酵母双杂交系统
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交系统原理(一)
酵母双杂交系统原理(一)酵母双杂交系统1. 什么是酵母双杂交系统？•酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于测试两个蛋白质是否相互作用，并进一步研究其相互作用的特点和机制。
•这个系统基于酵母菌（酿酒酵母或拟南芥酵母）的特性，当两个蛋白质相互作用时，可以触发酵母的生长或表达特定的报告基因。
2. 酵母双杂交系统的原理•酵母双杂交系统基于两个重要的分子域：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
•DBD通常来自于一个转录因子，可以与DNA结合并调节基因的转录水平。
•AD则是一个激活域，可以与其他蛋白质相互作用并激活报告基因的表达。
•在酵母双杂交系统中，将待测蛋白的DBD与一个对照蛋白的AD 融合，构建成DBD-融合蛋白，而待测蛋白的AD与一个对照蛋白的DBD融合，构建成AD-融合蛋白。
•当两个融合蛋白相互作用时，DBD和AD相互结合，激活报告基因的表达，从而观察到酵母生长或报告基因的表达。
3. 酵母双杂交系统的应用•酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用和功能研究领域。
•可以用于筛选蛋白质相互作用的伙伴，发现新的蛋白质复合物。
•可以用于研究蛋白质的亚细胞定位和功能等特性。
•可以用于研究蛋白质结构和功能的变异。
•可以用于研究蛋白质与其他生物分子（如DNA、RNA、小分子化合物等）的相互作用。
•可以用于研究蛋白质的信号传导途径和调控机制。
4. 酵母双杂交系统的优缺点优点：•酵母双杂交系统是一种简单、快速、高通量的方法，可以同时测试多个蛋白质相互作用。
•可以研究蛋白质相互作用的强度和特异性。
•可以在活细胞环境下进行研究，更接近生物体内的情况。
缺点：•酵母双杂交系统可能存在假阳性和假阴性的问题，需要进行进一步的验证。
•酵母双杂交系统对蛋白质的折叠状态和局部结构要求较高，对于某些复杂蛋白质可能不适用。
•酵母双杂交系统无法直接观察蛋白质相互作用的动力学过程，只能得到静态的结果。
总结酵母双杂交系统是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，基于酵母菌的特性，通过构建融合蛋白实现对蛋白质相互作用的测试。
酵母双杂交系统原理的应用
酵母双杂交系统原理的应用1. 什么是酵母双杂交系统酵母双杂交系统是一种常用的方法，用于检测蛋白质之间的相互作用。
这个系统利用酵母细胞中的转录因子和报告基因来实现。
当两个蛋白质相互作用时，可以触发报告基因的表达，从而显示出它们之间的相互作用。
2. 酵母双杂交系统的原理酵母双杂交系统的原理主要基于透明质酸选择活化子（activation domain）和DNA 结合结构域（DNA-binding domain）相互作用。
这种相互作用会激活基因的表达，从而触发报告基因的产生。
酵母细胞中通常包含两个重要的部分：转录因子DNA 结合结构域（DBD）和活化因子 DNA 结合结构域（AD）。
•转录因子 DNA 结合结构域（DBD）：该结构域能够识别和结合目标DNA序列，从而调控基因的转录。
•活化因子 DNA 结合结构域（AD）：该结构域能够激活特定的报告基因的表达。
当两个蛋白质相互作用时，将目标蛋白质的DBD域与AD域融合到一个融合蛋白中。
当这个融合蛋白与另一个蛋白质结合时，就会形成一个激活结构，从而使报告基因得以表达。
3. 酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统在生物学研究中应用广泛。
以下列举了一些常见的应用领域：3.1. 蛋白质-蛋白质相互作用的研究利用酵母双杂交系统，研究人员可以快速筛选并确认蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。
通过构建大规模的蛋白质库，可以鉴定出蛋白质与蛋白质之间的相互作用网络。
这有助于理解蛋白质相互作用对于细胞的功能和调控的作用。
3.2. 蛋白质-小分子相互作用的筛选酵母双杂交系统也可以用于筛选蛋白质与小分子之间的相互作用。
研究人员可以将小分子与AD结构域融合，并与目标蛋白质库进行酵母双杂交筛选。
这有助于发现新的药物靶点，并加速新药的开发过程。
3.3. 酵母基因组互作网络的构建通过酵母双杂交系统研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，可以构建酵母基因组互作网络。
这个网络可以用来预测蛋白质功能、发现新的互作关系，并帮助研究人员理解细胞的调控机制。
酵母双杂交系统名词解释
酵母双杂交系统名词解释
嘿，你知道啥是酵母双杂交系统不？这可不是一般的东西啊！就好像是一把神奇的钥匙，能打开好多未知的大门。
酵母双杂交系统呢，简单来说，就是一种用来研究蛋白质相互作用的技术。
比如说吧，蛋白质 A 和蛋白质 B，它们之间有没有啥特别的关系呢？酵母双杂交系统就能帮我们搞清楚。
想象一下，酵母就像是一个小小的实验室，在里面各种蛋白质跑来跑去。
如果蛋白质 A 和蛋白质 B 能相互结合，那就像两个小伙伴手牵手一样，会产生一些特别的信号。
这就好比在黑暗中突然亮起了一盏灯，告诉你：嘿，它们俩有关系呢！
