氨氧化古核生物

文章编号： １０００－１３３６（２００９）05－0755-05

氨氧化古核生物

魏　博 张舒婷 于　鑫

（中国科学院城市环境研究所，厦门　３６１０２１）

摘要：氨氧化古核生物（ＡＯＡ）是新为人们所知的氨氧化微生物。ＡＯＡ的生理特征、生态分布，以及在不同生境中与氨氧化细菌（ＡＯＢ）的比较等研究，显示了他们在自然环境中有着数量大，分布广，种类多等特征。本文对近年来ＡＯＡ的研究现状、争论、前景和应用进行了综述。关键词：氨氧化古核生物；氨氧化细菌；氨单加氧酶基因中图分类号：Ｑ８９

收稿日期：２００９－０４－２８

国家自然科学基金（５０６７８０８０）资助

作者简介：魏博（１９８１－），男，博士，助理研究员，Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｗｅｉ＠ｉｕｅ．ａｃ．ｃｎ；张舒婷（１９８５－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｔｚｈａｎｇ＠ｉｕｅ．ａｃ．ｃｎ；于鑫（１９７３－），男，博士，研究员，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：　ｘｙｕ＠ｉｕｅ．ａｃ．ｃｎ

硝化作用是全球氮循环中的关键一环，氨氧化则是硝化作用的限速步骤。因此微生物的氨氧化作用显得至关重要。过去的研究认为氨氧化细菌（ａｍｍｏｎｉａ　ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　ＡＯＢ）是主要的氨氧化者。然而近年来的环境基因组学研究发现，泉古核生物（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）中存在有氨氧化能力的成员［１，２］，它们被称作氨氧化古核生物（ａｍｍｏｎｉａ　ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ　ａｒｃｈａｅａ，ＡＯＡ）。氨氧化古核生物也具有能够将氨转化为羟胺的氨单加氧酶（ａｍｍｏｎｉａ　ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，　ＡＭＯ）。越来越多的证据表明，ＡＯＡ广泛分布在各种非极端环境，且丰度和多样性高于ＡＯＢ，不再仅局限于最初认为的嗜热泉古核生物（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）中。本文主要讨论了ＡＯＡ在氮素生物地球化学循环过程中的作用以及与污染治理与环境保护相关的一些特性等。

１．　已发现的氨氧化古核生物

１．１　Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ 已知的氨氧化古核生物来自泉古核生物类群，可培养的种类非常稀少。分离于海水水族箱生物滤池的古核生物Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓｍａｒｉｔｉｍｕｓ，被证实能够将ＮＨ＋４氧化成ＮＯ−２，通过氧化ＮＨ４＋而获得生长所需能量［３］。Ｎ．　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ菌体短

杆状，直径约０．１７￣０．２２　ｍｍ，长约０．５￣０．９　ｍｍ，体积小于ＡＯＢ。该菌以重碳酸盐作为惟一碳源，属于化能自养型。生长１２天后可达对数生长期，黑暗培养，温度２８ºC ，ｐＨ值７．０￣７．２；最大比生长率为０．７８／ｄａｙ，高于自然条件下生长率；氨氧化作用主要发生在对数生长期［３］。无机培养基上生长，微量的有机物即可明显抑制该菌。该菌含有二烷基甘油酯四醚（ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｄｉｂｉｐｈｙｔａｎｙｌ　ｇｌｙｃｅｒｏｌｔｅｔｒａｅｔｈｅｒ，　ＧＤＧＴ）膜脂［４］。而且，Ｎ．　ｍａｒｉｔｉｍｕｓ是已知氨氧化古核生物中惟一量化了氨氧化反应的菌株，经测定该菌氨氧化的反应式［３］为：

ＮＨ３＋１．５Ｏ２　→　ＮＯ２−＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ＋ （∆Ｇ０＝−２３５　ｋＪ·m ｏｌ−１　）１．２　Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｎｉｔｒｏｓｏｃａｌｄｕｓ　ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ 嗜热泉古核生物（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ　Ｎｉｔｒｏｓｏｃａｌｄｕｓ　ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ）发现于黄石公园热泉沉积物中，是可通过氨氧化作用获取能量的化能自养菌［５］。形状为球型或短棒状，以ＮＨ３Ｃｌ和重碳酸盐作为惟一能源和碳源、黑暗生长、最适生长温度为６０￣８０ºC ，最适氨氧化反应温度在７２ºC 。该菌在自然界中存在的温度上限达到７４ºC 。ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＮ．　ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ在好氧环境下生长，经过１４４小时的培养，几乎将浓度为０．９　ｍＭ的ＮＨ４＋完全氧化［５］。该菌也含有ＧＤＧＴ［５］。

１．３　Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ　ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ　ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ是与海绵Ａｘｉｎｅｌｌａ　ｍｅｘｉｃａｎａ共生的海洋泉古核生物，最早发现于１９９６年，基因组学研究证实了该菌有氧化ＮＨ４＋的能力［６］。它的自然最适温度为１０ºC ，推测

温度范围在８￣１８ºC［６］。尽管目前还未能室内培养，通过基因组分析以及对它的能量代谢和碳同化进行预测，研究者们推测该菌有同时利用ＣＯ２和有机碳的能力，属混合营养型［６］。Ｃ．　ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ的基因组平均ＧＣ含量为５７．７４％，拥有２０１７个编码蛋白的基因。基因组包含编码氨透性酶的基因和氨氧化功能的基因，缺少细胞色素Ｃ基因，研究者认为该菌的能量来源于氨氧化作用［６］。

