宏基因组测序简介(发布版)
完整版)宏基因组测序讲解
完整版)宏基因组测序讲解宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。
宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。
它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。
一般XXX包括从环境样品中提取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。
所有带有宏基因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。
对于宏基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表型功能筛选和序列基因型分析两类。
表型功能筛选是利用模式微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。
而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。
一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的信息。
XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的新的微生物研究方法。
它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。
提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键之一。
宏基因组学
广义的宏基因组：特定环境下所有生物遗传物质的总和 狭义的宏基因组：特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和
宏基因组测序（Metagenomics Next Generation Sequencing,mNGS)
NGS:也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS:m指宏基因组。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利 用高通量测序平台进行基因组DNA测序，DNA不需要进行PCR扩增，测序结果具有较好的无偏性， 不仅可以提示微生物群落的物种组成，更能获需段序列分析不依赖 于任何已知序列信息进行筛选。其中以功能筛选法最为常用。
能够直接发现全新的活性物质和功能编码基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子 缺陷：
工作量大,效率低，并且受检测手段有效性和灵敏性等限制。
谢谢！请大家批评指正
其前端关键性技术是环境DNA(e DNA)的提取A的提取
直接提取法（原位提取法） 不经过样品中微生物的培养和分离，通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释 放，并对DNA进行纯化。 操作简便、省时、成本低，所获得DNA具有较好的完整性，并能够代表某一生境的微生物群落多样性。 但常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题，所以一般需要进一步的 DNA纯化处理，同时所提取获得的DNA片段较用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物 细胞提取DNA。 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较少，纯度较高、DNA完整性好(20kb~大、DNA得率较低，其产率只是直接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往 往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序
宏基因组测序环境中超过99%的微生物是不可培养的，很多致力于研究微生物多样性的努力由于培养方法的限制而受到制约，为了克服由培养技术所带来的困难和限制，多种以DNA为基础的分子生物学的方法已经被开发。
目前16s rDNA测序可以提供大量关于环境微生物的群落及种类信息，但是在种群中不同微生物的作用以及其携带的基因组信息基本不能体现出来。
相比之下，宏基因组是一种新的，可用于快速分析微生物复杂基因组的方法，它提取环境中的全基因组DNA，构建DNA文库并进行高通量测序。
对数据进行分析，不仅能够获得环境中微生物的组成及丰度信息，还可以通过相关功能及代谢通路注释，获得这些微生物全面的微生物基因组信息，以及在环境中可能的功能。
技术参数样品准备测序策略推荐数据周期3ug DNA 300bp DNA文库HiSeq PE150测序一般测序数据量：5Gb clean data大测序数据量：10Gb clean data40个工作日建库方法技术流程技术特点（1）无需分离培养，直接提取样本DNA测序；（2）群落多样性、种群结构、进化关系、功能组成、相互协作关系等多种分析；（3）高效、高通量，一次性获取样本中所有微生物组成等信息。
部分结果展示进化树分析OTU维恩图抗生素类型统计图案例解析排泄物微生物宏基因组可作为结直肠癌标志物为了评估利用排泄物诊断结直肠癌的可行性，作者对来自于中国的74个结直肠癌患者和54个健康人的粪便样本进行宏基因组测序，发现除了已经证实的与结直肠癌相关的具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和消化链球菌（Peptostreptococcus stomatis）之外，微小微单胞菌（Parvimonas micra）和口臭致病菌（Solobacterium moorei）也与结直肠癌具有显著相关性。