咱再具体点说，它是通过巧妙的设计，把要研究的蛋白质分别和特定的结构融合在一起。
然后把这些融合体放到酵母细胞里。
如果这时候出现了特定的反应，那就说明这两个蛋白质之间有互动。
这就好像是一场精心设计的游戏，只有符合条件的才能通关。
“哎呀，那这有啥用啊？”你可能会这么问。
用处可大啦！它能帮助我们理解细胞里各种复杂的过程，像是基因表达调控啊，信号转导啊等等。
就好像是在拼图，一块一块地拼凑出生命的奥秘。
而且哦，这个酵母双杂交系统就像一个超级侦探，能找出那些隐藏在细胞深处的蛋白质之间的秘密关系。
它让我们对生命的运行机制有了更深入的了解。
总之，酵母双杂交系统是生物学研究中非常重要的工具，它就像一
把开启生命奥秘之门的钥匙，让我们能更深入地探索生命的神奇世界。
怎么样，是不是很厉害？。
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。
近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。
其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。
1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。
大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。
它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。
通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。
2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。
（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。
大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。
（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。
3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。
例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。
在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。
此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。
例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
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酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的原理嘿，你有没有想过，在细胞这个小小的世界里，就像一个神秘的微观宇宙一样，科学家们是怎么去探索那些蛋白质之间的相互作用呢？今天呀，我就来给你讲讲这个超级有趣的酵母双杂交系统的原理。
我先给你讲个小例子，你可以把细胞里的蛋白质想象成一群小工匠，它们在细胞这个大工地上各自有着不同的工作，而且有些小工匠之间还得合作才能完成一些大工程呢。
酵母双杂交系统就像是一个特别的侦探工具，用来找出哪些小工匠（蛋白质）是彼此合作的。
那这个系统到底是怎么做到的呢？这就得从酵母这种小生物说起啦。
酵母啊，它是一种很神奇的微生物，科学家们对它可算是相当了解了。
在酵母双杂交系统里，我们要用到酵母细胞里的一些特殊机制。
酵母细胞里有一些基因的表达是受到严格控制的。
比如说，有一些基因就像是一把锁，只有用特定的钥匙才能打开，然后这个基因才能开始工作（表达）。
这里的钥匙就是一种叫转录激活因子的东西。
转录激活因子就像是一个小队长，它有两个重要的部分，一个是DNA结合域（BD），这部分就像是小队长的手，能紧紧抓住特定的DNA序列；另一个是转录激活域（AD），这个部分就像是小队长的嘴巴，能喊来其他小伙伴（各种转录相关的蛋白），一起让基因开始工作。
那怎么利用这个来检测蛋白质之间的相互作用呢？科学家们可聪明啦。
他们把一种想要研究的蛋白质（我们就叫它蛋白A吧）和DNA结合域（BD）连接在一起，就像是给蛋白A穿上了一件有特殊功能的衣服，这件衣服的特殊功能就是能让它抓住特定的DNA。
然后呢，把另一种蛋白质（蛋白B）和转录激活域（AD）连接在一起。
现在，假如蛋白A和蛋白B在细胞里是相互作用的好朋友，那会发生什么呢？哈哈，这就像是两个小伙伴本来就约好了要一起玩一个超级有趣的游戏。
当蛋白A和蛋白B相互作用的时候，就相当于这两个小伙伴紧紧抱在了一起。
这时候啊，那个穿着BD衣服的蛋白A和穿着AD衣服的蛋白B因为抱在一起，就组成了一个完整的像小队长一样的转录激活因子啦。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
第18章酵母双杂交系统 83页
a接合型和接合型（两者之间可，但自 身不能形成二倍体）
多克隆位点
DNA-BD
转化
a接合型酵母细胞
转化
接合型酵母细胞
筛选平板
筛选平板
生长菌苔
生长菌苔
同一个三重筛选平板
