水质 总大肠菌群测定作业指导书
大肠菌群检验作业指导书 (1)
有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定大肠菌群的检验方法，以按标准化进行操作。
2 适用范围适用于大肠菌群检验。
3 术语大肠菌群：在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌。
4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图无6 作业内容6.1 设备和材料净化工作台、培养箱（36±1℃）、新飞展示柜（0-10℃）、刻度吸管（10mL）、试管（18×200mm）、酒精灯、镊子、放大镜、培养皿、三角瓶（500mL）、显微镜等、40孔口的试管架、洗耳球等实验器材6.2 培养基和试剂75%酒精、生理盐水（0.9%）、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液等培养基及试剂。
6.3 操作步骤6.3.1 样品处理一般情况下，产品没有受到污染，按照以下方法检验：取待检样品10mL接种于含10mL双料乳糖胆盐发酵管内,接种5管，置于36±1℃生化培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，按下列程序进行。
6.3.2 分离培养从产酸产气的发酵管中用接种环挑取样液，划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃生化培养箱内，培养18-24h。
取出观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
6.3.3 证实试验有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页用接种环挑取疑似大肠菌群菌落（菌落呈黑紫色，表面有金属光泽），接种于乳糖发酵管内，置36±1℃生化培养箱内培养24±2h。
同时对上述可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
6.3.4 MPN值计算及报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL样品中大肠菌群的最可能数。
水中总大肠菌群测定
水中总大肠菌群的测定－多管发酵法一、实验目的联合水净化工程中的细菌查验，掌握水环境监测中和给水水质查验中大肠杆菌群数的测定方法，同时经过大肠杆菌群的测定，认识大肠杆菌群的生化特征。
二、原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法查验。
多管发酵法的原理是依据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等相关特性，经过初发酵试验、平板分别和复发酵试验等三个步骤进行实验求得水样中的总大肠菌群数。
试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN 表示。
三、仪器高压蒸气灭菌器；恒温培育箱；冰箱；生物显微镜；载玻片；酒精灯；镍铬丝接种棒；培育皿（直径 100mm）；试管（18× 180mm）；吸管（1、5、10mL）；烧杯；锥形瓶；采样瓶等等。
四、培育基的制备：1.乳糖蛋白胨培育液：将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶解于1000mL 蒸馏水中，调理溶液 pH 为—，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充足混匀，分装于试管中，于 115℃高压灭菌器中灭菌 20min，储存于冷暗处备用。
2.三倍浓缩乳糖蛋白陈培育液：按上述乳糖蛋白胨培育液的制备方法配制。
除蒸馏水外，各组分用量增添至三倍。
3.品红亚硫酸钠培育基（ 1）储备培育基的制备：于2000mL 烧杯中，先将20—30g 琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解，而后加入 3.5g 磷酸氢二钾及10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水增补到1000mL，调理溶液pH 至—。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g 乳糖，混匀，定量分装于250 或 500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在115℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
（2）平皿培育基的制备：将上法制备的储备培育基加热消融。
依据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比率汲取必定量的5%碱性品红乙醇溶液（ 1000mL培育基约加 20mL5%碱性品红乙醇溶液），置于灭菌试管中；再按比率称取无水亚硫酸钠（ 1000mL 培育基约加 5g 无水亚硫酸钠），置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少量使其溶解，再置于开水浴中煮沸 10min（灭菌）。
水—粪大肠菌群的测定实验作业指导书
粪大肠菌群的测定1、方法依据水质粪大肠菌群的测定多管发酵法 H J/ T 3 47-20072、适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
3、测定原理多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌的密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验室设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
3、1 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 1000ml制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
3、2 三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。
3、3 EC培养液成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾 4g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000ml制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。
置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。
灭菌后pH应为6.9。
3、4 培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液的颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
4、步骤4、1 水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样的接种量。
水-中-细-菌-总-数及大肠菌群的检测方案
水中细菌总数的检测及大肠菌群的测定一、实验的目的要求1、学习并掌握水的细菌学检测方法2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。
二、实验原理细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。
我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。
所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。
