壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究

离子交换与吸附，２００２，１８（２）１２５～１３Ｉ ＩＯＮ ＥＸＣＨＡＮＧＥ ＡＮＤ ＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ 文章编号１００卜５４９３（２００２）０２－０１２５－０７
壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究＋
陈天
扬州大学理学院化学化工系，扬州２２５００２
摘要：以秃聚糖为栽体，戊二醛为交联剂．采用两种方法特备了固定化胰蛋白酶．考察了固定 化反应中ｐＨ值．戊二醛的浓度、吼及蛤酶量时固定化胰蛋白酶活力的影响，并研究了这两种 固定化胰蛋白酶的性质．实验结果表明，以戊二醛预交联的网状壳聚糖为栽体制备的固定化胰 蛋白酶具有更加优良的性能，在最佳固定化反应条件下．酶的活性回收率可速５６％．此固定化 胰蛋白酶的最连ｐＨ为７．¨８ ５、最适温度为６０℃．‰值为２．５２ｍｏＩ．ｔＬ．固定化腱蛋白醇表现出 了较好的热稳定性、ｐＨ棼存稳定性．殂及在乙醇水溶漶中的稳定性． 关键词：壳聚糖胰蛋白醇固定化醇 中囤分类号：０６４７ ３ 文献标识码：Ａ
酶：ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＴＯＲＩＥＳ（ＤＥＴＲＯＩＴ ＭＩＣＨＩＧＡＮ ＵＳＡ）产品：酪蛋白：上海化学试剂 站进口分装；其它试剂均为分折纯。
５３ＷＢ微机型紫外可见分光光度计（上海光学仪器厂）：ＳＨＺ－８２型水浴恒温振荡器（江 苏太仓医疗器械厂）：ＫＪ－ｌ型控温强磁力搅拌器（苏北生化仪器厂）；ＤＨ Ｓ－３型酸度计（上 海第二分析仪器厂）。
１前言
天然多糖甲壳素的脱乙酰基产物一壳聚搪具有良好的生物相容性与生物亲和性，它在 生物医药领域中的应用研究正蓬勃开展．它作为生物材料．用作固定化酶、亲和层析、金 属螯合亲和层折的载体前景十分广阔【１４ Ｊ。目前研制成功的固定化酶已有上百种．但由于 成本昂贵，真正应用于实际生产的品种为数不多。壳聚糖作为开发应用较晚的阳离子型多 糖用作固定化酶的载体，在结构上具有独特的优势．利用其分子侧链上大量的游离氨基， 再选择适当的交联剂．可以使得酶麸价结合于载体上的反应易于进行．此外壳聚糖还具有 良好的机械性能、耐热性、抗菌性等优点．
戊二醛的用量对固定化酶的活力具有显著的影响。在ｐＨ＝８．０的缓冲液中，固定给酶量， 加入一定量的戊二醛，使其终浓度变化范围为０．１～１．０％．分别制各固定化胰蛋白酶Hale Waihona Puke Baidu和固 定化胰蛋白酶Ｂ，然后测定固定化酶的活力。结果见图２．由图２可见．固定化胰蛋白酶 的活力先随着戊二醛浓度的增加而上升．达到最大值后则随着戊二醛浓度的增加而下降， 当戊二醛浓度为０．６％时，固定化胰蛋白酶Ａ的活力达到最大值；而当戊二醛浓度为Ｏ．４％ 时，固定化胰蛋白酶Ｂ的活力就达到了最大值．这是因为固定化胰蛋白酶Ａ的线型载体
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Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
２００２年４月
壳聚糖在与胰蛋白酶发生偶联作用时，分子链上的游离氨基之问也要进行交联反应，所以 消耗的戊二醛的量较多。而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体壳聚糖已用戊二醛预交联，当与胰蛋 白酶发生偶联反应时，消耗的戊二醛的量则相对较少。