利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。 对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途 径等有重要意义。
五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和 改进措施
（一） 假阳性较多 （二） 转化效率偏低 （三） 阴性干扰
可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的
研究蛋白质相互作用的常用方法
•酵母双杂交（yeast two hybridization） •亲和层析 •免疫共沉淀 •蛋白质交联 •基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 •噬菌体显示系统筛选
第一节 酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用， 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到。
克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）
β-半乳糖苷酶
鉴定
（三）阴性干扰
两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表 达程度甚低以至于检测不出来。
原因：
融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，它通过酵母细胞内两个蛋白质的相互作用来筛选出蛋白质间的相互作用关系，从而揭示细胞内蛋白质相互作用的网络。
酵母双杂交系统的原理主要包括构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用。
下面将详细介绍酵母双杂交系统的原理。
首先，构建酵母表达载体。
在酵母双杂交系统中，需要构建两个不同的表达载体，一个用于携带“诱饵”基因，另一个用于携带“靶标”基因。
诱饵基因编码的蛋白质与靶标基因编码的蛋白质是我们想要研究的两个相互作用蛋白。
这两个基因分别被插入到酵母表达载体的多个位点上，以便在酵母细胞内进行表达。
其次，转化酵母细胞。
构建好的酵母表达载体需要通过转化的方式导入到酵母细胞内。
在酵母细胞内，这两个载体会分别表达诱饵蛋白和靶标蛋白，从而在细胞内形成一种相互作用的条件。
接着，筛选阳性克隆。
经过转化后的酵母细胞需要进行筛选，以筛选出表达了诱饵蛋白和靶标蛋白的阳性克隆。
这一步通常通过对酵母细胞进行培养和筛选培养基来实现，只有表达了两个蛋白质的酵母细胞才能生长并形成克隆。
最后，验证蛋白质相互作用。
经过筛选得到的阳性克隆需要进行蛋白质相互作用的验证。
这一步通常通过蛋白质相互作用实验来进行，例如酵母双杂交实验、共免疫沉淀实验等。
通过这些实验，可以验证诱饵蛋白和靶标蛋白之间是否存在相互作用关系。
总的来说，酵母双杂交系统的原理是通过构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用来揭示蛋白质间的相互作用关系。
这一方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值，可以帮助科研人员更好地理解细胞内蛋白质相互作用的网络，从而为疾病治疗和药物开发提供重要的理论基础。
LexA酵母双杂交系统简介
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3.大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4.对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)假阳性检测质粒5.引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法。
该系统利用酵母细胞中转录因子的功能来分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
该系统的基本原理如下：
首先，选择一个酵母菌株，该菌株的基因组中包含了人类感兴趣的蛋白质的编码基因。
同时，构建两个酵母菌株的转录因子的变体，这两个转录因子变体分别包含感兴趣的蛋白质的结构域。
其中一个转录因子变体被命名为“BD融合蛋白”，另一个
转录因子变体被命名为“AD融合蛋白”。
然后，将这两个酵母菌株进行双杂交，使其杂交在一起。
如果感兴趣的蛋白质与其他蛋白质发生相互作用，那么这些蛋白质就能够重新组合形成一个完整的功能性转录因子。
这个功能性的转录因子可以结合到酵母细胞中的报告基因的启动子上，从而激活报告基因的表达。
通过检测和测量报告基因的表达水平，就可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。
需要注意的是，酵母双杂交系统虽然是一种有效的检测蛋白质相互作用的方法，但仍然有一些限制。
首先，该系统的结果并不能直接转化为体内或人体中的相互作用情况，因为在酵母细胞中的条件下进行的双杂交实验可能与真实情况存在差异。
其次，该方法可能存在假阳性或假阴性的情况，即可能会出现误判。
综上所述，酵母双杂交系统是一种通过利用酵母中的转录因子功能来检测蛋白质相互作用的实验方法。