作者随后选择了20个微生物基因标志物，通过q-PCR发现，来自于具核梭杆菌的丁酰coA脱氢酶和来自于微小微单胞菌的RNA聚合酶亚基β在患者的粪便微生物的基因组中高度表达；利用这两个基因可以准确区分患有结直肠癌的患者和健康人群。
宏基因组测序介绍
宏基因组测序介绍
宏基因组测序（Metagenomics Sequencing）又称为环境基因组测序，是一种对复杂环境中所有微生物生物群体的遗传信息进行分析的高通量测序技术。
与传统分离培养方式不同，宏基因组测序可以直接提取环境样品中所有微生物的总DNA，并通过测序技术进行分析，从而得到环境样品中所有微生物群体的遗传信息。
宏基因组测序的优点是高通量、快速、高效、无偏差、不需要微生物分离和培养，可以对满足各种环境条件的微生物进行整体性的研究，从而更加真实地反映生物在环境中的生态学特征，为生态学、环境保护等领域的研究提供了数据支持。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
病毒宏基因组测序
40
Eukaryotic DNA viruses
No. of samples
30
20
10
0
Unclass. ABneeAtallloptovhriarqiGtduoaaermeqviumrueCUasviMtrinrocucaorlssqvatuisarseud.vseCinriurocsvoivruiBrBsaiedbgaueoUvminruocGslvaMyiUsrrusoan.ssvcPtilrroaNueslvsyasion.ruGmosveaimBrvuoiirsncidaivapierairdvaoevirus
病毒宏基因组测序又称宏病毒组（Virome），是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支。宏
病毒组直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，能够快速准确的鉴定出环境中所有的病毒组成，在病毒发现、病毒溯源、微生物预警等研究方面具 测序策略与深度
分析内容
项目周期
病毒宏基因组测序
自然群体
DNA/cDNA总量≥3ug，浓度≥50ng/ul，无降解，无粘稠、无颜色异常，无RNA/蛋白质污染； 干冰寄送，使用无DNase管子存放，标记清晰。
（病毒富集、核酸提取和反转录、随机扩增可参考raw data
集数据库比对 基于reads的整合注释
多样本标准分析 丰度热图
主成分分析 聚类分析
显著性差异分析
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 针对炎症性肠病病毒基因组变化的研究[1]
本研究对剑桥、芝加哥、洛杉矶三个地区感染炎症性肠病（IBD）的人 群及其健康家属的粪便进行高通量测序，结果显示：在三组人群中有尾 目噬菌体和小噬菌体科物种相对丰度最高，并且两种病毒相对丰度呈负 相关趋势。比较剑桥地区IBD样本与对照，揭示了噬菌体丰度不成比例 主要与IBD有关，并初步验证肠病毒与IBD有关。
宏基因组测序讲解
或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组研究将使人们摆脱物种界限，揭示更高更复杂层次上的生命运动
在目前的基因结构功能认识和基因操作技术背景下，细菌宏基因组细菌多样性。如宏基因组
并根据具体环境样品的特点和建库目的采用了一些特殊的步骤和对策。一般
DNA 的提取、与载体连接和在宿主细胞建立中克隆[17]equence based screening)两种方法。
宏基因组学的研究步骤
一般包括从环境样品中提取基因组DNA，克隆DNA 到
蛋白等的试剂盒，在食品工业、NA构建
模式微生物并不能把所
DNA表达出来，降低了表型筛选的效率。宏基因组表型筛选的效率
从上万个克隆中一般只能筛选到几个有用的克隆。这表明宏基因组学的提
但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论
DNA提取方法的改进[68]。
(细胞提取法)。直接裂解法是将
继而抽提纯化，包括物理法(如冻融法、
)和化学法、酶法等。不同直接裂解法的
此法操作容易、成本低、DNA提取率高、
但由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小(1-50kb)，难以
DNA，如先采用密度梯度离心分离微生物细胞，
DNA。此法可获得大片段
4个步骤。特别要指出的是，在基
其研究目标通常是测定单一物种的基因组序列；而在宏基因
(community)的混合基因组序
这种差别的关键就பைடு நூலகம்，绝大多数细菌是不可培养的，因此没有足够的研究材
分离特定环境生物DNA
DNA的做法，而是首先直接收集能
然后利用各种理化方法破碎微生物，使
DNA，再利用密度梯度离心等方法进行分离纯化。
宏基因组二代测序报告、标本类型、送检保存要求、标本运输、内容解释及微生物致病概率分级
送检mNGS宏基因组二代测序报告情况、标本类型、送检保存要求、标本运输要求、测序情况、内容解释、微生物致病概率分级及解读宏基因组二代测序(mNGS) 是基于核酸检测的微生物鉴定技术其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用。
下呼吸道感染主要包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS 技术本身存在的局限性，mNGS 诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理解读。
