细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)

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细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)简介：自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。

单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine ,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长。

阻断滤光片波长。

Leagene 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，适用于培养细胞的自噬染色，又称为MDC 染色液，可与EB 合用双染。

组成：自备材料：1、荧光显微镜2、低速离心机3、 EB4、载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：(一)、MDC 单独染色：1、用去离子水稀释1×Wash buffer 。

2、离心，收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞，弃上清。

3、加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度。

4、取适量的细胞悬液至新的EP 管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。

5、室温避光染色15～45min 。

6、离心，收集细胞，用 1×Wash buffer 清洗细胞，弃上清。

7、加入Collection buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。

编号名称 DA0041 Storage 试剂(A): MDC Stain 1ml -20℃ 避光试剂(B): 10×Wash buffer 20ml 4℃ 试剂(C): Collection buffer 10ml 4℃ 使用说明书 1份8、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长，阻断滤光片波长)，计数并拍照。

(二)、与EB双染色：1、用去离子水稀释1×Wash buffer至1×。

碧云天细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)说明书

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介：碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。

自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。

自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。

自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。

由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。

MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。

MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体(autophagosome)，也称autophagic vacuole ，因而常用于细胞自噬的检测。

MDC 是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC 染色，因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。

本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测，不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。

使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察，也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。

荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发，发出绿色荧光。

荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可)，发射波长为512nm (510-540nm 均可)。

本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。

图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。

细胞自噬预实验

细胞自噬预实验化学染色法1、试验目的通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。

2、试验原理3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。

它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。

AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。

所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。

3、试验材料及试剂HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。

实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。

4、试验方法1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物处理48h。

2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。

3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。

4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。

MDC染色液

MDC 染色液简介：自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。

单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm 。

Leagene MDC 染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB 合用双染。

产品组成：自备材料：1、低速离心机2、 1.5ml 离心管3、载玻片、盖玻片4、荧光显微镜操作步骤(仅供参考)：1、收集细胞，用300～500μl 的Wash buffer 清洗细胞1次，800～1000g 离心5min ，弃上清。

2、加入适量的Stain buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。

3、取90μl 细胞悬液至新的1.5ml 离心管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。

4、 37℃或室温避光染色。

5、 800～1000g 离心5min ，弃上清，收集细胞，用Wash buffer 清洗细胞2次，800～1000g 离心5min ，弃上清。

6、加入Wash buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。

7、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm)，计数并拍照。

(二)96孔板法1、配制MDC 染色工作液：按MDC Stain ：Stain buffer=的比例混合，即为MDC 染色编号名称 DA0040 Storage MDC Stain 2×1ml -20℃ 避光使用说明书 1份工作液。

如不能及时用完，应-20℃避光保存。

2、轻轻吸除96孔板中的培养液，加入MDC染色工作液至各孔，37℃5%CO2避光孵育。

细胞凋亡、自噬、坏死

束生命的过程。从形态学上看，首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去
微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝
聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚
集在一起，被反折的细胞膜包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状
突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptotic body)；最后凋亡
一、细胞凋亡、自噬、坏死概念
细胞死亡是指细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和
功能丧失等不可逆性变化，其一般分为程序性细胞死亡和非程序细胞死亡，细胞
凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)属于前者，细胞坏死(necrosis)属于后者。
细胞凋亡是一个主动的通过调控一系列基因的活化和表达等使细胞自动结
植物）中，为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或
有缺陷的细胞器。
细胞坏死是一个被动的因极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的
细胞损伤和死亡。细胞坏死的结局与细胞凋亡类似，坏死过程中细胞膜通透性增
高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，染色质随机降解，早期核无明显形态学
变化，最后细胞破裂；另外坏死的细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，
细胞坏死
四、检测方法细胞凋亡检测方法在之前已经讲过，此处就不列举了。细胞自噬检测方法： 1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构，继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体
被双层膜结构的变形或肿大
自噬泡包裹，最终