通过对报告基因的表达水平进行测量，可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。
然而，该方法存在一些限制，需要谨慎分析和解释结果。
酵母双杂交体系
酵母双杂交系统
技术步骤
应用
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交
阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
4、建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼 此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在 着功能上的联系，通过基因组的测序和序列分析发现了很
1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途
径。用已知基因作诱饵，利分离得到AD-Library载体，对其进行
测序并在GenBank中进行比较，可以得到与已知
基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研 究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之 间功能相关的主要方法。
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
多新的基因和EST序列。
HUA等人利用酵母双杂交技术，将母双杂交技术，绘制出了人与致病性细菌
蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。
蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人
与致病菌间的相互作用关系奠定了基础。
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
酵母双杂交系统(参考资料)
GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A：在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
15
B：菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的原理酵母双杂交(systems)系统是一种基于酵母(yeast)细胞的生物技术，该技术用于研究蛋白质相互影响及其在蛋白质互作网络中的作用。
该技术采用重组DNA 技术将目标基因插入酵母细胞的基因组内，在酵母细胞内表达融合蛋白，通过检测融合蛋白的相互作用来分析蛋白质间的相互作用关系。
酵母双杂交系统的原理：酵母双杂交系统(principle of yeast two-hybrid system)基于蛋白质间的相互作用原理，其中包括：转录调控、信号传递及代谢途径等方面。
首先需要构建两个载体，一个是酵母转录因子的DNA结合结构域（BD）融合载体，另一个则是酵母活化装置的活化结构域（AD）融合载体。
在BD载体中含有一个目标基因的蛋白质结构域，该载体专门用于识别具有相互作用能力的肽链。
这个肽链是作为目标基因的蛋白质结构域插入到BD载体的后端，从而形成一个融合蛋白(BD-Target)。
在AD载体则含有另一目标基因的蛋白质结构域，该结构域是作为另一个相互作用配体的蛋白质结构域插入到AD载体的后端，并形成一个融合蛋白(AD-Target)。
当两个融合蛋白(BD-Target和AD-Target)进入同一个酵母细胞时，它们会自行相互结合。
这种相互结合会使BD域融合物释放出其与DNA结合的传输活性。
该生物技术利用此原理，通过分离酵母细胞中的mRNA，并对其进行筛查确定其结合后的特异性。
同时，酵母细胞也会检测信息的转移，并以此促进由两个融合蛋白之间的相互作用而激活的报告基因的表达。
这些报告基因可以编码酵母细胞中可见性较高的荧光蛋白，从而方便检测生物体中的酵母如何解释信号。
酵母双杂交系统的优势：酵母双杂交系统是一种非常有用的方法，可以在操作简单的情况下，高效地分析蛋白质间的相互作用及其生物学意义。
酵母双杂交系统的优点如下：1.可高效筛选蛋白质相互作用：酵母双杂交系统在高通量筛选系统中表现出良好的性能表现；这表明可以将其用于大规模筛选目标蛋白质相互作用蛋白。
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４．寻找具有药物治疗作相互作 用的多肽、如果靶蛋白是药物设计的目标的话， 可以得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽 药物 。Ｙang等证明了一段Leu-X-Cys-X-GIu 多肽可以和成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白相互结合。 为这项研究打下了基础。
５．寻找与调控蛋白相互作用的化 合物
用以确定有相互作用的两个蛋白，在 恢复转录活性的双杂交系统中加入某一 分子化合物后。再检测报告基因的表达 强度，可以寻找抑制蛋白一蛋白相互作 用的小分子化合物。
６．蛋白质相互作用图谱的绘制