需送检mNGS情况(1) 免疫抑制宿主疑似发生LRTI 且临床表现提示非CAP 常见病原微生物所致者；(2) LRTI 患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI 经规范经验性抗感染治疗48—72 h 后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者；(3) 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体(感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时；(4) 患者有LRTI 症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致，可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS 以帮助鉴别诊断。
不建议送检 mNGS情况(1) 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎)，经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转；(2) LRTI 已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效；(3) 无法获取优质标本。
mNGS 标本类型在LRTI 的病原微生物诊断中，可用于mNGS 检测的标本包括痰(含诱导痰)、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB）标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
微生物宏基因组测序
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 婴儿肠道微生物宏基因组[1]
肠道微生物对人体至关重要，本文采用宏基因组测序技术对98个瑞典产 妇的粪便及婴儿的粪便进行分析，研究出生一年内肠道的微生物，评估 分娩方式和喂养方式对肠道菌群建立的影响。与顺产婴儿的肠道微生物 相比，剖腹产婴儿肠道微生物与母亲相似性明显降低。营养对肠道微生 态的组成和功能有重要影响，促使婴儿肠道微生物向成人肠道微生物群 转变的主要驱动力量并不是开始喂食固体食物，而是停止母乳喂养。微 生物群落组成和生态网络在不同样本阶段具有明显差异，与微生物功能 成熟度相关。
Occurrence frequency（n＝15）
图1 不同生产方式及不同年龄阶段肠道菌群的差异
［案例二］ 全的主要推动力，但对它们的功能多样性、微 生物种群结构以及生态因素进行总体分析还存在很大的挑战。本研究采 集全球海洋68个位点的上层和中层海水的243个样本进行宏基因组分 析，得到7.2TB数据。对获得的数据进行分析，发现139个样本中含有 的微生物物种数目多于35,000个，而且在上层海水的垂直分层中，温度 是影响微生物种群分布的主要因素。分析海洋微生物核心功能，发现其 与人体肠道微生物的相似性高达73%。
[2] Sunagawa S, Coelho L P, Chaffron S, et al. Structure and function of the global ocean microbiome [J]. Science, 2015, 348(6237): 1261359.
参考文献
图2 Tara Oceans在全球海洋微生物中发现的新基因多样性
宏基因组测序及分析
研究思路
瘘管奶牛牛
将柳枝稷样品置于牛牛的瘤胃中培 养72小小时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微生生物进行行基因组 分析。
Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75
15
研究结果
总共识别了27,755 与碳水水化合水水物绑定模块或具有催化功能的候选基因
物种组成16s18sits10代谢通路分析物信息分析三基因功能分析11cog注释cazyme注释物信息分析三基因功能分析12物信息分析四个性化分析基于筛选因对样品进聚类分析13什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用14研究案例science
迪康金金诺NGS应用用交流会
宏基因组研究在肠道微生生物中的最新研究应用用
21
研究案例（三）
Gut：运动可能增加肠道菌群多样性 背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，而而肠道菌群多样性的增加 则有利于新陈代谢和免疫。
运动可能对肠道菌群的多样性产 生生有益影响。
Clarke, S.F., et al., Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity. Gut, 2014.
22
研究思路
平均身身体质量指数（BMI），用用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身身体质 量指数（BMI）是29.1
样本收集：
40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名 则属于高高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和血血液样本)
宏基因组测序原理
宏基因组测序原理