因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
平板菌落计数法的优点：能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
生活饮用水细菌卫生标准我国饮用水卫生标准：≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水三、实验仪器和材料(三)实验器材(1) 菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定；1)培养基：伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP042g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH为7.2～7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115℃灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
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每100ml水样中总大肠菌群数近似数
接种量，ml
每100ml水样中总大肠菌群数近似数
3.3.3平皿培养基的配制
将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液及一定量已灭菌的0.5％美蓝水溶液，加入已融化的贮备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。
水质监测作业指导书
水质监测作业指导书一、背景介绍水是我们生活中至关重要的资源，保障水质的安全对于人类的生存和健康至关重要。
因此，进行水质监测工作是必不可少的。
本指导书旨在为水质监测工作提供具体的指导和操作步骤，以确保监测结果准确可靠。
二、监测项目1. pH值测定pH值是衡量水样酸碱程度的指标，利用酸碱试剂对水样进行标定，通过比色或电极法来测定pH值。
2. 溶解氧测定溶解氧是衡量水体中氧气含量的主要指标，通常使用溶解氧电极法进行测定。
3. 浊度测定浊度是衡量水体中悬浮颗粒物含量的指标，可以使用浊度计或比色法进行测定。
4. 总大肠菌群检测总大肠菌群是衡量水体中微生物污染程度的指标，一般采用膜过滤法将水样进行过滤，将过滤膜培养在专用培养基上，通过计数来确定总大肠菌群的浓度。
5. 重金属测定重金属是水体中常见的污染物之一，可以使用原子吸收光谱仪或电感耦合等离子体发射光谱仪进行测定。
三、水样采集与处理1. 采集点的选择根据监测目的和需求，在各类水体中选择代表性的采样点，确保采样结果的可靠性与可重复性。
2. 采样器具准备准备干净的采样瓶、采样杯、滤膜、滤筒等必要的采样器具，并进行充分的清洗和消毒。
3. 采样方法根据监测项目的要求，选择合适的采样方法。
例如，溶解氧的采样需要密封瓶，防止氧气溶解度的变化；总大肠菌群的采样需要滤膜，将水样中的微生物固定在滤膜上。
4. 采样现场操作在采样点进行准备工作，标记好采样瓶，避免交叉污染。
在采样时，将瓶底接触水流，避免气泡和悬浮物的进入。
5. 混合样品处理对于大面积水体，需按照面积比例混合不同部位的采样样品，制备成混合样品，以提高代表性。
四、实验室操作与分析1. 样品保存正确保存采集的水样，避免样品中微生物生长和变质。
对于需保存较长时间的样品，应该进行适当的处理，比如冷藏保存或冷冻保存。
2. 仪器设备准备根据监测项目的要求，准备好相应的实验仪器和设备，保证实验结果的准确性。
3. 操作步骤与条件设定根据各个监测项目的操作标准，设置好实验条件和操作步骤，确保实验结果的准确性。
实验九水中总大肠菌群的测定
5 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌;则挑选该菌落的另一
部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中内有倒置管;每管可接 种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个;然后置于37℃恒温箱中培养24h; 有产酸 产气者;即证实有大肠菌群存在; 根据证实有大肠菌群存在的阳性管瓶 数查附表1大肠菌群检数表;报告每升水样中的大肠菌群数;
30min; 对热不稳定的培养基如含有葡萄糖 氨基酸等物时;应适当降低压力;
延长时间;
5灭
菌时间一到;切断电源;待压力降至零时;才能打开排气阀;然后打开灭菌器盖;
取出物品;
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝 倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取 1检测自来水
先将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌;再开放水龙头使水流5 min后;在 火焰旁打开灭菌三角瓶塞;以其接取水样;迅速地进行分析; 2检测池水 河水或湖水
培养基配制操作图示：
用漏斗分装培养基及摆斜面
培养基的分装：一般制作斜面培养基时;每只15×150毫米的试管;约装 3～4毫升1/4～1/3试管高度;如制作深层培养基;每只20×220毫米的试 管约装12～15毫升; 每只锥形瓶装入的培养基;一般以其容积的一半为宜;
包扎
1 培养皿：以旧报纸密密包紧;一般以6套做一包;待灭菌; 2 吸管：在距其粗头顶端约0 5cm处;塞一小段1 5cm长的棉花; 棉花要 塞得松紧恰当过紧;吹吸液体太费劲；过松;吹气时棉花会下滑;然后 分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端;与报纸约呈60º角; 并将右端多余的报纸打一小结; 3 三角玻扒：跟包扎吸管相似;将三角部分斜放在报纸条的近左端;与 报纸约呈45º角;并将右端多余的报纸打一小结; 4 玻璃器皿 金属器械包扎完毕后置干燥箱160170℃灭菌2 h
大肠菌群检验作业指导书[1]
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密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码1/81.0 水源水1.1 范围本法适用于天然泉水水源水大肠菌群的检验。
1.2 原理根据大肠菌群细菌具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN值。
1.3 培养基和试剂1.3.1 乳糖胆盐发酵培养液。
1.3.2 亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）。
1.3.3 灭菌生理盐水。
1.4 仪器1.4.1 超净工作台。
1.4.2 高压蒸汽灭菌锅。
1.4.3 培养箱：36℃±1℃。
1.4.4 冰箱：0℃～8℃1.4.5 电子天平：感量0.1g。
1.4.6 培养皿。
1.4.7 小倒管。
1.4.8 试管：150mm×20mm,140mm×15mm。
1.4.9 吸管：10mL、5mL、1mL。
1.4.10 接种环。
1.4.11 酒精灯。
1.5 检测步骤1.5.1 推测性检验1.5.1.1 吸取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.2 吸取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.3 另吸取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水中，混匀，用5mL灭菌吸管吸取5mL稀释液，分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，每管1mL（即0.1mL水样）。
轻摇试管，使液体充分混合，置36℃±1℃培养箱内培养24h。
观察每支管是否产气，若有气体产生该管则为推测性检验阳性。
如不产气则为大肠菌群阴性。