蛇葡萄素通过PI3K

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＢＩ２５３６ａｎｄＧＷ８４３６８２ＸｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＡ５４９ａｎｄＨｅＬａｃｅｌｌｓａｎｄｂｌｏｃｋｅｄｔｈｅｍｉｎＧ２／Ｍｐｈａｓｅ．Ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ（ＰＳ３４１）ｗｅａｋｅｎｅｄｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｓｂｌｏｃｋｅｄｉｎＧ２／ＭｐｈａｓｅａｎｄａｂｎｏｒｍａｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｉｎＥ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＢｏｒｔｅｚｏｍｉｂｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｕｓｅｏｆｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂａｎｄＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｓｈｏｕｌｄｂｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｈａｖｅｔｈｅｒｉｓｋｏｆｄｒｕｇｅｆｆｉｃａｃｙｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄｉｔｉｓｓｐｅｃｕｌａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｉｎｖｏｌｖｅｔｈｅａｂｎｏｒｍａｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｃｙｃｌｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＬＫ１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ；ｔｕｍｏｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；Ｇ２／Ｍｐｈａｓｅ；ｃｙｃｌｉｎｓ；ｃｙｃｌｉｎＥ１网络出版时间：２０２３－１０－３０１８：５７：０８　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２３１０２７．１５３３．０４０蛇葡萄素通过ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ通路诱导人宫颈癌细胞ＳｉＨａ自噬邹　雪，熊晓妹，杨晓利，廖思雨，许诗怡，张秀桥，桂　春（湖北中医药大学药学院，湖北武汉　４３００６５）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０６０４８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１１－２１２１－０８中国图书分类号：Ｒ２８２７１；Ｒ３９２；Ｒ３９４２；Ｒ７３７３３摘要：目的　研究蛇葡萄素（ａｍｐｅｌｏｐｓｉｎ，ＡＭＰ）诱导人宫颈癌细胞ＳｉＨａ发生自噬及其可能的作用机制。

自噬研究方法

MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。

临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。

另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。

24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。

我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究

中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【摘要】目的探究中波紫外线(UVB)诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT自噬效应及其信号通路.方法 30 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后,透射电镜和MDC染色法观察自噬小体的变化,Western Blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化.结果 30mJ/cm2 UVB照射24 h后,电镜下可见自噬小体增多,内含待降解的细胞器和折叠蛋白;MDC染色可见细胞自噬囊泡增多,荧光强度增强;Western Blot结果显示自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和SQSTM1表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达增加,p-mTOR表达降低;运用3-Methyladenine(3-MA)和siATG5抑制自噬后,LC3-Ⅱ表达降低,细胞凋亡率增加,增殖减慢,凋亡蛋白Cleaved-PARP表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达下降,p-mTOR表达增加.结论 UVB通过AMPK/mTOR通路诱导了HaCaT细胞的保护性自噬.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)012【总页数】6页(P1910-1914,1919)【关键词】中波紫外线;人永生化角质形成细胞;自噬;凋亡【作者】王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【作者单位】南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515【正文语种】中文日光中的紫外线，尤其是中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人体表皮细胞损伤最常见的环境因素之一。