３．１．３固定化反应中给酶量对固定化酶活力的影响 载体上偶联的酶量直接影响着固定化酶的活力。在最适ｐＨ（ｐＨ＝８．０）、最适戊二醛浓
３．２．４ 固定化胰蛋白醇的稳定性 分别考察了固定化酶的热稳定性、ｐＨ贮存稳定性以及在有机溶荆乙醇中的稳定性，
结果见图７￣９． 在０．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｆｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．０）中．以２％的酪蛋白为底物－加入一定量
的固定化酶或稀释后的原酶于６０＂Ｃ水浴中保温．不同时间后测定酶的活力（图７）·由图 ７可见，原酶在６０＂Ｃ保温ｌｈ活力丧失近４０％，保温３ｈ活力基本全部丧失．固定化胰虽
２．２固定化胰蛋白酶的制备 固定化胰蛋白酶Ａ（以线型壳聚糖为载体）：取～定量的壳聚糖溶于２％的乙酸水溶
液中，在快速搅拌下，滴加５％的氢氧化钠水溶液至溶液ｐＨ＝７．５．抽滤收集沉淀，可得壳 聚糖的白色细小颗粒。将上述经过再沉淀处理后的壳聚糖置于０．０５ｍｏ｜／Ｌ的Ｔｒｉｓ．Ｈｃｌ缓冲 液（ｐＨ＝８．ｏ）中，加入一定量的胰蛋白酶搅拌均匀后．再滴加～定量的戊二醛水溶液，在 磁力搅拌下反应６ｈ。抽滤，先用蒸馏水洗涤，再用上述缓冲液洗涤，直至洗涤液中检测不 到戊二醛和游离酶，真空干燥后即得颗粒状固定化酶。
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第１８卷第２期
离ｒ交换与吸附
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３结果与讨论
３．１ 固定化胰蛋白酶最佳条件的确定 ３．１．１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 固定戊二醛用量和给酶量，采用ｐＨ＝５．０一ｌＯ．０范围的缓冲液，分别制备固定化胰蛋白
酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，并测定固定化酶的活力，结果见图１。由图１可见，固定化反 应过程中的ｐＨ值对固定化酶的活力具有很大的影响。固定化胰蛋白酶Ａ，在ｐＨ＝７．０曲．０ 的范围内均具有较高的酶活力。而固定化胰蛋白酶Ｂ，则在ｐＨ＝７．０－８．５的范围内酶的活力 达到最大值。由于固定化胰蛋白酶Ａ的载体是线型壳聚糖，而固定化胰蛋白酶Ｂ的载体 是网状壳聚糖．它们在不同的口Ｈ条件下，分子链的构像可能不同，则与胰蛋白酶的结合 能力可能存在着一定的差异．同时胰蛋白酶在不同ｐＨ的缓冲液中也具有不同的分子构像， 这些都会影响固定化酶的活力。
但是，固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ范围有一定的差异．这可能与载 体的结构不同有关．从而造成了固定化酶分子所处的微环境有所不同．
３．２．２ 固定化胰蛋白酶的最适反应温度 取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，在Ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液（ｐＨ＝８．Ｏ）中，
温度３０曲０℃范围内，测定其对酪蛋白的水解活力，结果见图５。由图可见，原酶的最适 反应温度为５５℃；固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ的最适反应温度均为６０＂Ｃ，并 且在６０＂Ｃ，７０＂Ｃ之间均保持了较高的活力．说明胰蛋白酶用壳聚糖固定化后，其热稳定性 明显提高，可以在较高的温度下进行酶促反应。
