第七章超高效液相色谱法

• 3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这 是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器 （使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限 制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒 大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗 粒是0.67 μm
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• 为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果， 需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力 范围。在能达到最大效率的最佳流速下， 对于10 cm长装有1.7 μm颗粒的色谱柱，计 算得出的压力降是15,000 psi。因此，需要 一个能在该压力下传送溶剂的泵。
高柱效。
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• 2.灵敏度
• 我们知道UPLC色谱柱中使用的是1.7μm固定相，分离获 得的色谱峰半蜂宽小于1s，这就对检测器的要求是极高的 。AQUITY UPLC使用采样速度达40点/s，池体积仅为 500nL（约为HPLC池体积的1/20）的新型光导纤维传导 得流通池，当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四 氟乙烯池壁的全析射特征，不损失光能最，而使检测灵敏 度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可变波长的紫外光或 二极管阵列系统。
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• UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充 床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色 谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加 快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内 表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重 新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒 又能避免堵塞。
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• 在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得 显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。 UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵 抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下 使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消 溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动， 以实现平稳而可重现的流体输送。
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• 普通进样阀，不论是手动的还是自动的， 都不具有极端压力下的耐用功能。进样的 可重现性和线性的典型性能标准是分析应 用所需要的
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• 为保护色谱柱免受极端压力波动的影响， 进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的 系统体积要小，以减小所检测样品可能的 区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以 最大速度、较大的样品通量进行工作
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• 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系 统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给 UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须 具有较高的采样速率，以在检测峰通过时 捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测 峰进行准确而可重现的识别（和积分）
• 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议 用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。 目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类 颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表 面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与 HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须 使用多孔型颗粒。
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• 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明 显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快 了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对 于任何给定的分离，都可通过调节这些变 量而达到速度和分辨率的最佳组合
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该头发的直径约等于12个5 μm的--精颗品粒--，33个1.7 μm的颗粒。
超高效液相色谱法（UPLC）
色谱实验室的新高度
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• Jorgensen博士和杨百翰大学的M. Lee博士 最近都发表了关于色谱实验室未来分析范 围的深刻见解。他们的研究为分离科学描 绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多 颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。
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• 范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高 度（柱效）关系的经验式。从图1可以看出， 一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术 就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而 且随着流速的提高不会使柱效降低。
在进行高峰容量的色谱分析时， 降低分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度
--精Biblioteka Baidu--
• 除了化学、泵、进样器和检测器之外，还
需要对系统进行考虑。系统的体积至关重
要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分
离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大
大低于目前的HPLC系统.如：考虑连接管和
接头配件
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• 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分 离效率不降低。检测器的光学部件也必须 具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。 从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC 检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3 倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于 UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪 的灵敏度至少提高3--倍精品--
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• 如果使用UPLCTM技术和2 μm以下的颗粒， 那么即使在较高的线速度下，效率也能得 以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使 用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏 度，从而使现在有可能充分利用色谱原理 进行分离。
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• 峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能 分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能 指标得到提高后的色谱法被称为超高效液 相色谱法，或UPLC。图2说明了当颗粒大 小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量 对色谱分离性能的影响。
UPLC技术能实现提高液 相色谱速度、分辨率 和灵敏度的承诺，为 每次分析提供更多的 信息；因此，该技术 将会得到实验室的广 泛认可。
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超高效液相色谱法（UPLC）相对于高效液相 色谱法（HPLC）的优势所在：
• 1.速度
• 超高效液相色谱法（UPLC）采用新型全多孔球 形1.7μm反相固定相，该固定相是应用“杂化颗 粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合 成的，并由此制备了高柱效的ACQUITY UPLC色 谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时 间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟， 并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超