第七章超高效液相色谱法
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
超高效液相色谱原理
超高效液相色谱原理
超高效液相色谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC）是一种高效的液相色谱分析技术。
超高效液相色谱的原理是利用特殊的色谱柱和高压泵进行分离，使得液相流动速度更快，分离效率更高。
具体原理如下：
1. 色谱柱选择：UHPLC常用的色谱柱粒径一般为1.8-
2.6 μm，相比传统液相色谱的
3.5-5 μm，更小的粒径可以提高色谱分离效率。
2. 高压泵：UHPLC使用高压泵提供高压力驱动液相流动，一
般工作压力可达到6000 psi或更高。
高压使得液相在色谱柱中
流动更快，加快分离过程。
3. 短柱长：UHPLC一般采用较短的色谱柱（通常为1-5 cm），与传统液相色谱相比，短柱可以减少柱内扩散，使得分离效率更高。
4. 快速检测器：UHPLC通常配备高灵敏度的快速检测器，如
紫外-可见光检测器（UV-VIS），质谱检测器等。
快速检测器
可以实时监测样品的测定信号，加快分析速度。
总的来说，UHPLC通过使用特殊的色谱柱、高压泵和快速检
测器等设备，提高了液相流动速度和分离效果，从而实现超高效的液相色谱分析。
第七章 色谱分离技术
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱使用方法⒈简介⑴色谱技术概述高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于物质在固定相和流动相之间分配行为的色谱分离技术。
它广泛应用于药物分析、食品检测、环境监测等领域。
⑵仪器设备在进行高效液相色谱分析之前，需要准备好以下仪器设备：●高效液相色谱仪●进样器●色谱柱●柱温箱●检测器●数据处理系统⒉样品制备在进行高效液相色谱分析之前，必须进行样品制备。
样品制备的方法根据具体领域和分析目的的不同而有所差异。
常见的样品制备方法包括：●样品浸提：通过浸提操作从固体样品中提取分析物质，并将其溶解到适当的溶剂中。
●样品过滤：将样品中的不溶物或杂质去除，使样品更纯净。
●样品稀释：根据样品的浓度情况，选择合适的溶剂将样品稀释到适当的浓度范围内。
⒊方法优化在进行高效液相色谱分析之前，应对方法进行优化，以获得更准确、灵敏的分析结果。
方法优化的主要步骤包括：●流动相优化：选择合适的流动相组成，使分析物质在色谱柱中得到良好的分离。
●色谱柱优化：选择合适的色谱柱，以满足分析要求，如色谱柱的选择应考虑分析物质的特性和目标分离效果。
●进样量优化：确定适当的进样量，以保证在检测器中能够获得合适的信号。
⒋实验操作步骤⑴仪器准备●打开高效液相色谱仪和相关仪器设备的电源。
●检查仪器连接情况，确保各仪器之间的连接正常。
●准备好所需的溶剂和试剂，并验证其质量。
⑵色谱条件设置●设置流动相的组成和流速。
●选择适当的柱温。
●配置适当的检测器参数，如波长、灵敏度等。
⑶样品进样●将样品溶液注入到进样器中。
●设置进样器的参数，如进样量、进样模式等。
●冲洗进样器，使其准备好下一次进样。
⑷数据采集与处理●打开数据处理系统，并设置合适的参数，如采集时间、信号积分方式等。
●开始进行数据采集。
⒌结果解释与分析根据采集到的数据，进行结果解释和分析。
根据对样品的分析目的，对结果进行合理解释，并得出相应的结论。
第七章--药物含量测定-幻灯片
×100%
供试品重量（g）×(1-水分或干燥失重百分数)
制剂含量=
实测的供试品量 供试品的标示量
×100%
标 示 量
含量测定的基本规则
1、所用器具均应校正后使用；所用试液均应按药典规定配 制；
2、称取或量取药品的量应符合规定要求； 3、称量挥发性或吸湿性的物质，必须用密封性好的容器进
行称量操作 4、测定必须排除干扰（专属性）； 5、结果起码要平行测定两次，合格，其结果应在允许的相
例：丙酸倍氯米松的百分含量
M样=12.60mg A样=4487 C内标=0.1223mg/ml A内标’=2042
M对=12.50mg A对=4346 C内标=0.1223mg/ml A内标=2027
97.0-103.0%
取样量：0.3003g; 滴定液浓度:0.1005mol/L；
99.1%
用量：9.33ml;
空白试验用量：0.10ml；T：32.09mg/ml
滴定法测含量
❖ 1，直接滴定（水杨酸的含量测定） ❖ 2，需做空白的直接滴定（盐酸异丙嗪的含量测定） ❖ 3，片剂的含量滴定（布洛芬片的含量测定） ❖ 4，注射剂的含量滴定（安乃近注射液的含量测定） ❖ 5，剩余滴定法（氯贝丁酯的含量测定）
引入——阿司匹林的[含量测定]项
标准用的什么方法？ 如何计算
内容
1
概述
2
容量分析法
3 紫外可见分光光度法
4 高效液相色谱法
概述
解决以下四个问题？
1、含量测定的重要性？ 2、常用的含量测定方法？ 3、含量的表示方法？ 4、含量测定的基本规则？
概述——含量表示方法
中药
含量计算公式
实测的供试品量（g) 原料药含量=
高效液相色谱使用方法
高效液相色谱使用方法高效液相色谱（HPLC）是一种分离和检测化合物的重要技术，广泛应用于化学、生物、药学等领域。
它的高效性和精密度使其成为许多实验室中不可或缺的工具。
下面将介绍高效液相色谱的使用方法，希望能为您的实验工作提供帮助。
首先，准备好实验所需的仪器和试剂。
检查色谱柱、流动相、样品溶液等是否符合要求，确保实验的顺利进行。
接下来，进行仪器的预处理和平衡。
打开色谱仪，设置好检测波长和流速等参数，进行系统的平衡和稳定。
然后，进行样品的处理和制备。
将待测样品溶解于适当的溶剂中，过滤去除杂质，使其达到适合进样的状态。
注意样品处理的过程中要保持样品的纯度和稳定性，避免对实验结果产生影响。
接着，进行进样和分离。
将处理好的样品通过自动进样器引入色谱柱中，流动相将样品分离并通过检测器进行检测。
在此过程中，需要注意流速、温度、压力等参数的控制，以保证色谱分离的准确性和重复性。
最后，进行数据的处理和分析。
根据检测器输出的信号，得到样品的色谱图谱，通过峰面积、保留时间等参数进行定量和定性分析。
同时，对实验结果进行统计学处理，评估实验的准确性和可靠性。
在实验操作的过程中，需要注意以下几点，一是要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可重复性；二是要及时记录实验过程中的关键步骤和参数，以备后续分析和总结；三是要及时清洗和维护色谱仪器，延长仪器的使用寿命和保证实验结果的准确性。
总之，高效液相色谱是一种重要的分析技术，掌握其使用方法对于化学、生物、药学等领域的科研工作者来说至关重要。
希望以上介绍的使用方法能够为您的实验工作提供一些帮助，祝您实验顺利取得理想的结果！。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
《液相色谱法》PPT课件
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
007高效液相色谱法操作规程
目的：确保药品质量符合规定范围：所有本公司购进和生产的需进行该项检验的原辅料及成品责任人：QC人员内容：1. 简述高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其方法是将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于运用了各种特性微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分离速度快的特点。
高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分离测定，特别是多组分药品的测定，杂质检查和大分子物质的测定。
2. 仪器高效液相色谱仪3. 操作方法3.1 流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂的检查，应符合要求；水为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45μm 适宜的滤膜滤过，用前脱气。
应配制足量的流动相及时待用。
3.2 供试液的配制供试品用规定溶剂配制成供试溶液。
定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。
供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm 适宜的滤膜滤过。
必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。
3.3 检查上次使用记录和仪器状态检查色谱柱是否适用于本次实验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互容。
流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。