宏基因组测序是一种用于研究环境中微生物群落的高通量测序技术。
与传统的基因组测序不同，宏基因组测序可以同时对整个微生物群落中的所有微生物进行测序，从而揭示微生物群落的多样性和功能。
在宏基因组测序中，有几个关键的步骤和原理需要了解。
首先，样品的DNA提取是宏基因组测序的第一步。
在这一步中，需要将微生物群落中的DNA提取出来，并且要尽可能保持DNA的完整性和纯度。
这一步的成功与否直接影响着后续的测序结果。
接下来是DNA文库的构建。
在这一步中，需要将提取出的DNA进行裂解和连接，构建成文库。
文库构建的关键在于选择合适的连接适配体和裂解方法，以确保文库的质量和多样性。
然后是高通量测序。
在这一步中，构建好的DNA文库被送入测序仪进行高通量测序。
高通量测序技术可以同时对数百万个DNA片段进行测序，从而大大提高了测序的效率和覆盖度。
最后是数据分析和生物信息学处理。
通过生物信息学分析，可以将测序得到的海量数据进行拼接、比对、注释和功能预测，从而揭示微生物群落的多样性和功能特征。
总的来说，宏基因组测序的原理是通过高通量测序技术对微生物群落中的DNA进行测序，从而揭示微生物群落的多样性和功能。
这项技术的应用可以帮助我们更好地了解微生物在环境中的分布和作用，对于环境保护和微生物资源开发具有重要意义。
微生物检测之16S与宏基因组测序mNGS
宏基因组测序(Metagenomics Sequencing):
高通量测序 是对环境样品中全部微生物的总DNA(也称宏基因组Metagenomic)进行
，主要
研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。
基本实验原理:
将微生物基因组DNA随机打断成500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测 序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列。
物种分布图
物种丰度聚类热图
二、系统进化树
用QIIME软件挑选出属分类学水平上 丰度最高的OTU的序列作为代表序 列，进行多重序列比对并构建系统进 化树，然后通过Python语言工具绘 制图形。
三、Alpha多样性分析
Alpha多样性（Alpha diversity）反映的是单个样品物种丰度 （richness）及物种多样性（diversity），有多种衡量指标： Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指数衡量物 种丰度即物种数量的多少。Shannon和Simpson指数用于衡量 物种多样性，受样品群落中物种丰度和物种均匀度 （Community evenness）的影响。
一、物种注释及分类学分析
将OTU的代表序列与微生物参考数据库进行比对可得到每个OTU对应的物种分类信息，进而在各水平 （phylum，class，order，family，genus，species）统计各样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类 水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图。
使用QIIME软件进行 Beta 多样性(Beta diversity)分析，比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。 Beta多样性分析主要采用binary jaccard、bray curtis、weighted unifrac(限细菌)、 unweighted unifrac (限 细菌)等4种算法计算样品间的距离从而获得样本间的β值。 基于这4种距离矩阵展开的Beta多样性分析，主要有以下几点。 1）PCA与PCoA分析： 2）NMDS分析： 3）UPGMA分析： 4）组间物种差异热图：
宏基因组测序
宏基因组测序1宏基因组研究概况宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。
鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。
传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。
在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。
在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。
但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。
随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。
下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的RocheGS20 454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。
小鼠胰腺组织测序宏基因组
小鼠胰腺组织测序宏基因组
摘要：
一、背景介绍
二、实验方法
三、实验结果
四、结果分析
五、结论
正文：
一、背景介绍
近年来，随着生物信息学技术的不断发展，宏基因组学在研究生物系统中微生物群落结构及其功能方面取得了突破性进展。
本文以小鼠胰腺组织为研究对象，通过测序技术对宏基因组进行研究，旨在揭示胰腺组织中微生物群落的组成及其与宿主相互作用的机制。
二、实验方法
1.样本收集：从实验小鼠胰腺组织中提取微生物DNA。
2.宏基因组测序：采用Illumina HiSeq 平台进行微生物DNA 的测序。
