化 的影响 ， 对 固定 给 并
外蛋 白水 解 酶 。该 酶 已经 广 泛 地 应 用 于 果 酒 、 酒 和 醛水 溶 液 中 ， 温下 反 应 ５ ， 涤 除去 残 留 的戊 二 醛 。 啤 室 ｈ洗 饮料 的澄 清 以及 畜 血 水 解 和 医药 工 业 等 ， 该 酶 进 行 把经 戊 二醛 处 理 的球 形 壳 聚糖 加 入 由 ｐ ． 对 Ｈ ７ ２的磷 酸
用 ２ ％质 量 浓 度 的盐 酸处 理 ， 到 平 均 分 子 量 为 ２ ５ ０ 得 ．
戊 二醛 是 一 种 双 官 能 团试 剂 ， 以和 载 体 上 的氨 可
＊１５壳 聚 糖 ， 射 到 含 ２ ％ 质 量 浓 度 的 Ｎ Ｏ 和 基进 行 ｓｈｆ反 应 ， 与 酶 发 生 ｓｈ 反 应 。戊 二 醛 的 ０ 注 ０ ａＨ ｃｉ 再 ｃｉ ｆ
２ ４ 固定 化 酶 的 Ｄ ． Ｈ稳 定性
蒋
图 ４显示 了环 境 ｐ Ｈ对 固 定 化 酶 和游 离 酶 活 力 的
固定化胰蛋白酶的制备研究
固定化胰蛋白酶的制备研究介绍固定化胰蛋白酶是一种将胰蛋白酶通过某种方法固定在特定载体上的生物催化剂。
它具有较高的催化活性、较高的稳定性和重复使用性，因此在生物制药和食品工业等领域具有广泛的应用前景。
本文将对固定化胰蛋白酶的制备进行全面、详细、完整且深入地探讨。
固定化胰蛋白酶的制备方法1. 手工固定化方法1.1 离子交换法1.准备离子交换树脂，如聚对苯二甲酸乙烯酯。
2.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与离子交换树脂发生离子交换作用。
3.用缓冲液冲洗离子交换树脂上未固定的胰蛋白酶。
4.获得固定化胰蛋白酶。
1.2 化学交联法1.准备交联剂，如戊二醛。
2.将胰蛋白酶溶液与交联剂反应。
3.获得固定化胰蛋白酶。
2. 免疫固定化方法2.1 抗体固定化法1.准备抗体固定床，如琼脂糖凝胶。
2.将抗体溶液涂覆在固定床上。
3.将胰蛋白酶溶液加入固定床，与抗体发生免疫反应。
4.获得固定化胰蛋白酶。
2.2 酶联免疫固定化法1.准备带有胰蛋白酶结合位点的抗体。
2.将带有胰蛋白酶的底物与抗体结合。
3.获得固定化胰蛋白酶。
固定化胰蛋白酶的性质研究1. 催化能力通过将固定化胰蛋白酶与游离胰蛋白酶进行比较，研究固定化胰蛋白酶的催化能力。
2. 热稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同温度下进行催化反应，研究其热稳定性。
3. pH稳定性通过将固定化胰蛋白酶在不同pH值的缓冲液中进行催化反应，研究其pH稳定性。
4. 反复使用性通过多次使用固定化胰蛋白酶进行催化反应，并与游离胰蛋白酶进行比较，研究其反复使用性。
固定化胰蛋白酶的应用前景1. 生物制药固定化胰蛋白酶可以用于生产生物制药产品，如蛋白药物的制备过程中的降解杂质的去除。
2. 食品工业固定化胰蛋白酶可以用于食品工业中的蛋白质加工过程，如发酵面包的制备。
3. 污水处理固定化胰蛋白酶可以用于污水处理中蛋白质的降解过程，提高污水处理效率。
4. 医学检测固定化胰蛋白酶可以用于医学检测中的蛋白质测定，如血清蛋白质的检测。
内切壳聚糖酶的固定化及其酶学性质初步研究的开题报告
内切壳聚糖酶的固定化及其酶学性质初步研究的开题报告
开题报告
一、研究背景
聚糖是一种多糖类物质，广泛存在于植物、菌类和动物组织中，对于细胞壁的构建和生理功能具有重要作用。
内切壳聚糖酶是一类能够水解聚糖链的酶，在生产和食品加工等领域中具有广泛的应用价值。
然而，由于其在反应过程中易于失活和耗损，研究内切壳聚糖酶的固定化技术及其酶学性质，对于提高其稳定性和重复使用性具有重要意义。
二、研究目的
本项目旨在通过固定化技术对内切壳聚糖酶进行修饰，研究酶固定化对其催化性质和稳定性的影响，为其在工业生产中的应用提供基础研究支持。
三、研究内容和方法
1. 酶的提取
采用超声波破细胞法从壳聚糖生产菌中提取内切壳聚糖酶，并用Gel filtration和SDS-PAGE等方法对其进行分离和纯化。
2. 酶的固定化
