一种产甲烷优势菌群的筛选方法_张云茹
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Abstract： Objective： An easily new method was presented to select preponderant mixed methanogenic bacteria which could produce methane efficiently and be coutrled in defined medium． Method： Anaerobic activated sludge rich in methanogenic bacteria was domesticated in anaerobic medium with sodium acetate as its sole carbon source． During the domestication the ratio of the medium and the bacilli was gradually increased enable the microorganism to adapt to the artificial culture conditions． Result： 4 preponderant methanogenic bacteria were obtained by the way and named methanogenic bacteria（ MB） 1，MB2，MB3，MB5． The methane yield of 4 dominant microorganisms reached 46mL，38mL，51mL，38mL separately after culturing 7 days in artificial medium． and could increase continuously and steady． Conclusion： The new method of selecting methanogenic bacteria was verified to be feasible and easy and provide some reference material for biogas － research worker． Key words： methanogenic bacteria； screen； domestication； sodium acetate； dominant microorganisms
中图分类号： Q89； Q93 － 33 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 02． 051
A Method of Screeing Preponderant Methanogenic Bacteria
ZHANG百度文库Yun － ru1 ，LIU Yi － xuan1 ，SHEN Qing － tao1 ，WANG Yong － zhong2
用 1． 2． 3 的方法对 3 号、4 号、5 号样品进行驯化。
2 结果与分析
2． 1 第一轮驯化结果 图 1 为 1 号和 2 号污泥样品第一轮富集驯化过程中沼气
甲烷含量随时间的变化。从图中可以看出 1 号污泥样品在发 酵的 1 ～ 6d 内甲烷产量呈逐渐上升的趋势，第 6d 后由于体系 进入少量氧气，甲烷产量下降。在相同的发酵时间内 2 号污 泥样品产生的气体中甲烷含量则一直呈上升趋势。
由图 4 可知，3 号和 5 号样品产甲烷较多且产量逐步上 升，最高分到 45 mL 和 36 mL，4 号样品产量很少，且呈产量逐 步降低的趋势。 2． 4． 2 第二轮驯化结果
在第一轮驯化的基础上，更换新鲜培养基对 3、4、5 号样 品进行第二轮驯化，第二轮驯化液为 40mL 培养基和 10mL 驯 化后菌液的混合液。
沼气中气体浓度用气相色谱仪检测，主要技术参数为： 色 谱柱填料为苯乙烯高分子多孔小球，柱长 2m，载气为 N2 ，流速 为 25mL / min，TCD 检测器，电流为 80mA，柱箱温度为 50℃ ，汽 化室 80℃ ，检测室温度分别为 120℃ ，柱前压力 0． 13Mpa，进样 量为 0． 5mL。 1． 2． 2 培养基的除氧
0 引言