密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码2/81.5.2 确证性试验1.5.2.1 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）管中，置36℃±1℃培养箱中培养48h。
1.5.2.2 观察BGB管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为“大肠菌群阳性”；如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。
水中总大肠菌群的测定法(多管发酵法)
1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。
2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。
本标准参照GB 5750-85制订。
3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。
3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。
3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。
3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。
3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。
再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。
总大肠菌的测定实验作业指导书
水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质水中总大肠菌群的测定多管发酵法2、适用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、试剂4.1 乳糖蛋白胨培养液:蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g氯化钠 5g乳糖 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 100ml将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
水质_总大肠菌群测定作业指导书
水质总大肠菌群测定作业指导书1水样采集、运输和保存1.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；1.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；1.3 样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL）溶液；采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na21.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；1.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；1.6 采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。
2分析方法2.1方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二章五(一)方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱显微镜冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。
接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4培养基2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
水质 总大肠菌群测定作业指导书
WJES/QZ-0030-2003文件编号：常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质总大肠菌群测定作业指导书第1页共6页水质总大肠菌群测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
1.2方法原理多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标（GB/T 14848-93）ⅡⅢⅣⅤ3.01001003.0表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）表1-3 总大肠菌群渔业水质标准（GB 11607-89）贝类养一般渔业用500-83（）1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准表沿海（距最近陆沿（距最近陆1里以内海里10000（GB 13457-92）禽类屠宰加工、畜类屠宰加工、肉制品加一二三25002500100002分析方法方法名称、方法来源及适用范围2.11WJES/QZ-0030-2003文件编号：常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质总大肠菌群测定作业指导书第2页共6页方法名称：多管发酵法方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二章五(一) 方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱显微镜冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。
总大肠菌的测定试验作业指导书
水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质水中总大肠菌群的测定多管发酵法2、适用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48卜之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽抱、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、试剂4.1乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨10g牛肉浸膏3g氯化钠5g乳糖5g1.6%澳甲酚紫乙醇溶液1ml蒸馏水100ml将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2〜7.4,再加入1.6%澳甲酚紫乙醇溶液1ml,充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
水质粪大肠菌群操作注意事项 作业指导书1
水质粪大肠菌群的测定多管发酵法作业指导书本试验基本操作参照《HJ/T 347—-2007 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行）》制定此作业指导书。
1。
培养基、试剂与仪器本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水;操作者必须建立“无菌概念"和掌握“无菌操作技术",所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌，试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。
单倍乳糖蛋白胨培养液:称取23。
0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的玻璃倒管（杜氏小管)的20x200mm试管中，每试管10ml（注意玻璃倒管中不能有气泡，若出现气泡,可用手指轻弹玻璃管）塞紧塞子，置于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