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圈７胰蛋白酶的热稳定性（６０℃） ｔ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ固定化胰蛋白酵Ａ：ｃ原醇
其对底物酪蛋白的水解活力，结果见图４。由图可见，原酶的晟适ｐＨ值为８．０，并且酶活 力随ＤＨ值变化的曲线较为陡峭：而固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ的最适ｐＨ值 范围均有所扩大，分别在ｐＨ＝７．５—９．０和ｐＨ＝７．“８．５的范围内都保持了较高的催化活性。
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第１８卷第２期
离子交换与吸附
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反应条件下．与一定量不同浓度的酪蛋白溶液反应１０ｒａｉｎ．然后测定酶的活力，再用双倒 数作图法求出米氏常数（图６）．由图６计算得出原酶的墨．＝２．２８×１０＂３ｍｏｌＦＬ，；固定化胰蛋 白酶Ａ的赫．＝４．５０×１０一ｍｏｌ／Ｌ；固定化胰蛋白酶Ｂ的墨ｌ－２．５２ｘ１０—３１Ｄｏｌ／Ｌ．固定化胰蛋白酶 Ａ的米氏常数比原酶高出约１倍．表明其与底物的亲和力有所下降；但固定化胰蛋白酶Ｂ 的米氏常数只比原酶略有增大．表明其与底物的亲和力与原酶相差不大．说明用预交鞋的 网状壳聚糖固定化的胰蛋白酶分子具有与游离酶分子较为接近的构像．
胰蛋白酶有着广泛的用途．但由于其易自消化、稳定性较差，它的应用受到了一定的 限制．考虑到这一特点，选择温和的条件制备固定化胰蛋白酶就显得尤为重要。在本研究 中，采用两种方法制各了壳聚糖固定化胰蛋白酶：～是用线型壳聚糖为载体．直接加入胰 蛋白酶和交联剂一戊二醛进行固定化反应：二是用网状壳聚糖为载体。即先用少量戊二醛 将线型壳聚糖预交联成网状壳聚塘后，再加入胰蛋白酶和一定量的交联剂戊二醛进行固定 化反应。第一种方法为常用的以壳聚糖为载体固定化酶的制备方法¨Ｊ．而第二种方法尚未 见报道。实验结果表明．两种方法制备得到的固定化胰蛋白酶具有一定的差异．进行深入 研究后对比发现，第二种方法效果更好，特别表现在酶的活性回收率更高及米氏常数与原
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图３固定纯反应中蛤酶量对固定化酶活力的影响 ａ固定化磷蛋白酶Ａ： ｂ固定化胰蛋白酶Ｂ
图４ ｐＨ值对胰蛋白酶活力的影响 ａ固定化睦蛋白酶８：ｂ固定化魄蛋白酶Ａ：ｃ原酶
３．２固定化胰蛋白酶的酶学性质的研究 ３．２．１ 固定化胰蛋白酶的最适反应ｐＨ值 取一定量的固定化酶或稀释后的原酶，采用ｐＨ＝５．ｏ￣１０．０广范围的缓冲液．分别测定
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圈５温度对胰蛋白酶活力的影响 Ｌ固定化胰蛋白酶Ｂ：ｂ．固定化胰蛋白一＾，ｃ原醇
围６固定化酶与原酶的Ｌｉｎｃｗｃａｖｃｒ－Ｂｕｒｋ曲线 ｔ原酶：ｂ固定化麓蛋白■Ｂ；ｔ固定化胰蛋白醇Ａ
３．２．３ 固定化胰蛋白酶和原酶的束氏常数岛 各取多份相等质量的固定化胰蛋白酶Ａ或固定化胰蛋白酶Ｂ或稀释后的原酶，在最适