将纯化后的内切壳聚糖酶通过共价键、离子键和物理吸附等方式固定于不同载体材料上，如壳聚糖、凝胶、磁性纳米颗粒等。
3. 酶学性质的研究
对比未固定内切壳聚糖酶和不同固定化酶的性质差异，研究固定化方法对其酶催化活性、对底物的特异性、温度、pH和稳定性等酶学性质的影响，为其在工业生产中的应用提供基础研究支持。
四、研究预期结果和意义
通过固定化技术对内切壳聚糖酶进行修饰，研究酶固定化对其酶学性质的影响，有望提高酶的稳定性，提高其重复使用性和催化效率，为其在生产和食品加工中的应用提供基础研究支持。
同时，本研究有望为其他类似酶的固定化研究提供参考。
壳聚糖固定化胰蛋白酶亲和层析抑肽酶的条件及影响因素
壳聚糖固定化胰蛋白酶亲和层析抑肽酶的条件及影响因素宋扬;赵辉
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1998(019)006
【摘要】利用壳聚糖固定化县蛋白酶作为亲和吸附剂从牛肺中直接分离纯化抑肽酶。
该方法在适当的温度（３５℃）、ｐＨ值（ｐＨ１．５）、离子强度（１．０ｍｏｌ／ＬＫＣｌ）以及吸附条件（１７６ＦＩＰ／ｇ）下，纯化的抑肽酶活性回收率达８３％，比活可达５０００ｋＩＵ／ｍｇ以上。
【总页数】3页(P359-361)
【作者】宋扬;赵辉
【作者单位】安徽省生物研究所;安徽省生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R977.3
【相关文献】
1.壳聚糖微球固定化胰蛋白酶条件初探 [J], 张黎明;袁永俊;徐梦虬
2.改性与修饰壳聚糖亲和层析纯化抑肽酶 [J], 谢宗良;杨军峰;张元亮
3.以壳聚糖为载体亲和层析胰蛋白酶 [J], 郝毅;章杰;何泽超
4.固定化胰蛋白酶制备条件的优化及其在纯化抑肽酶中的应用 [J], 李晓丽;李辰;杨斌;李春元;王萍;王磊
5.去乙酰基壳聚糖在亲和层析纯化胰蛋白酶中的应用 [J], 孙福璋;金海洙
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胰蛋白酶对壳聚糖的降解研究
胰蛋白酶对壳聚糖的降解研究周桂;谭学才;黄在银;李梅;黄逢蔼【期刊名称】《广西农业生物科学》【年(卷),期】2002(021)001【摘要】用粘度法和吸光度法,研究胰蛋白酶非专一性降解壳聚糖过程中温度、pH 值、反应时间、酶浓度、底物浓度.金属离子对胰蛋白酶降解壳聚糖反应的影响,确定了以壳聚糖为底物的胰蛋白酶的一些催化特性:最适温度为30℃,最适pH值为5.0,10～180 min内酶反应速度恒定,酶浓度在0.1～0.5 g/L的范围内,酶反应速度与酶浓度呈线性关系,米氏常数Km为9.54 g/L.【总页数】4页(P50-53)【作者】周桂;谭学才;黄在银;李梅;黄逢蔼【作者单位】广西民族学院,化学化工系,广西,南宁,530006;广西民族学院,化学化工系,广西,南宁,530006;广西民族学院,化学化工系,广西,南宁,530006;广西民族学院,化学化工系,广西,南宁,530006;广西民族学院,化学化工系,广西,南宁,530006【正文语种】中文【中图分类】Q556.9;Q539;Q599【相关文献】1.壳聚糖降解酶及伽马辐射降解壳聚糖的研究概述 [J], 杨贵杰;高星爱;解娇;刘海燕;凤鹏;金荣德;朴鲁东;赵新颖2.壳聚糖表面胰蛋白酶分子印迹聚合物的制备及性能的研究 [J], 张莹;苏立强3.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备牡蛎肽的研究 [J], 牛红鑫;陆峻宇;李亚楠;王明玉;张横;贾美娜;佟长青;李伟4.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备魁蚶肽的研究 [J], 张金铃;迟海;李伟;金桥;佟长青5.壳聚糖金属配位控制氧化降解及反应动力学研究——(Ⅰ)壳聚糖金属配位控制氧化降解 [J], 尹学琼;林强;冯玉红;于文霞;张岐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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第１８卷第２期
