检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解1、苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2021，糖精钠的检测参照GB/T5009.28-2021，即可开展试验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个精确牢靠的结果，也存在肯定的难度，很多新手常消失因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者依据自己多年该方面工作的实际阅历动身，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的推断等几个易出问题的方面，进行了具体的阐述。
2、样品前处理的留意事项GB/T5009.28-2021和GB/T5009.29-2021在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只叙述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不洁净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较抱负的沉淀剂，尽量排解待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/T5009.29-2021使用5%硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不抱负。
如用10%钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10%亚铁氰化钾溶液和20%醋酸锌溶液则效果更抱负(这是笔者目前用过最抱负的沉淀剂)。
详细操作步骤如下：取肯定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品5.0克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡匀称，加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0ml，加入9.5mL10%亚铁氰化钾溶液，9.50mL20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物,初滤液过0.45m微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。
用这种方法简洁易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满足；缺点是肯定要用液相色谱法检测，有肯定局限。
高效液相色谱法测定糕点中苯甲酸.山梨酸.糖精钠含量的研究
高效液相色谱法测定糕点中苯甲酸.山梨酸.糖精钠含量的研究摘要本文对国标法进行改进,建立了用HPLC测定糕点中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠的前处理方法。
结果表明,该方法平均回收率均达到92.8%以上,符合试验要求。
关键词HPLC;糕点;苯甲酸;山梨酸;糖精钠;前处理苯甲酸、山梨酸是有机化学防腐剂,可以防止食品腐败变质,延长食品保存期,抑制食品中微生物繁殖;糖精钠是一种人工合成甜味剂,其糖度为蔗糖的500倍,且价格低廉。
上述3种添加剂在食品加工过程中被广泛使用,但过量食用会对人体会产生一定影响,因此对食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量进行检测有重要意义。
目前,国标法(GB/T 5009-2003)[1]使用高效液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠只适用于汽水、果汁、配制酒等液体食品,但在实际工作中,经常遇到固体食品(如糕点)需要检测。
由于糕点类食品含有蛋白质、淀粉类大分子,以及油脂,直接进样会堵塞、损伤色谱柱;而采用有机溶剂提取,操作过程繁琐,对操作者健康的损害大。
为此,笔者对国标法进行改进,探讨出针对糕点样品的HPLC前处理方法,进行糕点样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量测定,获得了良好的效果。
1 试验原理糖精钠是易溶于水的盐类,样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(1.0 mol/L)浸泡后,转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠,经沉淀蛋白质、过滤等处理后,3种被测组分滞留于水相中与杂质分离,经流动相带进色谱柱后进行分离,以保留时间定性,以峰面积定量。
2 材料与方法2.1 材料2.1.1 仪器1)高效液相色谱仪;2)快速扫描紫外分光检测器;3)超声波清洗器;4)0.45μm微孔滤膜过滤器;5)台式低速大容量离心机;6)样品粉碎机。