沼气发酵是一个 微 生 物 协 同 作 用 的 过 程，由 多 种 产 甲 烷 细菌与非产甲 烷 细 菌 相 互 作 用、相 互 制 约 共 同 完 成。 产 甲 烷 菌是沼气发酵微生态系统中食物链末端的一群成员。在厌氧 条件下，产甲烷细 菌 利 用 非 产 甲 烷 细 菌 的 中 间 产 物 和 最 终 代 谢产物作为营养 物 质 和 能 源 而 生 长 繁 殖，最 终 产 生 大 量 甲 烷 和二氧化碳等［1］。
本文报道了一种 产 甲 烷 优 势 菌 群 的 筛 选 方 法 ，用 该 方 法
收稿日期： 2010 － 12 － 16； 修回日期： 2011 － 02 － 24 资助项目： 重庆市科技攻关项目（ “具有高效破壳与集气性能的内循环 自热式沼气反应器”，2009AC6056） 资助 作者简介： 张云茹（ 1977 － ） ，女，硕士，讲师，从事农业固体废物的处理 研究。
从图 5 可以看出，3 号和 5 号样品产甲烷量直线上升，在 培养至第 7d 甲烷产量分别为 52mL 和 38mL，4 号样品甲烷产
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量很小，随时间变化不大。 经过这两轮驯化，3 号和 5 号样品中的菌群能在人工培养
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将灭菌培养基 20mL 加入到 100mL 的无菌三角瓶中，用可 调电炉加热至沸腾后通入氮气 3 ～ 5min 以去除培养基中的溶 解氧，（ 以培养基中刃天青的颜色变化判断，无氧时刃天青无 色） ，之后按 2% （ V / V） 的比例迅速加入称量好的固体 Na2 S， 用 4 层透明胶带密封瓶口。 1． 2． 3 产甲烷菌群的驯化筛选
由于 2 号样品产甲烷量稳定，1 号样品产甲烷量降低，这 时更换新鲜培养基进入第二轮驯化。 2． 2 第二轮的驯化结果
在第二轮的驯化中，1 号和 2 号两个样品的 CH4 产量相比
图 3 第三轮驯化产甲烷量变化 Fig． 3 Variation of methane yield in the Cycle 3 domestication
第一轮的驯化，产甲烷高峰出现得更快，而且持续时间也相对 较长； 1 号样品在前 5d 中的 CH4 产量明显比 2 号样品要高，到 第 5d 1 号和 2 号样品甲烷产量分别达到 63 mL 和 54mL，均超 过系统气体总量的 50% 。但是 2 号样品 CH4 产量相对 1 号样 品持续稳定。结果表明驯化过程增强了菌种产甲烷的能力。
图 2 第二轮驯化甲烷产量变化 Fig． 2 Variation of methane yield in the Cycle 2 domestication
2． 3 第三轮的驯化结果
图 1 第一轮驯化甲烷产量变化 Fig． 1 Variation of methane yield in the Cycle 1 domestication
第三轮驯化过程中，1 号和 2 号样品菌群迅速适应环境， 环境中更早呈现无氧环境，利于产甲烷菌群的生长，CH4 产量 持续增高。结果表明： 经过三轮驯化，1 号和 2 号样品可以完 全在人工培养基中生长，产甲烷量持续稳定，驯化获得成功。 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
采用 2． 3 所述的方法，对 3、4、5 号污泥样品进行驯化。驯 化液包括培养基 20mL，污泥样品 20mL。 2． 4． 1 第一轮驯化结果
（ 1． School of Pharmacy ＆ Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054； 2． Institute of Engineering Thermophysics； Chongqing University，Chongqing 400030，China）
乙酸钠培养基含 微 量 元 素、维 生 素 混 合 液 基 详 见 参 考 文 献［20］，所加维生 素 液 中 盐 酸 吡 哆 醇 用 盐 酸 硫 胺 代 替，维 生 素 B12 用片剂，浓度不变。 1． 1． 3 仪器
SD － 3000B 气相色谱仪； SKP － 02B 恒温培养箱； XFS － 280 高压灭菌锅。 1． 2 方法 1． 2． 1 气体分析检测方法
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一种产甲烷优势菌群的筛选方法