离ｒ交换与吸附
．１２７·
３结果与讨论
３．１ 固定化胰蛋白酶最佳条件的确定 ３．１．１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 固定戊二醛用量和给酶量，采用ｐＨ＝５．０一ｌＯ．０范围的缓冲液，分别制备固定化胰蛋白
酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，并测定固定化酶的活力，结果见图１。由图１可见，固定化反 应过程中的ｐＨ值对固定化酶的活力具有很大的影响。固定化胰蛋白酶Ａ，在ｐＨ＝７．０曲．０ 的范围内均具有较高的酶活力。而固定化胰蛋白酶Ｂ，则在ｐＨ＝７．０－８．５的范围内酶的活力 达到最大值。由于固定化胰蛋白酶Ａ的载体是线型壳聚糖，而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体 是网状壳聚糖．它们在不同的口Ｈ条件下，分子链的构像可能不同，则与胰蛋白酶的结合 能力可能存在着一定的差异．同时胰蛋白酶在不同ｐＨ的缓冲液中也具有不同的分子构像， 这些都会影响固定化酶的活力。
万方数据
·１２８·
Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
２００２年４月
壳聚糖在与胰蛋白酶发生偶联作用时，分子链上的游离氨基之问也要进行交联反应，所以 消耗的戊二醛的量较多。而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体壳聚糖已用戊二醛预交联，当与胰蛋 白酶发生偶联反应时，消耗的戊二醛的量则相对较少。
３．１．３固定化反应中给酶量对固定化酶活力的影响 载体上偶联的酶量直接影响着固定化酶的活力。在最适ｐＨ（ｐＨ＝８．０）、最适戊二醛浓
但是，固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ范围有一定的差异．这可能与载 体的结构不同有关．从而造成了固定化酶分子所处的微环境有所不同．
３．２．２ 固定化胰蛋白酶的最适反应温度 取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，在Ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．Ｏ）中，
温度３０曲０℃范围内，测定其对酪蛋白的水解活力，结果见图５。由图可见，原酶的最适 反应温度为５５℃；固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ的最适反应温度均为６０＂Ｃ，并 且在６０＂Ｃ，７０＂Ｃ之间均保持了较高的活力．说明胰蛋白酶用壳聚糖固定化后，其热稳定性 明显提高，可以在较高的温度下进行酶促反应。
１前言
天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物一壳聚搪具有良好的生物相容性与生物亲和性，它在 生物医药领域中的应用研究正蓬勃开展．它作为生物材料．用作固定化酶、亲和层析、金 属螯合亲和层折的载体前景十分广阔【１４ Ｊ。目前研制成功的固定化酶已有上百种．但由于 成本昂贵，真正应用于实际生产的品种为数不多。壳聚糖作为开发应用较晚的阳离子型多 糖用作固定化酶的载体，在结构上具有独特的优势．利用其分子侧链上大量的游离氨基， 再选择适当的交联剂．可以使得酶麸价结合于载体上的反应易于进行．此外壳聚糖还具有 良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点．
２．２固定化胰蛋白酶的制备 固定化胰蛋白酶Ａ（以线型壳聚糖为载体）：取～定量的壳聚糖溶于２％的乙酸水溶
液中，在快速搅拌下，滴加５％的氢氧化钠水溶液至溶液ｐＨ＝７．５．抽滤收集沉淀，可得壳 聚糖的白色细小颗粒。将上述经过再沉淀处理后的壳聚糖置于０．０５ｍｏ｜／Ｌ的Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ缓冲 液（ｐＨ＝８．ｏ）中，加入一定量的胰蛋白酶搅拌均匀后．再滴加～定量的戊二醛水溶液，在 磁力搅拌下反应６ｈ。抽滤，先用蒸馏水洗涤，再用上述缓冲液洗涤，直至洗涤液中检测不 到戊二醛和游离酶，真空干燥后即得颗粒状固定化酶。