2.1.2 试剂1)甲醇,色谱纯;2)0.02 mol/L的乙酸铵溶液;3)1.0 mol/L氢氧化钠溶液;4)6 mol/L盐酸溶液;5)106 g/L的亚铁氰化钾溶液;6)220 g/L的乙酸锌溶液;7)50 g/L饱和硼砂溶液;8)纯水,2次重蒸水。
教案3 食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定
项目五用高效液相色谱法检测物质任务一食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的测定（液相色谱法）单元一液相色谱分离原理和液相色谱仪的基本组成教学内容苯甲酸和山梨酸是我国目前最常用的食品防腐剂，广泛应用于各种果汁饮料中，以防止其变质。
但如果防腐剂的含量超过标准限度，或者长期饮用含有防腐剂的饮料，则会对人体健康造成不得影响，因此检测果汁中的苯甲酸和山梨酸含量是非常有必要的。
表GB2760-2007国家食品添加剂使用卫生标准抑制物质腐败的药剂。
即对以腐败物质为代谢底物的微生物的生长具有持续的抑制作用。
重要的是它能在不同情况下抑制最易发生的腐败作用，特别是在一般灭菌作用不充分时仍具有持续性的效果。
对纤维和木材的防腐用矿油、煤焦油、丹宁，对生物标本用甲醛、升汞、甲苯、对羟基苯甲酸丁酯、硝基糠腙衍生物或香脂类树脂。
在食品中使用防腐剂受到限制，因此多靠干燥、腌制等一些物理的方法。
特殊的防腐剂有乙酸等有机酸、以油酸脂为成分的植物油、芥子等特殊的精油成分。
对于生物体的局部（如人体表面或消化道），可以根据具体条件采用各种防腐剂（如碘仿、水杨酸苯酯、苯胺染料或吖啶类色素等）。
我国规定使用的防腐剂有苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等25种。
防腐剂应具备的几个条件：1、性质较稳定：加入到食品中后在一定的时期内有效，在食品中有很好的稳定性2、低浓度下具有较强的抑菌作用3、本身不应具有刺激气味和异味4、不应阻碍消化酶的作用，不应影响肠道内有益菌的作用5、价格合理，使用较方便。
防腐剂的作用机理：1、能使微生物的蛋白质凝固或变性，从而干扰其生长和繁殖。
2、防腐剂对微生物细胞壁、细胞膜产生作用。
由于能破坏或损伤细胞壁，或能干扰细胞壁合成的机理，致使胞内物质外泄，或影响与膜有关的呼吸链电子传递系统，从而具有抗微生物的作用。
3、作用于遗传物质或遗传微粒结构，进而影响到遗传物质的复制、转录、蛋白质的翻译等。
4、作用于微生物体内的酶系，抑制酶的活性，干扰其正常代谢。
饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定
仪器关机
测定结束后，点停止，停止泵运行。把A瓶 中的滤头取出，放入超纯水中，设定水：甲 醇=90：10的比例，点运行，启动泵运行 30分钟。30分钟后再设定100%甲醇运行 30分钟，后关闭软件，电脑。依次关闭各模 块电源。
实验步骤1
按照下列高效液相色谱参考条件和仪器操作说明开 机，设定。 检测器：紫外检测器，230nm波长， 色谱柱：C18 4.6×250mm, 5μm不锈钢柱 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02 mol/L） =5:95（先100%甲醇运行10分钟后再设定次比 例） 流速：1 mL/min 进样量：10 μL
实验步骤4
先进混和标准溶液（ 0.1mg/mL）一针分 析，记录色谱图及各峰面积保留时间。 进汽水样品溶液，根据保留时间定性，外标 峰面积法定量。以其峰面积求出样液中被测 物质的含量，供计算。
数据处理
以糖精钠为例
式中 X------试样中糖精钠含量，g/kg; A------进样体积中糖精钠的质量，mg； V2-----进样体积，mL； V1-----试样稀释液总体积，mL； m-----试样质量，g。
饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠 的测定—HPLC法
1、掌握HPLC测定饮料中糖精钠、苯甲酸钠和山 梨酸钾的原理和方法。 2、了解HPLC的结构，学习HPLC的操作方法。 3、掌握HPLC的定性定量方法
糖精钠是最古老的甜味剂。糖精于1878年被美国 科学家发现，很快就被食品工业界和消费者接受。 糖精的甜度为蔗糖的300倍到500倍，它不被人体 代谢吸收，在各种食品生产过程中都很稳定 。 据国外资料记载，1977年加拿大进行的一项多代 大鼠喂养实验发现，摄入大量的糖精钠可以导致雄 性大鼠膀胱癌。因此，美国等发达国家的法律规定， 在食物中使用糖精时，必须在标签上注明“使用本 产品可能对健康有害，本产品合有可以导致实验动 物癌症的糖精”的警示。
山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜
标准溶液
糖精钠标准储备溶液：准确称取0.0851g经 糖精钠标准储备溶液：准确称取0.0851g经 120℃烘干4h后的糖精钠，加水溶解并定 120℃烘干4h后的糖精钠，加水溶解并定 容至100mL，糖精钠含量为1mg/mL。 容至100mL，糖精钠含量为1mg/mL。 安赛蜜标准储备溶液：准确称取0.1000g安 安赛蜜标准储备溶液：准确称取0.1000g安 赛蜜，加水溶解并定容至100mL，安赛蜜 赛蜜，加水溶解并定容至100mL，安赛蜜 含量为1mg/mL。 含量为1mg/mL。