１．４　其他 Ｈａｔｚｅｎｐｉｃｈｌｅｒ等［７］经过六年的富集培养，从热泉样品中分离出氨氧化古核生物富集物，并确定其中不含ＡＯＢ。该富集物被命名为ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＮｉｔｒｏｓｏｓｐｈａｅｒａ　ｇａｒｇｅｎｓｉｓ。４６ºC条件下，ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＮ．　ｇａｒｇｅｎｓｉｓ在ＮＨ４＋浓度为０．１４￣０．７９　ｍＭ时的氨氧化活性最大，而在ＮＨ４＋浓度为３．０８　ｍＭ时生长受到抑制［７］。这样低的ＮＨ４＋抑制浓度在ＡＯＢ中未曾发现。

已知的ＡＯＡ与ＡＯＢ菌种在生长速度，最适生长条件以及营养能量代谢方面均有显著不同。但目前对ＡＯＡ其他的代谢途径了解有限，众所周知泉古核生物使用３－羟基丙酸固碳途径，ＡＯＢ则利用开尔文循环。可利用相同底物的特征必然导致它们之间的竞争，而不同的碳代谢特征意味着两者生态位的不同。

２．　古核生物氨单加氧酶基因（ａｍｏ）

２．１　古核生物ａｍｏ的发现和证实 氨单加氧酶（ａｍｍｏｎｉａｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ，　ＡＭＯ）是负责将氨转化为羟胺的关键酶，也是ＡＯＡ和ＡＯＢ的共同特征，但两者的ＡＭＯ的编码基因又存在明显差异。ＡＭＯ由Ａ、Ｂ和Ｃ三个亚基组成（分别是ａｍｏＡ、ａｍｏＢ和ａｍｏＣ三个基因的编码产物）［１］。ａｍｏ是ＡＯＡ氨氧化的最初证据，马尾藻海中的环境基因组研究中，也发现了携带ａｍｏ的古核生物基因组片段，证明了海洋中可能存在古核生物介导的硝化途径［１］。在Ｎ．　ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ菌的基因组中ａｍｏＣ并未与其他两个基因连锁［５］，而Ｃ．ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ菌除了含有ａｍｏＡ、ａｍｏＢ和ａｍｏＣ基因外，还具有化能自养氨氧化过程相关的其他基因［６］。

Ｔｒｅｕｓｃｈ等［８］在土壤样品中进行的原位ＲＴ－ＰＣＲ实验证明了古核生物ａｍｏＡ在环境中的表达。通过施加氨水孵育土壤样品的实验还证明了古核生物ａｍｏＡ表达量随加入ＮＨ４Ｃｌ量的增加而提升［８］。这些实验证实了古核生物ａｍｏ与氨氧化作用的关系。目前古核生物ａｍｏＡ已经成为判定ＡＯＡ的分子标记并广泛使用。截至２００９年３月ＧｅｎＢａｎｋ中古核生物ａｍｏＡ的序列信息已经大于１６，０００条，而古核生物ａｍｏＢ和ａｍｏＣ的序列信息分别仅约８０条和２０条。目前最常被用于检测古核生物ａｍｏＡ的引物和Ｔａｑｍａｎ探针的序列信息见表１。

２．２　ａｍｏＡ的序列特征 选择ａｍｏＡ作为分子标记，是因为ａｍｏＡ序列更加保守，有学者认为ａｍｏＡ的核酸序列相似度大于７０％，氨基酸序列大于６５％［１］。古核生物ａｍｏＡ与古核生物１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因的系统发育关系相一致［２］。而且ａｍｏＡ在细胞内的拷贝数也相对稳定，在海洋ＡＯＡ基因组中有１￣３个ａｍｏＡ的拷贝［１０］；对应的ＡＯＢ基因组中含有２￣３个ａｍｏＡ的拷贝［１１］。我们随机选择了ＧｅｎＢａｎｋ中两类ＡＭＯ氨基酸序列进行比对，并使用ＰＡＭＬ［１２］软件包中ｃｏｄｅｍｌ程序对相应的ＤＮＡ序列进行分析，发现两类序列的各位点ｄＮ／ｄＳ（非同义突变率／同义突变率）都小于１，即说明两类ａｍｏＡ都受到净化选择（排除有害突变的选择）的影响。但是，古核生物ａｍｏＡ序列比细菌ａｍｏＡ序列的变异更大，保守区域更短，存在许多相似度很低的区域（图１）。这样的特征说明古核生物的ａｍｏＡ受到的选择压力可能小于细菌ａｍｏＡ，拥有更高的多样性。

３．　氨氧化古核生物的自然分布

泉古核生物是自然界重要的微生物类群，数量巨大，约占总海洋超微型浮游生物（ｐｉｃｏｐｌａｎｋｔｏｎ）的２０％，占土壤总原核生物量的５％［１３］。目前ＡＯＡ的群落调查主要基于分子生物学技术。对取自不同环境的古核生物ａｍｏＡ进行系统发育分析后发现，ＡＯＡ的遗传多样性丰富，可分为土壤、沉积物和水三大类，相互很少重叠［１４］。

我国北方长期施氮肥的盐碱土壤样品中，古核生物ａｍｏＡ的多样性以及拷贝数都高于ＡＯＢ［１５］。土壤ｐＨ值条件会影响ａｍｏＡ基因的多样性、丰度和表达，古核生物ａｍｏＡ的多样性和表达量随ｐＨ值升高而降低［９］。欧洲草原和农田土壤样品里，古核生物ａｍｏＡ的拷贝数高于ＡＯＢ的，二者的比例在１．５倍至３０００倍之间，该比例随土层深度增加而增大，７０　ｃｍ深处比值达到最大；ａｍｏＡ表达量的比率变化也一致［１６］。Ｔｏｕｒｎａ等［１７］的研究结果显示土壤温度变化对ＡＯＡ的群落结构影响大于ＡＯＢ。

Ｓａｎｔｏｒｏ等［１８］发现河口沉积物中，盐度和溶解氧