随着基因组研究计划的发展，以及mRNA 在不同组织器官及不同发育阶段的表达图 谱的构建(body map)，蛋白质在不同时空 状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。 在双杂交系统的BD及AD均接上cDNA库，让 它们随机表达蛋白，这样检测报告基因表 达的可能是A－B，B－c⋯⋯等一系列崭新的 蛋白一蛋白相互作用，据此可以绘出A－B －C的蛋白联系图谱。
母菌株含有特定报告基因，并已经去除相应转
录因子的编码基因，因此本身无报告基因的转 录活性。如果X、Y蛋白在酵母核内发生相互 作用，导致了BD与AD在空间上的接近，从而 激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达，
使转化体可在特定的缺陷培养基上生长。通过 筛选阳性菌落即可检测 “诱饵”和 猎物”蛋
白间的相互作用。
当GAL4的DNA结合区与DNA上游的激活序列（upstream activating sequence,UAS)结合，其转录激活区则能有效 地激活UAS下游报告基因的转录；当两者不能通过中间 序列结合，任一区域都不会激活下游报告基因的转录. 酵母双杂交系统将待研究的两个蛋白质，其中之一与 DNA结合区蛋白质构建成第一个融合蛋白，另外一个与 转录激活LacZ基因还可以与
HIS3基因融合在一起，只有当HIS3基因表达量足够
大时，转化细胞才能在合成培养基上生长。
2) 操作步测平板上筛选 阳性菌落 提取质粒DNA，转化大肠杆菌
阳性克隆的进一步鉴定
Bait protein
DNA-AD
Bait protein
LexA B42 BD
Library protein
Transctiption
LexA operator Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
将钓饵基因和目的基因分别与质粒载体融合。 两个穿梭质粒载体转化至酵母体内表达。该酵
(三) 酵母双杂交系统的应用
1) 优点:
⑴ 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录 因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵ 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞 内的真实情况。
⑶ 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因 而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作 用。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因 的表达， 产生"假阳性"结果。
（五）酵母双杂交系统的发展
近几年来，双杂交系统不断改进，发展 出了许多新的技术，对传统的双杂交系 统作出了重要的补充和扩展，成为蛋白 质间相互作用研究中充满活力的一个领 域。
１．针对报告基因
在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用 一半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，其表达往往 不能十分严谨地加以控制，容易产生一些假阳性。因 此，一个重要改进是引入额外的报告基因。目前大多 数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报告基因， 其中之一是LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相 同的转录激活因子结合位点，可以被相同的转录激活 因子(如上述的Gal4蛋白)激活。通过这种双重或多重 选择，既提高了检测的灵敏度又减少了假阳性的几率。
LexA B42 BD
No Transctiption
LexA operator Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
DNA-AD Library protein
No Transctiption
LexA operator Promoter LEU2 and Lac2 reporter genes
3) 酵母做报道株的优点
酵母双杂交系统所用的报道株为酵母。报道株 指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重 组质粒的宿主细胞。
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许 多优点:
〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征
性报道基因 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动
酵母双杂交技术是一种新的直接于细胞 内检测蛋白与蛋白相互作用、灵敏度很 高的遗传学新方法，它是1989年由 Fields和Song提出并初步建立的，自建 立以来得到了不断的完善及改进，已经 成为分析蛋白质相互作用的方法之一。
(二) 原理
酵母双杂交系统利用了酿酒酵母细胞的GAL4蛋白（半 乳糖苷酶的转录激活因子）调节半乳糖苷酶基因转录 的特点.GAL4蛋白有两个可分离的功能区，N端是DNA结 合区，C端为转录激活区.中间的一段序列的替换不影 响其功能，这为研究蛋白质间相互作用提供了可能.