溶酶体膜蛋白sidt2不通过抑制自噬溶酶体途径介导细胞凋亡

目前，溶酶体为细胞稳态关键调节剂的角色［1］。

作为溶酶体中众多特殊蛋白质的一种，溶酶体膜蛋白的作用与机制以及相应的生理学功能在其维持细胞稳态中发挥了重要作用［2］。

研究报道，人肾优势蛋白NCU-G1作为一种高度保守的蛋白质，其缺失会导致小鼠自发性的肝纤维化［3］。

溶酶体相关膜糖蛋白3通过影响小鼠气道阻力，在调节肺表面活性剂稳态方面至关重要［4］。

在帕金森病相关的小鼠模型中，跨膜蛋白175能够影响运动损伤和多巴胺能神经元的数量，而在帕金森病中起到重要作用［5］。

因此，了解溶酶体膜蛋白参与的发生发展Lysosomal membrane protein Sidt2knockout induces apoptosis of human hepatocytes in vitro independent of the autophagy-lysosomal pathwayXU Jiahao 1,2,3,GENG Mengya 1,2,3,LIU Haijun 4,5,PEI Wenjun 4,GU Jing 1,2,3,QI Mengxiang 3,ZHANG Yao 4,5,LÜKun 6,7,SONG Yingying 1,2,3,LIU Miaomiao 4,HU Xin 1,2,3,YU Cui 8,HE Chunling 1,WANG Lizhuo 4,5,GAO Jialin 1,2,4,6,71Department of Endocrinology and Genetic Metabolism,2Institute of Endocrine and Metabolic Diseases,Yijishan Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241002,China;3School of Clinical Medicine,4Anhui Provincial Key Laboratory of Biological Macro-molecules Research,5Department of Biochemistry and Molecular Biology,6Central Laboratory,7Anhui Provincial College Key Laboratory of Non-coding RNA Transformation Research on Critical Diseases,Wannan Medical College,8Department of Endocrinology,Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241002,China摘要：目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。

细胞自噬相关通路关键分子的检测方法

细胞自噬是一种重要的细胞生物学过程，涉及多个关键分子和通路。

以下是一些常用的检测方法，用于研究细胞自噬相关通路的关键分子：
1. 免疫荧光染色：通过使用特异性抗体标记关键分子，然后观察其在细胞中的分布和表达水平变化。

例如，可以使用LC3B抗体来标记自噬囊泡膜结构，并观察自噬囊泡的形成和降解。

2. 免疫印迹（Western blot）：通过提取细胞蛋白质并使用特异性抗体进行免疫印迹分析，以检测关键分子的表达水平变化。

例如，可以检测LC3B-II（转化后的形式）和p62等自噬相关蛋白的表达水平。

3. 转基因小鼠模型：利用基因工程技术构建具有特定基因缺陷或突变的小鼠模型，从而研究关键分子对细胞自噬的影响。

通过对这些小鼠进行组织或细胞水平的分析，可以评估关键分子在自噬调控中的作用。

4. 实时荧光显微镜：利用荧光标记的自噬囊泡膜结构或关键分子，观察细胞内自噬过程的实时动态变化。

例如，可以使用mCherry-GFP-LC3B融合蛋白来监测自噬囊泡的形成和降解过程。

5. 基因组学和转录组学方法：通过测定关键分子的基因表达水平变化和调控机制，以了解自噬相关通路的调控网络。

这包括RNA测序（RNA-seq）和质谱法等高通量技术。

这些方法的选择取决于具体研究问题和实验要求。

综合应用多种技术可以更全面地揭示细胞自噬相关通路的关键分子的功能和调控机制。

1。

细胞自噬检测的具体步骤及方法

细胞自噬检测的具体步骤及方法一、自噬体介绍自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。

细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。

随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。

自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

自噬信号通路：二、自噬研究策略和方法正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有：1、自噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。

2、自噬抑制剂a) 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。

3、自噬检测1) 透射电镜；电镜作为自噬检测的金指标。

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

细胞自噬检测

2.5细胞裂解细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。

所有操作在冰上进行。

最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中。

把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中。

根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一200川TAPBu价r)。

放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。

在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一步实验，丢弃沉淀。

2.13细胞自噬活性的检测我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理，二药物RaPamycin处理。

对于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。

在37“C培养箱中培养2一4h。

对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。

细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一条是通过转染GFP一LC3，再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。

二是用westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。

对于荧光显微镜分析，在U20S细胞中转染GFP一LC3，24h之后，把细胞继代培养在有盖玻片的6孔板中，诱导自噬，吸去培养液，用PBS小心润洗玻片1次，在每个孔内加入3%的多聚甲醛，在室温下闭光摇晃培养玻片20min。

用PBS洗涤玻片3次，每次每孔加2mlPBS在室温下摇晃10min，用固定液把盖玻片固定在载玻片上，在室温下干燥1min之后用荧光显微镜观察。

对于westemblotting，从培养皿上收集药物或饥饿处理之后的细胞，加入1‘SDS蛋白上样缓冲液，并用超声波处理直到不粘稠为止，95“e煮沸样品5min，室温下高速(100009)离心5min，通过SDs一pAGE并用LC3的抗体(sigma)进行westemblotting 检测，自噬活性越高的细胞内LC3n的条带浓度越高。