3.4 泵的操作3.4.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。
3.4.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速进行冲泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止冲洗，关闭排放阀。
3.4.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
超高效液相色谱(UPLC)课件
从10到90%甲醇的1分钟梯度1000次进样 温度：55ºC 最大压力：8500psi 流速：1.3ml/min.
AU
0.35
0.30
ACQUITY UPLC™ C18 色谱柱
2.1×30mm 1.7µm
0.25
0.20
黑色：第一次进样
0.15
红色：第1000次进样
0.10
0.05
0.00
0.00
0.25
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超高效液相色谱
目录
1
绪论
2
理论基础
3
仪器介绍
4
应用和展望
1.绪论
超高效液相色谱的发展
站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的 需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很 短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析 中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在 与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。
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因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术 角度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重 新认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出， 将HPLC的极限作为自己的起点。
超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠以 下几个方面的进步：
（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现； （2）超高压输液泵的使用； （3）高速采样速度的灵敏检测器； （4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器， 配备了针内进样探头和压力辅助进样技术； （5）仪器整体系统优化设计：色谱工作站配 备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与 高效液相分析方法的自动转换。
第7章高效液相色谱分析法
第7章高效液相色谱分析法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
它的分离原理是利用样品中不同组分在固定填料（站相）上的分配行为，通过流动相（流动相）的推动，使不同组分在填料上快速分离。
HPLC由于其灵敏度高、分析速度快、分辨率高等优点，广泛应用于药物分析、环境监测等领域。
高效液相色谱分析法的基本步骤包括：样品制备、进样、色谱分离、检测和数据处理。
样品制备是将需要分析的样品处理成可溶解于溶剂体系中的形式，通常需要提取、过滤等步骤。
进样是将样品注入色谱柱中，常用的进样方式有定量进样和体积进样。
色谱分离是指样品组分在填料中的分离过程，选择合适的填料和流动相可以实现对目标物的有效分离。
检测是通过检测器对样品在色谱柱中的分离情况进行监测，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器等。
数据处理是将得到的检测结果进行定量分析和报告生成。
高效液相色谱分析法具有如下特点：1.分离效率高：由于HPLC使用的填料颗粒细小，色谱柱长度较长，使得分离能力显著提高，可以同时分离多个组分。
2.灵敏度高：HPLC配备了多种灵敏度高的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等，可以对很低浓度的组分进行检测。
3.分析速度快：HPLC的柱径较小，填料颗粒细小，流动相的流速较大，使分离速度更快。
可以在短时间内完成大量分析。
4.具有选择性：可以根据目标物的化学性质选择不同的填料和流动相，从而实现对不同化合物的选择性分离。
5.自动化程度高：HPLC仪器配有自动控制系统和数据采集系统，可以实现样品进样、数据处理等自动化操作，提高了实验效率和准确性。
高效液相色谱分析法在实际应用中具有广泛的应用。
比如在药物分析方面，HPLC可以用于药物质量控制、药物代谢动力学研究等。
在环境监测方面，HPLC可以用于有机污染物的检测和分析。
在食品安全方面，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂等。
超高效液相色谱法共51页PPT
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
超高效液相色谱法共51页
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
超高效液相色谱法
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
•Байду номын сангаас
29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
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高柱效。
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• 2.灵敏度
• 我们知道UPLC色谱柱中使用的是1.7μm固定相，分离获 得的色谱峰半蜂宽小于1s，这就对检测器的要求是极高的 。AQUITY UPLC使用采样速度达40点/s，池体积仅为 500nL（约为HPLC池体积的1/20）的新型光导纤维传导 得流通池，当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四 氟乙烯池壁的全析射特征，不损失光能最，而使检测灵敏 度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可变波长的紫外光或 二极管阵列系统。
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• 为保护色谱柱免受极端压力波动的影响， 进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的 系统体积要小，以减小所检测样品可能的 区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以 最大速度、较大的样品通量进行工作
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• 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系 统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给 UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须 具有较高的采样速率，以在检测峰通过时 捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测 峰进行准确而可重现的识别（和积分）
在进行高峰容量的色谱分析时， 降低分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度
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• 除了化学、泵、进样器和检测器之外，还
需要对系统进行考虑。系统的体积至关重
要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分
离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大
大低于目前的HPLC系统.如：考虑连接管和
接头配件Βιβλιοθήκη --精品----精品--