3.数据分析：通过生物信息学方法对测序数据进行处理，包括序列拼接、质控、OTU 分析等。
4.功能注释：对差异丰度物种进行功能注释，揭示其在宿主生理功能中的作用。
三、实验结果
1.胰腺组织中检测到丰富的微生物多样性，包括细菌、古菌和真菌等。
2.实验组与对照组小鼠胰腺组织微生物群落结构存在显著差异，表明宿主生理状况对微生物群落有显著影响。
3.差异丰度物种的功能注释结果表明，微生物群落在胰腺组织的生理功能中发挥着重要作用，如能量代谢、免疫调控等。
四、结果分析
通过对小鼠胰腺组织宏基因组的测序和分析，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
这些发现为进一步研究宿主- 微生物相互作用及其在胰腺疾病中的作用提供了依据。
五、结论
本研究采用测序技术对小鼠胰腺组织宏基因组进行了研究，揭示了微生物群落在胰腺组织中的重要作用。
宏基因组 基因组覆盖度
宏基因组测序（mNGS）是一种在临床中用于诊断新发突发传染病以及常规检验阴性的感染性疾病的方法。
这种方法涉及到的基因组覆盖度是指测序过程中能够覆盖的基因组区域的比例。
在宏基因组测序中，测序产生的数据需要经过比对、筛选、过滤等生物信息学手段处理，以注释微生物物种。
在这个过程中，需要评估测序数据的覆盖度和基因组的覆盖度。
基因组覆盖度是衡量测序数据能够覆盖基因组区域的比例。
高的基因组覆盖度意味着测序数据能够覆盖基因组的更多区域，从而提供更全面的微生物物种信息。
而基因组覆盖度低则意味着还有许多基因组区域未能被测序或未能被充分测序，需要进一步优化测序方案或增加测序深度。
因此，在宏基因组测序中，基因组覆盖度是一个重要的评估指标，能够反映测序方案的优劣和测序数据的质量。
提高基因组覆盖度可以更好地揭示微生物物种的多样性，有助于更准确地诊断和治疗感染性疾病。
小鼠胰腺组织测序宏基因组
小鼠胰腺组织测序宏基因组引言胰腺是人体中一个重要的消化和内分泌腺器官，它在消化系统中起着至关重要的作用。
了解胰腺组织的基因组信息对于研究胰腺相关疾病以及开发相关治疗方法具有重要意义。
本文将探讨小鼠胰腺组织测序宏基因组的相关内容。
小鼠胰腺组织测序的意义1.研究胰腺发育：通过测序小鼠胰腺组织的宏基因组，可以了解胰腺发育的分子机制，进而揭示相关疾病的发生和发展过程。
2.研究胰腺疾病：通过比较正常胰腺组织与疾病胰腺组织的基因组差异，可以发现与胰腺疾病相关的基因，为疾病的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。
3.研究胰腺功能：通过测序小鼠胰腺组织的宏基因组，可以了解胰腺在代谢调控、内分泌功能等方面的作用，为相关研究提供基础数据。
测序方法小鼠胰腺组织的宏基因组测序可以采用多种方法，常见的有以下几种：1. 全基因组测序（WGS）全基因组测序是一种测序技术，可以对整个基因组进行测序。
通过WGS，可以获得胰腺组织中所有基因的信息，包括编码蛋白质的基因和非编码RNA的基因等。
这种方法可以全面了解胰腺组织的基因组特征。
2. 转录组测序（RNA-Seq）转录组测序是一种测序技术，可以测定胰腺组织中所有转录的RNA序列。
通过RNA-Seq，可以了解胰腺组织中的基因表达情况，包括哪些基因在胰腺中高表达，哪些基因在胰腺中低表达等。
这种方法可以揭示胰腺组织的功能和调控机制。
3. 甲基化测序甲基化测序是一种测序技术，可以测定胰腺组织中DNA的甲基化状态。
通过甲基化测序，可以了解胰腺组织中DNA甲基化的分布情况，揭示胰腺组织的表观遗传调控机制。
测序数据分析获得小鼠胰腺组织测序宏基因组数据后，需要进行数据分析以获取有意义的结果。
常见的数据分析方法有以下几种：1. 基因表达分析通过转录组测序数据，可以进行基因表达分析，包括差异表达基因的筛选和聚类分析等。
这些分析可以帮助我们了解胰腺组织中哪些基因在不同生理或病理状态下表达差异显著，从而揭示胰腺组织的功能和调控机制。
宏基因组测序简介(发布版)
普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。 耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。 流程标准化：缺少统一标准。 检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。 结果数据复杂。 污染：宿主核酸、污染物核酸。 耗时：测序流程耗时过长。
用分布。
10
最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
11
2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
核酸提取方法
没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。
测序方法
深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污 染。
• 中枢神经系统； • 呼吸系统； • 消化系统； • 骨骼肌系统； • 视觉系统； • 血液循环系统； • 肝胆系统； • 泌尿系统； • 皮肤； • 其他。
B. 临床宏基因组研究的增长情况： C. mNGS研究在不同国家的分布情况； D. mNGS使用的技术平台分布； E. mNGS在不同感染疾病诊断中的应
低（或无）致病性病原体（定植菌等）独立呈现。
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宏基因组测序是什么？
[13]Fields, S. (2001). Proteomics in Genomeland. Science, 291(5507), 1221–1224.