张云茹1 ，刘逸轩1 ，沈庆涛1 ，王永忠2
（ 1． 重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054； 2． 重庆大学工程热物理研究所，重庆 400030） 摘要： 目的： 用简便易行的产甲烷优势菌群的筛选方法，筛选出能够人工培养的且高效产甲烷的复合微生物。方法： 用乙酸 钠除氧培养基驯化富含产甲烷菌的厌氧活性污泥，逐渐增加驯化体系中培养基和菌液的比率，使驯化体系中微生物菌群适应人 工培养条件。结果： 筛选出 4 个产甲烷优势菌群。筛选出的 1 号、2 号、3 号、5 号菌群在培养 7d 后均产甲烷量分别达到 46mL、 38mL、51mL、38mL，在短时间内 4 个菌群产甲烷量能持续稳定上升。结论： 验证表明建立的方法筛选高效产甲烷菌群简便易行， 为沼气工作者提供了一定的参考。 关键词： 产甲烷菌； 筛选； 驯化； 乙酸钠； 优势菌群
比较发现在相同的发酵时间内 2 号污泥样品的甲烷产量 较 1 号的高很多，2 号样品驯化体系中氧气含量比 1 号低。在 驯化前 6d 2 个样品中氧气含量逐渐下降，2 号样品中几乎检 测不到氧气谱峰。第 8d 检测时 1 号污泥样品中氧气含量上 升，产甲烷量迅速降低，表明体系中即使少量的氧气进入对产 甲烷菌的代谢活动用明显的影响。因此在驯化和测样过程中 要将整个体系密封好，严格控制氧气。
筛选到 4 个产能持续稳定产甲烷的优势菌群，为产甲烷菌群 的人工培养提供了一定的参考。
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 实验材料
1 号污泥样品取自重庆啤酒厂厌氧消化池，2 号污泥样品 取自重庆污水处理厂，3 号、4 号污泥取自重庆光大集团不同 污水处理池，5 号污泥样品取自重庆理工大学家属区化粪池。 1． 1． 2 培养基
在除氧培养基中用注射器注入 1 号、2 号污泥样品 20mL 密封，于恒温培养箱中 37℃ 静止培养，开始第一轮驯化。定时 检测产甲烷量的变化。每轮驯化每个样品均设 3 个重复。
当样品产甲烷量 持 续 上 升 或 急 剧 下 降 时，用 注 射 器 从 第 一轮的驯化液中吸取 15mL 注入 25mL 除氧乙酸钠培养基，同 条件进行第二轮驯化。
按同样的方法，第三轮驯化在三角瓶中注入 40mL 无菌培 养基和 10mL 经第二轮驯化的培养液。逐渐加大驯化液中培 养基和培养液的 比 率，直 至 用 人 工 培 养 基 对 产 甲 烷 菌 群 能 成 功培养传代，并能保证持续稳定的产甲烷量为驯化成功。 1． 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
所有的产甲烷菌都是专性严格厌氧菌，对氧非常敏感，遇 氧后会立即受到抑制，不能生长繁殖，有的还会死亡［2］。长期 以来，人们对产甲 烷 菌 的 分 离、培 养、分 类、生 理 代 谢、细 菌 结 构和基因排列等 方 面 做 了 大 量 的 研 究，并 取 得 了 一 定 的 研 究 成果［3 － 8］。在沼气发酵过程中产甲烷菌的种类、数量和活性 决定了沼气的产量［9 － 11］。由于产甲烷菌生境的特殊性，目前 在实验室能纯培 养 出 的 产 甲 烷 菌 种 类 是 有 限 的 ，另 外 沼 气 池 内菌群结构复杂、微 生 态 环 境 的 不 可 控 性 等 都 制 约 着 沼 气 工 程的规模化发展。近年来产甲烷菌的人工培养及沼气池的菌 群结构、代谢调控逐渐成为研究热点［12 － 19］。
中图分类号： Q89； Q93 － 33 文献标识码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 02． 051
A Method of Screeing Preponderant Methanogenic Bacteria
ZHANG百度文库Yun － ru1 ，LIU Yi － xuan1 ，SHEN Qing － tao1 ，WANG Yong － zhong2
用 1． 2． 3 的方法对 3 号、4 号、5 号样品进行驯化。
2 结果与分析
2． 1 第一轮驯化结果 图 1 为 1 号和 2 号污泥样品第一轮富集驯化过程中沼气
甲烷含量随时间的变化。从图中可以看出 1 号污泥样品在发 酵的 1 ～ 6d 内甲烷产量呈逐渐上升的趋势，第 6d 后由于体系 进入少量氧气，甲烷产量下降。在相同的发酵时间内 2 号污 泥样品产生的气体中甲烷含量则一直呈上升趋势。