二氢杨梅素的体外护肝作用：基于脂噬介导的LO2细胞脂质蓄积及HepG2细胞增殖

Dihydromyricetin reduces lipid accumulation in LO2cells via AMPK/mTOR-mediated lipophagy pathway and inhibits HepG2cell proliferation in vitroLIAO Xiaoshan 1,HAO Yuting 1,WU Mengting 1,LIU Huiping 2,JIANG Liang 2,YE Zichong 1,LIAO Wenzhen 1,DENG Hong 11Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2ERA (Shenzhen)Biotechonology,Shenzhen 518000,China摘要：目的基于脂噬途径研究二氢杨梅素（DMY ）对LO2细胞脂质蓄积的防治效果及其机制，并探索其对HepG2细胞的增殖抑制。

方法FBS 诱导LO2细胞建立脂肪变性模型，研究分别设置对照组：10%FBS-DMEM 正常培养；模型组：50%FBS-DMEM ；阳性对照组：100μg/mL DMY+10%FBS-DMEM ；处理组（L-DMY 组：50μg/mL DMY+50%FBS-DMEM ；M-DMY 组：100μg/mL DMY+50%FBS-DMEM ；H-DMY 组：200μg/mL DMY+50%FBS-DMEM ）及恢复对照组：先50%FBS-DMEM 培养，后10%FBS-DMEM 培养。

油红O 染色测定脂滴累积。

试剂盒测定TC 、TG 、LDL 水平和AST 、ALT 和LDH 酶活性。

AO 染色观察自噬溶酶体数量，透射电镜观察自噬体数量。

Western blot 检测自噬蛋白LC3表达量。

mdc染色原理

mdc染色原理
MDC染色原理是指使用一种特殊染料——MDC（7-羟基-9,10-二甲氧基-7,8,9,10-四氢-6-苯并[cd]异噻吩-3,4-二酮甲酯）对细胞或组织进行染色。

MDC属于荧光染料，可以与细胞内的各种器官和分子发生特异性染色。

MDC的染色原理是利用其分子结构中的双键和杂环结构，在细胞内的膜、溶酶体、内质网、高尔基体等结构中发生荧光染色。

MDC能够形成具有荧光性的复合物，并且只与一些特定的细胞器结构发生结合，因此可用于研究细胞器的形态和功能。

此外，MDC染色还可以用于检测自噬的程度，因为自噬过程中产生的自噬体可以与MDC形成特异性的染色。

总之，MDC染色原理是基于其分子结构和特异性染色作用，用于研究细胞器形态和功能以及自噬过程的染色方法。

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抑制细胞自噬提高KPT-330抗套细胞淋巴瘤效应

抑制细胞自噬提高KPT-330抗套细胞淋巴瘤效应张永利;陈昱函;郑瑞玑;张可杰【期刊名称】《中国实验血液学杂志》【年(卷),期】2024(32)2【摘要】目的:探讨新型CRM1抑制剂(KPT-330)对套细胞淋巴瘤(MCL)细胞自噬的影响,以及有无自噬溶酶体抑制剂,KPT-330对MCL细胞增殖的影响。

方法:应用CCK-8法检测KPT-330体外对MCL细胞(Z-138、Jeko-1、Granta-519、Rec-1)增殖的影响;通过MDC染色分析自噬体的形成和Western blot检测LC3B的切割以探讨KPT-330对MCL细胞自噬的影响;进一步联合应用自噬溶酶体抑制剂氯喹(CQ),观察其对KPT-330导致LC3B-Ⅱ增加的影响。

通过CalcuSyn联合用药软件分析CQ与KPT-330的联合用药指数(Combination index,CI)。

结果:新型CRM1抑制剂KPT-330对MCL细胞株(Z-138、Jeko-1、Granta-519、Rec-1)的增殖有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性(r分别为:0.930,0.946,0.691,0.968)。

KPT-330作用于Jeko-1细胞和Granta-519细胞后,导致自噬泡形成增加,LC3B-Ⅱ表达增加,并具有浓度依赖性(r=0.993,r=0.971),表明,KPT-330导致MCL细胞自噬体形成增加。