7
8
宏基因组学发展简史[1]
9
临床宏基因组学发展现状[1]
2019年前108篇临床mNGS研究现状： A. mNGS在疾病诊断中的应用：
宏基因组测序
宏基因组测序简介 宏基因组学发展 如何完成一次mNGS
难点与挑战
概要
2
3
“内因+外需”双轮驱动NGS需求
内因：感染性 疾病的新发和 再发对临床诊 断的准确性和 实效性提出更 高要求。
外需：“限抗 令”推动NGS在 该行业发展。
4
为什么进行宏基因组测序？
很多病原体培养困难。
用电镜观察病原体，其灵 敏性相对较低。
病人1（肾移植）：取脑组织、脑脊 液、血清、肾脏、肝脏样本测序；
病人2（肝移植）：取脑脊液和血清 样本测序（454）。
通过测序鉴定了一个新的沙粒病毒， 该病毒会通过实体器官移植传播。
14岁联合免疫缺陷症男孩； 休假回来后，脑膜炎发作； 6周内做了38项检测，均为阴性； 5种高档抗生素用药，均为康复； 脑脊液mNGS，48小时出结果（MiSeq）； 检测到475/10196620条reads，钩端螺旋体； 上青霉素，32天后康复出院。
核酸提取方法
没有充分破壁可能会使一些细菌的检测变得困难（DNA没有充分释放）。样本量小会降不包括片段化的病原体基因组；仅靠DNA测序不能检测到RNA病毒。
测序方法
深度不足难以检测低丰度物种。同一测序过程中的样本之间可能会发生污染。与单端barcode相比，双端barcode可降低污 染。
病原核酸富集： Dnase I，2-~650倍[24]； RNA探针+Rnase H，2~724倍[25]； 抗体或CRISPER捕获，验室背景。
19
测序数据分析——生信的重要性
数据库！ 20
测序数据分析——数据量要求
样本类型 建议测序数据量
2016年，FDA发布NGS用于感染疾病监测指南：微 生物鉴定、抗菌药物耐药性、独立标志物[20]
2018年4月，高通量测序技术写入中国成人医院获得性 肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南[21]
201检测流程
样本采集
样本处理
NGS测序
数据分析
报告解读
质控！ 《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》
16
样本采集与运输
选择直接的感染部位标本，尽量抗生素使用前，病症明显时进行无菌采集。
• 脑脊液/BAL：选择第2管进行NGS检测； • 痰液：生理盐水漱口2-3次以上，咳取深部痰液；气管插管或切开时，吸取深部痰； • 组织样本：采样后直接放入无菌管冻存； • 血标本：尽量在患者寒战开始时，发热高峰前30-60min取样。
应用场景有限：成本高，目前mNGS主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳 入常规临床检测。
普及程度较低：认知和接受程度不足，检测结果的科学判读证据与逻辑尚待证实。 耐药和突变的鉴定：病原序列在总测序序列中含量极低，难以进行基因水平的鉴定。 流程标准化：缺少统一标准。 检测准确性：报告中含多种病原信息，夹杂背景病原，需更准确的病原鉴定算法和更快的鉴定速度。 结果数据复杂。 污染：宿主核酸、污染物核酸。 耗时：测序流程耗时过长。
数据量/M
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报告解读[23]
原则：
• 剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息； • 剔除比对流程中交叉引入的假阳性病原体信息； • 报告病原体信息原则上准确到种，），同时也应包
含相应的属信息； • 建议将临床高度关注和健康者样本中极少出现的病
原体信息优先呈现； • 时将某些部位（如呼吸道、皮肤、肠道等）的常见、
低温运输
17
样本处理
样本类型
血浆
脑脊液 肺泡灌洗液 全血 痰液
胸腹水 组织
人源背景细胞中位数 ~2.3×105 ~3×104 ~1×105
~7×106 ~1.5×107 ~5×107 ~107~108
样本要求量
1ml以上 5ml以上
5ml/3ml 1ml以上 1ml以上 100mg以上
检出限
• 细菌检出限：10~1000copies/ml； • 真菌检出限：10~1000copies/ml； • 病毒检出限：1000copies/ml； • 支原体/衣原体检出限：100~1000copies/ml； • 寄生虫检出限：10~100copies/ml
处理对照
阴性对照可以识别一些受污染的物种。内部阳性对照可减少实验变异性带来的偏差，提高对低水平物种的识别。
分析方法
小型精选数据库或高度严格的标准可能不包括新的或意想不到的物种，从而导致假阴性结果。未经整理的数据库或宽松的 标准也可能不正确的识别物种。
25
临床宏基因组应用的局限和挑战[23,31]
质谱(MALDITOF MS)[2,4]