由图 4 可知，3 号和 5 号样品产甲烷较多且产量逐步上 升，最高分到 45 mL 和 36 mL，4 号样品产量很少，且呈产量逐 步降低的趋势。 2． 4． 2 第二轮驯化结果
在第一轮驯化的基础上，更换新鲜培养基对 3、4、5 号样 品进行第二轮驯化，第二轮驯化液为 40mL 培养基和 10mL 驯 化后菌液的混合液。
沼气中气体浓度用气相色谱仪检测，主要技术参数为： 色 谱柱填料为苯乙烯高分子多孔小球，柱长 2m，载气为 N2 ，流速 为 25mL / min，TCD 检测器，电流为 80mA，柱箱温度为 50℃ ，汽 化室 80℃ ，检测室温度分别为 120℃ ，柱前压力 0． 13Mpa，进样 量为 0． 5mL。 1． 2． 2 培养基的除氧
0 引言
沼气发酵是一个 微 生 物 协 同 作 用 的 过 程，由 多 种 产 甲 烷 细菌与非产甲 烷 细 菌 相 互 作 用、相 互 制 约 共 同 完 成。 产 甲 烷 菌是沼气发酵微生态系统中食物链末端的一群成员。在厌氧 条件下，产甲烷细 菌 利 用 非 产 甲 烷 细 菌 的 中 间 产 物 和 最 终 代 谢产物作为营养 物 质 和 能 源 而 生 长 繁 殖，最 终 产 生 大 量 甲 烷 和二氧化碳等［1］。
本文报道了一种 产 甲 烷 优 势 菌 群 的 筛 选 方 法 ，用 该 方 法
收稿日期： 2010 － 12 － 16； 修回日期： 2011 － 02 － 24 资助项目： 重庆市科技攻关项目（ “具有高效破壳与集气性能的内循环 自热式沼气反应器”，2009AC6056） 资助 作者简介： 张云茹（ 1977 － ） ，女，硕士，讲师，从事农业固体废物的处理 研究。
从图 5 可以看出，3 号和 5 号样品产甲烷量直线上升，在 培养至第 7d 甲烷产量分别为 52mL 和 38mL，4 号样品甲烷产
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量很小，随时间变化不大。 经过这两轮驯化，3 号和 5 号样品中的菌群能在人工培养
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将灭菌培养基 20mL 加入到 100mL 的无菌三角瓶中，用可 调电炉加热至沸腾后通入氮气 3 ～ 5min 以去除培养基中的溶 解氧，（ 以培养基中刃天青的颜色变化判断，无氧时刃天青无 色） ，之后按 2% （ V / V） 的比例迅速加入称量好的固体 Na2 S， 用 4 层透明胶带密封瓶口。 1． 2． 3 产甲烷菌群的驯化筛选
由于 2 号样品产甲烷量稳定，1 号样品产甲烷量降低，这 时更换新鲜培养基进入第二轮驯化。 2． 2 第二轮的驯化结果
在第二轮的驯化中，1 号和 2 号两个样品的 CH4 产量相比
图 3 第三轮驯化产甲烷量变化 Fig． 3 Variation of methane yield in the Cycle 3 domestication
第一轮的驯化，产甲烷高峰出现得更快，而且持续时间也相对 较长； 1 号样品在前 5d 中的 CH4 产量明显比 2 号样品要高，到 第 5d 1 号和 2 号样品甲烷产量分别达到 63 mL 和 54mL，均超 过系统气体总量的 50% 。但是 2 号样品 CH4 产量相对 1 号样 品持续稳定。结果表明驯化过程增强了菌种产甲烷的能力。
图 2 第二轮驯化甲烷产量变化 Fig． 2 Variation of methane yield in the Cycle 2 domestication
2． 3 第三轮的驯化结果
图 1 第一轮驯化甲烷产量变化 Fig． 1 Variation of methane yield in the Cycle 1 domestication
第三轮驯化过程中，1 号和 2 号样品菌群迅速适应环境， 环境中更早呈现无氧环境，利于产甲烷菌群的生长，CH4 产量 持续增高。结果表明： 经过三轮驯化，1 号和 2 号样品可以完 全在人工培养基中生长，产甲烷量持续稳定，驯化获得成功。 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
采用 2． 3 所述的方法，对 3、4、5 号污泥样品进行驯化。驯 化液包括培养基 20mL，污泥样品 20mL。 2． 4． 1 第一轮驯化结果