待测液的制备
→15mL水洗入50mL容量瓶中 液体试样15g } ↓ 定容至刻度 ←乙酸铅、草酸钾磷酸氢二钠各4mL ↓ 氨水（1+1） 静置15min→ 滤纸过滤 调节pH约7 ↓
0.45μm滤膜过滤
固体试样5g
色谱参考条件
色谱柱：C18柱（粒径5μm， 色谱柱：C18柱（粒径5μm， 250mm×4.6mm） 250mm×4.6mm） 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/L） 流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/L） （30:70）（根据情况可以调整） 30:70） 流速：1.0mL/min。 流速：1.0mL/min。 检测波长：紫外检测器，波长230nm。 检测波长：紫外检测器，波长230nm。 进样量：20μL。 进样量：20μL。
标准溶液
山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜标准混 合溶液 取山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛 蜜标准储备溶液各1.0mL，放入100mL容 蜜标准储备溶液各1.0mL，放入100mL容 量瓶中，加水至刻度。此溶液含山梨酸、 苯甲酸、糖精钠、安赛蜜各10μg/mL，经 苯甲酸、糖精钠、安赛蜜各10μg/mL，经 0.45μm滤膜过滤。 0.45μm滤膜过滤。
实验 高效液相色谱法讲解
前处理
(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜
目的： 除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤 其是使用无机盐配制的缓冲液。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂 尼龙 66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以 用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 同样适用于水溶性样品和有机溶剂
3.测定
色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95); 流速:1ml/min 检测波长:230nm
取样品处理液和标准系列溶液各10μl注入高效 液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时 间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标, 相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计 算回归方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程 求出)样液中被测物质的含量,按下式计算:
溶剂前处理-脱气
1. 吸气器法（流动相抽滤） *可以抑制制做流动相时产生的气泡 *只是暂时的脱气法 *不能解决因溶解气体造成的问题
2. 超声脱气法 3. 使用氟树脂膜的减压脱气法
溶剂前处理 -脱气
★使用超声波震荡器，一般超声震荡 15 分钟左右 ★注意流动相在超声震荡脱气过程中，温度会升
Cx
?
C ? V0
?V
式中:
Cx为样品中被测物的含量,g/kg C 为在标准曲线上查得的相对应的糖
精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml
V0 为样品定容体积,ml V 为取样体积,ml
[ 思考题]
1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳? 2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸 的测定有何影响？
液相色谱法测定食品中的糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸
134 食品安全导刊 2020年9月Tlogy科技分析与检测食品很容易因为温湿度、环境等出现变质，给企业带来巨大经济损失，也会制约食品行业发展。
防腐剂的添加很好地延长了食品的保质期，因此被广泛添加到食品中。
目前常添加的有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、丙酸及其盐、脱氢乙酸等。
甜味剂能够改善口感进而增加食欲，常用的甜味剂有糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜与阿力甜等[1]。
近些年的研究表明食品添加剂超量使用也会危害人体健康，食品安全国家标准对防腐剂和甜味剂的添加量作出明确规定，以保证食品安全[2]。
本文采用液相色谱法同时测定食品中所添加的苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、糖精钠和安赛蜜。