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白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ均具有较好的热稳定性，它们在６０＂Ｃ保温３ｈ活力几乎保持 不变，８ｈ以后活力缓慢下降．保温１０ｈ相对活力仍然保持在８５。９０％之间。由于游离的 液态胰蛋白酶具有自身消化现象，对热稳定性较差，而胰蛋白酶经壳聚糖固定化后对熟稳 定性有了显著的提高．
游离的液态胰蛋白酶在ｐＨ＝９．０的缓冲液中（不加底物），恒温２５＂（２放置２５ｈ活力几 乎完全丧失。图３为固定化胰蛋白酶Ａ与固定化胰蛋白酶Ｂ在ｐＨ＝５．０．１０．０的缓冲液中。 恒温２５℃放置７２ｈ后的相对活力．实验结果表明，固定化胰蛋白酶在ｐＨ＝７．０。１０．０范围 内都比较稳定，而固定化胰蛋白酶Ｂ的相对活力保持更高，说明相同条件下它的稳定性更 好。由于在固定化酶中载体壳聚糖对胰蛋白酶的静电作用，使得酶分子构象变得较为牢固， 所以固定化酶的抗酸碱能力有所增强。
ｔ牧聃日期２００２年ｊ月２２日 作者麓卉：陈天．盘＇（Ｔ９６Ｚ－）．江苏省＾．副教授
万方数据
酶较为接近ａ此实验方法也为壳聚糖用于其它酶的固定化提供了又一个可供选择的新的操 作方法。同时对这两种固定化胰蛋白酶的性质进行了详细的研究，为固定化胰蛋白酶的工 业应用提供了非常有用的实验数据。
２实验部分
２．１试剂与仪器 壳聚糖：自制，脱乙酰化度为９５％：戊二醛：Ｅ．Ｍｅｒｃｋ产品（浓度为２５％）；胰蛋白
２．３蛋白质浓度的测定 参照文献∽采用Ｌｏｗｒｙ法测定。
２．４酶活力的测定 采用Ｆｏｌｉｎｌ６１原理测定胰蛋白酶和固定化胰蛋白酶的活力。具体方法如下：以２％的
酪蛋白为底物．加入一定量的胰蛋白酶稀溶液或固定化胰蛋白酶．在４０＂Ｃ恒温振荡ｌＯｍｉｎ， 终止反应后取滤液用Ｆｏｌｉｎ试剂显色，测定其在波长６５０ｎｍ处的吸光度。
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图１ 固定化反应中ｐＨ值对固定化酶活力的影响 ｔ固定化胰蛋白酶Ａ． ｂ．固定化胰蛋白酶Ｂ
田２固定化反应中戊二鹾浓度对 固定化酶活力的影响
ｔ固定化胰噩白醇Ａ： ｂ固定化馥蛋白酶Ｂ
３．１．２固定化反应中戊二醛浓度对固定化醇活力的影响 以戊二醛为变联剂制备固定化酶时．由于戊二醛既是反应的交联剂，又是酶的变性剂．
度（固定化胰蛋白酶Ａ：０．６％：固定化胰蛋白酶Ｂ：０．４％）时，固定载体用量，改变酶的 投料量．分别制备固定化胰蛋白酶Ａ和固定化胰蛋白酶Ｂ，其活力测定结果见图３。由图 ３可见，开始时，固定化酶的活力随着给酶量的增加而升高，当给酶量增加到一定量时， 固定化酶的活力达到最大值后，则固定化酶的活力反而随着给酶量的进一步增加而下降， 这是因为固定化酶的活力并不与载体负载的酶量成正比。当载体负载的酶量达到一定量 后，再增加给酶量反而会增加固定化酶分子之间的拥挤程度，使之与底物结合时的空间阻 碍增大，造成固定化酶括力的降低．在本实验中，固定化胰蛋白酶Ａ的最适给酶量为 ４５ｍｇ／ｇ载体．酶活回收率为５０％：固定化胰蛋白酶Ｂ的最适给酶量为４０ｍｇ／ｇ载体．酶活回 收率为５６％。由此可见，固定化胰蛋白酶Ｂ的给酶量虽少，但酶活力与酶活回收率都较高． 这可能与预交联的网状壳聚糖载体的多孔结构有关，固定化酶在载体上具有较大的自由空 间，故酶分子保持了较高的活性。
固定化胰蛋白酶Ｂ（以网状壳聚糖为载体）：取一定量的壳聚糖溶于ｔ％的乙酸水溶 液中，在磁力搅拌下，滴加２％的氨氧化钠水溶液至溶液ｐＨ＝５．５后，加入一定量的戊二 醛水溶液反应１ｈ，然后再在快速搅拌下滴加５％的氢氧化钠水溶液至溶液ｐＨ＝７．５，抽滤 收集沉淀．可得预交联的网状壳聚糖的白色细小颗粒。胰蛋白酶固定化操作方法同上。