1)简单的说,酵母双杂交就是利用酿酒酵母的GAL4蛋 白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激 活具有UAS（上游激活序列）报告基因表达筛选目的 基因的方法。 i. GAL4蛋白质是一个调控基因，控制半乳糖利用酶类 基因的表达，这些基因的5’-端存在UAS序列； ii. GAL4存在两个结构域：N-端(1-147)具有UAS-DNA 结合域(DNA-binding domain, BD), C-端(768-881)具有 转录激活结构域(transcriptional activation domain, AD)。这两个结构域可以单独起作用。
３．寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白
发现新的作用蛋白质是双杂交系统最广泛，也是最有 价值的应用。将感兴趣的目标蛋白基因克隆在BD载体， 而将要筛选的cDNA库克隆在AD载体。据此可以找到新 的结合蛋白。这些蛋白在信号传导方面很可能扮演重 要的角色，且对蛋白质组中特定的代谢途径中蛋白质 相互作用关系网络的认识发挥了重要的作用。例如 Staudinger等以PKC的BD作为“诱饵”来筛选小鼠T细 胞的cDNA库，找到了一个新蛋白PICK1，它和PKC的催 化结构域可以专一性地相互作用，并且是PKC磷酸化作 用的底物。对PICK1进行深入的研究有助于我们更清楚 地了解和PKC有关的信号传导。
GAL 4 AD
酵
GAL 4 DNA-BD
Transcription
母
GAL 1 UAS
Promoter
GAL1
的
双
杂 交 系
Protein X GAL 4
DNA-BD
GAL4 AD protein Y
统
示 意
GAL 4 AD
图
Protein X
Protein Y
GAL 4
Transcription
２．针对非核内蛋白质
在酵母双杂交系统中，BD－Ｘ与AD－Y在酵母细胞核 内发生相互作用，表达的融合蛋白需定向到核内来激 活报告基因的转录。这就可能限制了大量非核内蛋白 质，如膜受体蛋白质和细胞外分泌蛋白质等在此系统 中的应用。针对这一问题，Aronheim等构建了Sos恢复 系统(SOS recruitment system，SRS)。ras途径突变 体由于缺乏鸟苷酸交换因子(guanyl nucleotide exchangefactor，GEF)cdc25-2，而不能将外来信号传 递给膜上的Ras蛋白，致使酵母突变体在36℃不能存活， 将GEF(Sos蛋白)蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与蔻 酰化信号相连，使Y定位于膜上。这样，若X与Y结合， X连同的蛋白(GEF就会定位于膜上而靠近膜上的Ras蛋 白，激活ras途径，完成Sos过程，能在36℃生长。这 一系统的提出冲破了许多的局限。
3.哺乳动物细胞双杂交系统
目前双杂交系统主要还是建立在酵母这一体系之中， 它的蛋白质翻译后修饰，如N端糖基化和二硫键形成等 的水平还很难与高等真核生物相比拟。近几年来，已 初步建立了哺乳动物细胞双杂交系统。采用单纯疱疹 病毒的BP16编码区取代GAL4的AD区段，同时又引入另 一个含有氯霉索乙酰转移酶 (chloramphenicolaeetyltransferanse，CAT)报告基 因的表达载体，磷酸钙共沉淀法转化入HeLa细胞中进 行培养。该系统成功地验证了小鼠P53蛋白与SV40大T 抗原问的蛋白质相互作用。
2．确定蛋白质相互作用结构域或重要活 性位点
在证实两个蛋白能形成相互作用之后，可以对该蛋 白质缺失掉不同的片段来验证该蛋白在双杂交系统中 是否仍具有激活转录功能 从而对蛋白质中起作用的功 能域进行精确的定位，进而找到相互作用发生所必需 的氨基酸残基。例如。Li等在p53和SV40大T抗原的结 合实验中，对p53进行突变发现突变型的p53失去了和T 抗原结合的能力。这和一些癌症患者的P53蛋白发生突 变是一致的。
4) 高度敏感性
酵母双杂交系统在体内测定蛋白质的结合作用 具有高度敏感性。主要是由于：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋 白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而 如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行 多次洗涤，降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结 构域结合形成转录起始复合物而增强， 后者又 与启动子DNA结合， 此三元复合体使其中各 组分的结合趋于稳定。
物的蛋白结合
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的 转录调控因子的DNA－结合结构域(如 GAL4-bd)； 另一个基因融合到转录激活 结构域(如GAL4-ad)。激活结构域融合基 因转入表达结合结构域融合基因的酵母 细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子
重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。