CQ联合KPT-330导致Jeko-1、Granta-519细胞LC3B-Ⅱ表达高于单药CQ或单药KPT-330(P<0.05)。

CalcuSyn 2.0软件分析结果提示KPT-330和CQ 联合应用可以产生协同抗MCL效应。

结论:新型CRM1小分子靶向抑制剂KPT-330具有体外抑制MCL细胞株Z-138、Jeko-1、Granta-519、Rec-1增殖,诱导Jeko-1、Granta-519细胞自噬的作用;KPT-330联合CQ可产生协同抗MCL作用,为临床联合用药提供了实验依据。

自噬活性改变对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

自噬活性改变对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响李军;王倩;林小星;李炳宗【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(41)6【摘要】目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)自噬活性的改变对其向成骨细胞分化能力的影响,初步探讨自噬在骨髓MSCs成骨分化中的作用.方法不同浓度的雷帕霉素处理骨髓MSCs 48 h后,向成骨细胞诱导分化2周.免疫荧光激光共聚焦法检测LC3表达;单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色检测自噬囊泡;Western blot检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达;实时定量PCR检测成骨相关基因ALP和Runx2表达;Von Kossa染色检测钙质沉积程度改变.结果经雷帕霉素处理后,激光共聚焦和Western blot检测均可见骨髓MSCs中LC3的表达明显增加;自噬囊泡数量增加;成骨相关基因ALP和Runx2的mRNA表达量明显减少;Von kossa染色可见MSCs钙质沉积程度减弱.上述改变呈剂量依赖性.结论骨髓MSCs的基础自噬活性较低,雷帕霉素能够增加骨髓MSCs的自噬活性,但同时减弱其向成骨细胞分化的潜能.自噬可能参与骨髓MSCs向成骨细胞分化的过程.%Objective To observe the change of osteogenic potential of bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs)after pretreatment with rapamycin which activates the autophagic activity,so as to explore the role of autophagy in the osteogenic differentiation of MSCs. Methods MSCs were induced to osteogenic differentiation for two weeks after pretreatment with rapamycin for 48 h. Immunocytochemistry with confocal technique was used to assess the localization of LC3. Autophagic vacuoles werecharacterized by monodansylcadaverine(MDC)staining. Real time RT PCR was employed to detect the expression of alkaline phosphatase(ALP) and Runx2. The expression levels of LC3 I and LC3 Ⅱ were detected by using Western blot. Calcium deposit was assessed by Von Kossa staining. Results After treatment with rapamycin,the expression of LC 3 was sig nificantly increased in MSCs. The number of autophagic vacuoles in MSCs was also increased. The mRNA expression levels of osteogenesis related genes ALP and Runx2 were decreased,and calcium deposit was reduced after pretreatment with rapamycin. These changes were dose dependent. Conclusion The bone marrow deprived MSCs possess a relatively low basic level of auto phagy. Rapamycin promoted autophagic activity of MSCs,while weakened the osteogenic differentiation potential of MSCs. Au tophagy may participate in the osteogenic differentiation of MSCs.【总页数】5页(P675-679)【作者】李军;王倩;林小星;李炳宗【作者单位】苏州大学附属第二医院血液科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院血液科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院血液科,苏州,215004;苏州大学附属第二医院血液科,苏州,215004【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.Wnt3a信号分子对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中端粒酶活性的影响 [J], 胡江伟;王亮;马远征;张妍;杨帆;杨国花;王文娇;付雪梅2.iRoot BP Plus对骨髓间充质干细胞成牙/成骨分化及自噬的影响 [J], 陆嘉敏; 闫明; 李泽汉; 吴潇; 于金华3.高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化和线粒体自噬相关性的研究 [J],关淼升;王潇宇;刘琳;傅博;王田田;沈婉君;李鸿波4.hsa_circ_0003188对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响 [J], 梁甲武;胡巍;屈爽;袁一方;郭斌5.镁离子激活自噬促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的体外实验观察 [J], 王桂芳;吕凯歌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。