三倍乳糖蛋白胨培养液：称取69。
0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中(注意煮沸步骤可能糊底，也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代）,其它操作同上.EC 培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管10ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液）,于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
伊红美蓝培养基:称取36。
0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后,分装于三角烧瓶中。
于高压蒸汽灭菌器中,在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用.生理盐水:在烧杯中配制适量的质量分数为0.9%的生理盐水,分装于试管中，每试管9.5mL,于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min,贮存于暗处备用。
（本实验室中灭菌锅蒸发量为0。
5mL)培养基的存放：在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
本实验室将培养基放置在4℃冰箱中保存。
水中总大肠菌群的测定
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
实验九 水中总大肠菌群的测定
（2）检测池水、河水或湖水
应取距水面10－15cm的深层水样，先将灭菌带玻璃塞的空瓶瓶口向下 浸入水中，然后翻转过来，拨开玻璃塞，水即流入瓶中，满后将玻璃塞塞
好，再从水中取出。有时需用特制的采样器取水样。采取的水样最好立即
维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降
低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打 开灭菌器盖，取出物品。
手提式高压蒸 汽灭菌锅
高压蒸汽自动 灭菌锅
斜面摆放与冷凝
倒平板操作法示意图
五 操作步骤 1 水样的采取
（1）检测自来水
4 分离培养
将初发酵的阳性管(产酸产气)的菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂培 养基平板。置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态。 选择符合大肠菌群菌落特征的菌落:① 深紫黑色，有金属光泽；② 紫黑色， 不带或略带金属光泽；③ 淡紫红色，中心颜色较深, 挑取一部分，进行革 兰氏染色。
思考题
1. 何谓大肠菌群？它主要包括哪些细菌属 ？ 2. 假如水中有大量致病菌，如：痢疾、伤 寒、霍乱等病原菌，用多管发酵法检测总 大肠菌群，能否得到阳性结果？为什么？ 3. 为什么接种100、10 mL水样，用的是3 倍 浓缩的乳糖蛋白胨培养基，而接种1.、 0.1、0.01、0.001 mL水样，则用乳糖蛋白 胨培养基？
（2）水源水
在装有5ml 3倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中加入10ml水样品；于各装有 10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各 装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1：10 稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养 48h。 （可以根据水的污染程度选择3个稀释度）
水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定
水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定1、实验目的1.1学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义.1.2学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法.1.3学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
2、实验原理2.1水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。
本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony—forming unit,cfu）数,故其单位应是cfu/g(mL）。
它反映的是检样中活菌的数量。
2.2所谓大肠菌群，是指在37℃、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示.2。
3水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样.多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。
2.3.1初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉式小套管。
乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖产酸产气.培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由紫变黄。
发酵管经37℃培养24h,小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明说中存在大肠菌群,为阳性结果。
但是,有个别其他类型的细菌此条件下可能产气，且产酸不产气的发酵管，也不一定非大肠菌群,因其也可能延迟48小时才产气，这两种情况应视为可疑结果，因此需继续进行下面实验，才能确定是否为大肠菌群.48小时后仍不产气的为阴性结果。
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水质总大肠菌群测定作业指导书
1含义及执行标准
1.1含义
总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
1.2方法原理
多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准
表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标（GB/T 14848-93）
表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）
表1-3 总大肠菌群渔业水质标准（GB 11607-89）
1.4水污染物排放标准
表1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准（GB 3552-83）
2分析方法
2.1方法名称、方法来源及适用范围
方法名称：多管发酵法
方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二
章五(一)
方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。
2.2仪器
高压蒸汽灭菌器
电热干燥箱
恒温培养箱
显微镜
冰箱
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压
蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备