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．么３ 豸５ ‘ ●
ＴｔＣＤ
圈５温度对胰蛋白酶活力的影响 Ｌ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ．固定化胰蛋白一＾，ｃ原醇
围６固定化酶与原酶的Ｌｉｎｃｗｃａｖｃｒ－Ｂｕｒｋ曲线 ｔ原酶：ｂ固定化麓蛋白■Ｂ；ｔ固定化胰蛋白醇Ａ
３．２．３ 固定化胰蛋白酶和原酶的束氏常数岛 各取多份相等质量的固定化胰蛋白酶Ａ或固定化胰蛋白酶Ｂ或稀释后的原酶，在最适
苞
墨
最
Ｒ
蝗
蜒
荔
靛
翠
霉
图１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 ｔ固定化胰蛋白酶Ａ． ｂ．固定化胰蛋白酶Ｂ
田２固定化反应中戊二鹾浓度对 固定化酶活力的影响
ｔ固定化胰噩白醇Ａ： ｂ固定化馥蛋白酶Ｂ
３．１．２固定化反应中戊二醛浓度对固定化醇活力的影响 以戊二醛为变联剂制备固定化酶时．由于戊二醛既是反应的交联剂，又是酶的变性剂．
ｔ牧聃日期２００２年ｊ月２２日 作者麓卉：陈天．盘＇（Ｔ９６Ｚ－）．江苏省＾．副教授
万方数据
较为接近ａ此实验方法也为壳聚糖用于其它酶的固定化提供了又一个可供选择的新的操 作方法。同时对这两种固定化胰蛋白酶的性质进行了详细的研究，为固定化胰蛋白酶的工 业应用提供了非常有用的实验数据。
２实验部分
２．１试剂与仪器 壳聚糖：自制，脱乙酰化度为９５％：戊二醛：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ产品（浓度为２５％）；胰蛋白
万方数据
白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ均具有较好的热稳定性，它们在６０＂Ｃ保温３ｈ活力几乎保持 不变，８ｈ以后活力缓慢下降．保温１０ｈ相对活力仍然保持在８５。９０％之间。由于游离的 液态胰蛋白酶具有自身消化现象，对热稳定性较差，而胰蛋白酶经壳聚糖固定化后对熟稳 定性有了显著的提高．
游离的液态胰蛋白酶在ｐＨ＝９．０的缓冲液中（不加底物），恒温２５＂（２放置２５ｈ活力几 乎完全丧失。图３为固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ在ｐＨ＝５．０．１０．０的缓冲液中。 恒温２５℃放置７２ｈ后的相对活力．实验结果表明，固定化胰蛋白酶在ｐＨ＝７．０。１０．０范围 内都比较稳定，而固定化胰蛋白酶Ｂ的相对活力保持更高，说明相同条件下它的稳定性更 好。由于在固定化酶中载体壳聚糖对胰蛋白酶的静电作用，使得酶分子构象变得较为牢固， 所以固定化酶的抗酸碱能力有所增强。
其对底物酪蛋白的水解活力，结果见图４。由图可见，原酶的晟适ｐＨ值为８．０，并且酶活 力随ＤＨ值变化的曲线较为陡峭：而固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ值 范围均有所扩大，分别在ｐＨ＝７．５—９．０和ｐＨ＝７．“８．５的范围内都保持了较高的催化活性。
万方数据
第１８卷第２期
离子交换与吸附
·１２９·
享
邑
素
霄
蝗
蝗
智
智
晕
霉
‘１ｗ
圈７胰蛋白酶的热稳定性（６０℃） ｔ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ固定化胰蛋白酵Ａ：ｃ原醇
酶：ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＴＯＲＩＥＳ（ＤＥＴＲＯＩＴ ＭＩＣＨＩＧＡＮ ＵＳＡ）产品：酪蛋白：上海化学试剂 站进口分装；其它试剂均为分折纯。
５３ＷＢ微机型紫外可见分光光度计（上海光学仪器厂）：ＳＨＺ－８２型水浴恒温振荡器（江 苏太仓医疗器械厂）：ＫＪ－ｌ型控温强磁力搅拌器（苏北生化仪器厂）；ＤＨ Ｓ－３型酸度计（上 海第二分析仪器厂）。