mNGS[7-9]
优势
• 通量大； • 检测急性或以前的感染； • 低成本
• 快速； • 高灵敏度； • 准确。
• 中通量
• 金标准 • 低成本
• 高通量； • 高特异性； • 低人工成本； • 省时。
• 高通量； • 不依赖培养； • 无偏倚检测； • 可发现新病原体； • 抗生素/抗病毒预测； • 功能预测分析。
几秒到几 分钟（培 养后）
极个别顶尖三甲
1~2天 （Nanopor e可将时间 缩短至几 小时）
几乎未开展
6
定义：
宏基因组测序（MetaGenomics Next Generation Sequencing，mNGS），最早由威斯康辛大学植物 病理学部门的Jo Handelsman等于1998年提出，后被 伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter等 定义为“应用现代基因组学的技术直接研究自然状 态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分 离单一的菌株”[12]。
武汉金银潭医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。 Illumina和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。 20,000个病毒测序片段。 与beta冠状病毒属B分支的基因组相匹配。 与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，G772933.1）
的全基因组一致性超过85％。
13
mNGS走向临床——共识与指南[20-23]
优势：
1、无偏倚，如一个标本中既有曲霉菌又有白色念 球菌，培养时，如果白色念球菌生长较快，便会影 响曲霉菌的生长，所以培养是有偏倚的，但理论上， 宏基因组测序对病原学诊断是没有偏倚的。 2、广覆盖，可以同时检测多种病原（如细菌、真 菌、病毒、寄生虫、支原体/衣原体、分枝杆菌等）。 3、无需先证知识，mNGS可以无需提前知道该样本 中的感染病原。
3/100万； 1000/100万（与宿 主高相似度）
细菌
1/100万 （胞内感 染菌）
真菌 5/100万
寄生虫 10/100万
报告中需注意取样和样本处理过程中引入的污染。
罕见病原
结合临床 进一步确 认
22
宏基因组测序所需的设备
仪器设备 生物安全柜 移液器 超纯水仪（18.2兆欧） 紫外灯 冰箱 离心机和涡旋仪 天平/电子秤 金属浴/水浴锅 磁力架 超声打断仪 Qubit核酸定量仪 qPCR仪（定量） 凝胶电泳及成像系统 真空浓缩仪（如不需探针法富集病原核酸，则不需配置） PCR仪 测序仪（如果进行mNGS，建议配置NextSeq通量的测序仪，其他病原应用，可 配置MiSeq通量级别的测序仪。） 不间断电源（UPS） 片段分析仪（agilent、Qseq、PE labchip三个品牌选其一） 服务器（分析量较大时需单独配置机房，配置大型服务器）
试剂准备区 √ √ √ √ √ √ √
标本准备区 √ √
√√ √ √ √
√
测序区 √ √ √
√ √ √
23
24
正视mNGS在感染性疾病诊断中的偏好性[30]
样本收集方法
没有冷链或核酸稳定剂的样本收集可能会导致核酸降解和假阴性结果或一些生物体的过度生长，导致对丰度的误解。多次 冻融也会导致核酸降解。
75% 12
2019年12月26日——坊间发现
mNGS发现几十条SARS冠状病毒序列，且仅有 这一个有意义的病原体；
进一步分析，与Bat SARS like coronavirus有87% 相似，与SARS有81%相似。
补测数据，得到几乎完整基因组。
新冠病毒的发现
2019年12月30日——官方发现[19]
劣势
• 低灵敏性和特异性； • 对于细菌，相近的抗原易发生交叉反应。
• 检测特定感染； • 成本高于培养的方法； • 受扩增偏差影响； • 无法区分活细胞/死细胞。
• 结果稳定性、平行性差
• 准确率、可靠性依赖于技术经验； • 耗时耗力； • 敏感性会受到抗感染药物影响； • 难培养的病原不能鉴定。
用分布。
10
最早的宏基因组应用——环境宏基因组[14-15]
11
2008年——死后查因[16]
临床宏基因组应用先锋
2014年——首例临床，免死诊断[17]
2019年——病前预测[18]
3个病人在同一天接受同一个捐献者 的器官移植。在移植后4~6周均出现 发热后去世。
培养、PCR、血清学筛查、芯片检测 均为发现有用信息。
• 中枢神经系统； • 呼吸系统； • 消化系统； • 骨骼肌系统； • 视觉系统； • 血液循环系统； • 肝胆系统； • 泌尿系统； • 皮肤； • 其他。
B. 临床宏基因组研究的增长情况： C. mNGS研究在不同国家的分布情况； D. mNGS使用的技术平台分布； E. mNGS在不同感染疾病诊断中的应