将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包
括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。
接种完后需记录：母种的来源，母种和工作
种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯
度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4 培养基
2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 品红亚硫酸钠培养基：市售品红亚硫酸钠培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.4.4 伊红美蓝培养基：市售伊红美蓝培养基，按铭牌配制，分装于三角烧杯内，加塞，
在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
2.3.5培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。
2.5分析步骤
2.5.1 生活饮用水
①初发酵实验：在二个装有已灭菌的50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的大试管中（内有倒
管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100ml；在10支装有已灭菌的5ml三倍浓缩乳糖
蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10ml，混匀后置于
37℃恒温箱培养24h。
②平板分离：经初发酵试验培养24h后，发酵试管颜色变黄为产酸，小玻璃倒管内有气泡为
产气。
将产酸产气及只产酸发酵管，分别用接种环划线接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱内培养18～24h ，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落；伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。
③复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养基中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱内培养24h ，有产酸产气者，即证实有大肠菌群菌存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管数查表6，报告每升水样中的大肠菌群数。
2.5.2 水源水
①将水样作1：10稀释。
②于各装有5ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加10ml 水样；于各装有10ml 乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml 水样；于各装有10ml 乳糖蛋白胨培养液的五个试管中（内有倒管），各加1ml1:10稀释的水样。
共计15管，三个稀释度，将各管充分混匀，置于37℃恒温箱培养24h 。
③平板分离和复发酵试验的检验步骤同（1）“生活饮用水”检验方法。
④根据证实总大肠菌群存在的阳性管数查表7，即求得每100ml 水样中存在的总大肠菌群数。
2.5.3 地表水和废水
①地表水中较清洁水的初发酵试验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。
有严重污染的地表水和废水初发酵试验的接种水样应作1：10，1：100；1：1000或更高的稀释，检验步骤同2.5.2饮用水源水检验方法。
②如果接种的水样量不是10ml ，1ml 和0.1ml ，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN 指数，再经下面的公式换算成每1L 的MPN 值，即为1L 水样中的总大肠菌群数。
2
10
-⨯=
第一个浓度的接种量指数
值MPN MPN
表6 大肠菌群检数表
（接种水样100ml2份，10ml10份，总量300ml）
10ml水量的阳性管
数
100ml水量的阳性瓶数
0 1 2
1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数
0 ＜3 4 11
1 3 8 18
2 7 1
3 27
3 11 18 38
4 14 24 52
5 18 30 70
6 22 36 92
7 27 43 120
8 31 51 161
9 36 60 230
10 40 69 ＞230
表7 最可能数（MPN）表
（接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时，不同阳性及阴性情况下100ml
3 质量控制要求 3.1 对照控制
采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。
3.2 精确度
同一实验人员所作前15个阳性水样平行双样结果为X 1i 、X 2i （X 1i 、X 2i ＞0，i ＝1，2，…，15），则精确度判断值＝R ⋅27.3。
（ ，i i i
X X R 21log log -= ）
当分析所得21log log X X R -=＞R ⋅27.3表示精密度已失控；否则平行双样的差
距可以接受。
4 数据处理 4.1 数据审核
分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。
4.2 数据填报
总大肠菌群报告以个/L 单位填报，当数量在100以内按实有数据报告；大于100采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用
∑==15
1
15/)(i i R R
10的指数形式表示（如报告16，000或1.6×104）。
5样品采集
5.1 采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；
5.2 样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；
5.3样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液；
5.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采；
5.5 采样时，采样瓶不得用水样荡洗；
5.6 采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。
6期间核查
6.1人员素质
首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。
同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。
按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。
6.2仪器设备
臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。
7分析环境条件控制
7.1仪器设备
保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。
7.2无菌室
定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足。
7.3分析环境条件检查和记录
每次分析样品时，作无菌室空气细菌培养对照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。
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