离子交换与吸附，２００２，１８（２）１２５～１３Ｉ ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＡＮＤ ＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ 文章编号１００卜５４９３（２００２）０２－０１２５－０７
壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究＋
陈天
扬州大学理学院化学化工系，扬州２２５００２
摘要：以秃聚糖为栽体，戊二醛为交联剂．采用两种方法特备了固定化胰蛋白酶．考察了固定 化反应中ｐＨ值．戊二醛的浓度、吼及蛤酶量时固定化胰蛋白酶活力的影响，并研究了这两种 固定化胰蛋白酶的性质．实验结果表明，以戊二醛预交联的网状壳聚糖为栽体制备的固定化胰 蛋白酶具有更加优良的性能，在最佳固定化反应条件下．酶的活性回收率可速５６％．此固定化 胰蛋白酶的最连ｐＨ为７．¨８ ５、最适温度为６０℃．‰值为２．５２ｍｏＩ．ｔＬ．固定化腱蛋白醇表现出 了较好的热稳定性、ｐＨ棼存稳定性．殂及在乙醇水溶漶中的稳定性． 关键词：壳聚糖胰蛋白醇固定化醇 中囤分类号：０６４７ ３ 文献标识码：Ａ
３．２．４ 固定化胰蛋白醇的稳定性 分别考察了固定化酶的热稳定性、ｐＨ贮存稳定性以及在有机溶荆乙醇中的稳定性，
结果见图７￣９． 在０．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｆｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．０）中．以２％的酪蛋白为底物－加入一定量
的固定化酶或稀释后的原酶于６０＂Ｃ水浴中保温．不同时间后测定酶的活力（图７）·由图 ７可见，原酶在６０＂Ｃ保温ｌｈ活力丧失近４０％，保温３ｈ活力基本全部丧失．固定化胰虽
度（固定化胰蛋白酶Ａ：０．６％：固定化胰蛋白酶Ｂ：０．４％）时，固定载体用量，改变酶的 投料量．分别制备固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，其活力测定结果见图３。由图 ３可见，开始时，固定化酶的活力随着给酶量的增加而升高，当给酶量增加到一定量时， 固定化酶的活力达到最大值后，则固定化酶的活力反而随着给酶量的进一步增加而下降， 这是因为固定化酶的活力并不与载体负载的酶量成正比。当载体负载的酶量达到一定量 后，再增加给酶量反而会增加固定化酶分子之间的拥挤程度，使之与底物结合时的空间阻 碍增大，造成固定化酶括力的降低．在本实验中，固定化胰蛋白酶Ａ的最适给酶量为 ４５ｍｇ／ｇ载体．酶活回收率为５０％：固定化胰蛋白酶Ｂ的最适给酶量为４０ｍｇ／ｇ载体．酶活回 收率为５６％。由此可见，固定化胰蛋白酶Ｂ的给酶量虽少，但酶活力与酶活回收率都较高． 这可能与预交联的网状壳聚糖载体的多孔结构有关，固定化酶在载体上具有较大的自由空 间，故酶分子保持了较高的活性。
胰蛋白酶有着广泛的用途．但由于其易自消化、稳定性较差，它的应用受到了一定的 限制．考虑到这一特点，选择温和的条件制备固定化胰蛋白酶就显得尤为重要。在本研究 中，采用两种方法制各了壳聚糖固定化胰蛋白酶：～是用线型壳聚糖为载体．直接加入胰 蛋白酶和交联剂一戊二醛进行固定化反应：二是用网状壳聚糖为载体。即先用少量戊二醛 将线型壳聚糖预交联成网状壳聚塘后，再加入胰蛋白酶和一定量的交联剂戊二醛进行固定 化反应。第一种方法为常用的以壳聚糖为载体固定化酶的制备方法¨Ｊ．而第二种方法尚未 见报道。实验结果表明．两种方法制备得到的固定化胰蛋白酶具有一定的差异．进行深入 研究后对比发现，第二种方法效果更好，特别表现在酶的活性回收率更高及米氏常数与原
２．３蛋白质浓度的测定 参照文献∽采用Ｌｏｗｒｙ法测定。
２．４酶活力的测定 采用Ｆｏｌｉｎｌ６１原理测定胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶的活力。具体方法如下：以２％的