（ 1． School of Pharmacy ＆ Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054； 2． Institute of Engineering Thermophysics； Chongqing University，Chongqing 400030，China）
乙酸钠培养基含 微 量 元 素、维 生 素 混 合 液 基 详 见 参 考 文 献［20］，所加维生 素 液 中 盐 酸 吡 哆 醇 用 盐 酸 硫 胺 代 替，维 生 素 B12 用片剂，浓度不变。 1． 1． 3 仪器
SD － 3000B 气相色谱仪； SKP － 02B 恒温培养箱； XFS － 280 高压灭菌锅。 1． 2 方法 1． 2． 1 气体分析检测方法
64
生物技术
2011 年 21（ 2）
一种产甲烷优势菌群的筛选方法
张云茹1 ，刘逸轩1 ，沈庆涛1 ，王永忠2
（ 1． 重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054； 2． 重庆大学工程热物理研究所，重庆 400030） 摘要： 目的： 用简便易行的产甲烷优势菌群的筛选方法，筛选出能够人工培养的且高效产甲烷的复合微生物。方法： 用乙酸 钠除氧培养基驯化富含产甲烷菌的厌氧活性污泥，逐渐增加驯化体系中培养基和菌液的比率，使驯化体系中微生物菌群适应人 工培养条件。结果： 筛选出 4 个产甲烷优势菌群。筛选出的 1 号、2 号、3 号、5 号菌群在培养 7d 后均产甲烷量分别达到 46mL、 38mL、51mL、38mL，在短时间内 4 个菌群产甲烷量能持续稳定上升。结论： 验证表明建立的方法筛选高效产甲烷菌群简便易行， 为沼气工作者提供了一定的参考。 关键词： 产甲烷菌； 筛选； 驯化； 乙酸钠； 优势菌群
比较发现在相同的发酵时间内 2 号污泥样品的甲烷产量 较 1 号的高很多，2 号样品驯化体系中氧气含量比 1 号低。在 驯化前 6d 2 个样品中氧气含量逐渐下降，2 号样品中几乎检 测不到氧气谱峰。第 8d 检测时 1 号污泥样品中氧气含量上 升，产甲烷量迅速降低，表明体系中即使少量的氧气进入对产 甲烷菌的代谢活动用明显的影响。因此在驯化和测样过程中 要将整个体系密封好，严格控制氧气。
筛选到 4 个产能持续稳定产甲烷的优势菌群，为产甲烷菌群 的人工培养提供了一定的参考。
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 实验材料
1 号污泥样品取自重庆啤酒厂厌氧消化池，2 号污泥样品 取自重庆污水处理厂，3 号、4 号污泥取自重庆光大集团不同 污水处理池，5 号污泥样品取自重庆理工大学家属区化粪池。 1． 1． 2 培养基
在除氧培养基中用注射器注入 1 号、2 号污泥样品 20mL 密封，于恒温培养箱中 37℃ 静止培养，开始第一轮驯化。定时 检测产甲烷量的变化。每轮驯化每个样品均设 3 个重复。
当样品产甲烷量 持 续 上 升 或 急 剧 下 降 时，用 注 射 器 从 第 一轮的驯化液中吸取 15mL 注入 25mL 除氧乙酸钠培养基，同 条件进行第二轮驯化。
按同样的方法，第三轮驯化在三角瓶中注入 40mL 无菌培 养基和 10mL 经第二轮驯化的培养液。逐渐加大驯化液中培 养基和培养液的 比 率，直 至 用 人 工 培 养 基 对 产 甲 烷 菌 群 能 成 功培养传代，并能保证持续稳定的产甲烷量为驯化成功。 1． 2． 4 产甲烷菌群的筛选方法的验证
所有的产甲烷菌都是专性严格厌氧菌，对氧非常敏感，遇 氧后会立即受到抑制，不能生长繁殖，有的还会死亡［2］。长期 以来，人们对产甲 烷 菌 的 分 离、培 养、分 类、生 理 代 谢、细 菌 结 构和基因排列等 方 面 做 了 大 量 的 研 究，并 取 得 了 一 定 的 研 究 成果［3 － 8］。在沼气发酵过程中产甲烷菌的种类、数量和活性 决定了沼气的产量［9 － 11］。由于产甲烷菌生境的特殊性，目前 在实验室能纯培 养 出 的 产 甲 烷 菌 种 类 是 有 限 的 ，另 外 沼 气 池 内菌群结构复杂、微 生 态 环 境 的 不 可 控 性 等 都 制 约 着 沼 气 工 程的规模化发展。近年来产甲烷菌的人工培养及沼气池的菌 群结构、代谢调控逐渐成为研究热点［12 － 19］。