• 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分 离效率不降低。检测器的光学部件也必须 具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。 从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC 检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3 倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于 UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪 的灵敏度至少提高3--倍精品--
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• 在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得 显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。 UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵 抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下 使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消 溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动， 以实现平稳而可重现的流体输送。
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• 普通进样阀，不论是手动的还是自动的， 都不具有极端压力下的耐用功能。进样的 可重现性和线性的典型性能标准是分析应 用所需要的
超高效液相色谱法（UPLC）
色谱实验室的新高度
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• Jorgensen博士和杨百翰大学的M. Lee博士 最近都发表了关于色谱实验室未来分析范 围的深刻见解。他们的研究为分离科学描 绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多 颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。
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• 范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高 度（柱效）关系的经验式。从图1可以看出， 一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术 就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而 且随着流速的提高不会使柱效降低。
• 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议 用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。 目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类 颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表 面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与 HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须 使用多孔型颗粒。
UPLC技术能实现提高液 相色谱速度、分辨率 和灵敏度的承诺，为 每次分析提供更多的 信息；因此，该技术 将会得到实验室的广 泛认可。
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超高效液相色谱法（UPLC）相对于高效液相 色谱法（HPLC）的优势所在：
• 1.速度
• 超高效液相色谱法（UPLC）采用新型全多孔球 形1.7μm反相固定相，该固定相是应用“杂化颗 粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合 成的，并由此制备了高柱效的ACQUITY UPLC色 谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时 间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟， 并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超
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• UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充 床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色 谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加 快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内 表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重 新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒 又能避免堵塞。
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• 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明 显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快 了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对 于任何给定的分离，都可通过调节这些变 量而达到速度和分辨率的最佳组合
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该头发的直径约等于12个5 μm的--精颗品粒--，33个1.7 μm的颗粒。
• 3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这 是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器 （使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限 制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒 大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗 粒是0.67 μm
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• 为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果， 需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力 范围。在能达到最大效率的最佳流速下， 对于10 cm长装有1.7 μm颗粒的色谱柱，计 算得出的压力降是15,000 psi。因此，需要 一个能在该压力下传送溶剂的泵。
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• 如果使用UPLCTM技术和2 μm以下的颗粒， 那么即使在较高的线速度下，效率也能得 以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使 用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏 度，从而使现在有可能充分利用色谱原理 进行分离。
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• 峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能 分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能 指标得到提高后的色谱法被称为超高效液 相色谱法，或UPLC。图2说明了当颗粒大 小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量 对色谱分离性能的影响。