1 试验部分1.1 仪器与试剂Waters allianc acquity e2695液相色谱仪；涡旋混合器；HR/T20 MM 立式高速冷冻离心机；KH-250DB 数控型超声波清洗器。
甲醇（HPLC 纯）；乙酸铵、亚铁氰化钾、乙酸锌均为分析纯；标准试剂：山梨酸、安赛蜜、苯甲酸、糖精钠纯度均＞99%。
1.2 色谱条件色谱柱：C 18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相：甲醇+乙酸铵溶液=8+92；柱温：35 ℃；进样量：10 μL，检测波长：230 nm；流速：1 mL/min。
1.3 样品前处理取2.5 g 左右样品于50 mL 离心管中，加入25 mL 水涡旋振荡，加入2 mL 10.6%的亚铁氰化钾溶液涡旋20 s 混匀，再加入2 mL 22%的乙酸锌溶液涡旋1 min 后定容至刻度线，超声30 min，于10 000 r/min 离心10 min，上清液转移至50 mL 容量瓶中，残渣再加水混匀后离心提取一次，上清液合并至原容量瓶中，用水定容至刻度线混匀，取上清液2 mL 过 0.22 μm 滤膜，供液相色谱上机检测。
2 结果与讨论2.1 流动相条件的选择参照GB 5009.28-2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》检测标准，通过改变甲醇的比例[1]对比验证标准品目标峰的分离和出峰时间，最后确定流动相条件为：甲醇+乙酸铵溶液=8+92。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法验证
066苯甲酸、山梨酸、糖精钠是常用的食品添加剂，也是衡量食品卫生质量的重要指标。
苯甲酸、山梨酸具有防腐保鲜的作用，糖精钠是合成甜味剂，甜度比蔗糖甜300－500倍。
GB2760－2016《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》对这三者的添加范围和限量都有明确的规定，超范围或者超限量使用都是违法的。
GB5009.28－2016《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》对其检测方法做了规定，有高效液相色谱法和高效气相色谱法，其中高效液相色谱法为第一法仲裁法被广泛应用。
国标方法在使用前要进行方法验证，核查实验室能否满足检测方法的要求。
本研究针对高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的适用性、线性、检出限、定量限、加标回收率等进行了一一验证，均能够满足检测方法的要求。
一、仪器与试剂1.仪器。
高效液相色谱仪（紫外检测器，Y001），岛津LC－20AT；电子分析天平（Y033），BSA623S－CW，d ＝0.001g。
2.试剂。
苯甲酸钠标准品（唯一性标识3422003，纯度100.0％），北京坛墨质检科技有限公司；山梨酸标准品（唯一性标识3192003，纯度99.9％），北京坛墨质检科技有限公司；糖精钠标准品（唯一性标识3212005，纯度99.5％），北京坛墨质检科技有限公司；甲醇（色谱级），Aigma－Aldrich；乙酸铵（色谱级），aladdin；亚铁氰化钾、乙酸锌（分析纯），天津市天力化学试剂有限公司；实验室用水为自制超纯水。
二、实验与方法1.色谱条件。
（1）色谱柱：Diamonsil Plus 5um C 18，250×4.6mm；检测波长230nm；进样量10uL。
（2）流动相：甲醇＋乙酸铵溶液（0.02mol/L）＝5＋95；流速1mL/min。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的方法验证2.样品前处理。
准确称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min。
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本方法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定。
2 依据GB/T 23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法》。
3 原理不同样品经提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分离测定，根据保留时间定性，外标峰面积定量。
.4 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682要求。
甲醇，乙酸铵等。
苯甲酸标准储备液：称取0.0638g 苯甲酸，用少量乙醇溶解并用水定容至100mL 。
山梨酸标准储备液：称取0.0766g 山梨酸，用少量乙醇溶解并用水定容至100mL 。
糖精钠标准储备液：称取0.0766g 糖精钠，用水溶解并定容至100mL 。
混合标准使用液：分别吸取不同体积苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成适当浓度，见附后标准曲线图谱。
5 分析步骤 5.1 样品处理称取适量样品（雪菜）于小烧杯中，用50mL 水分数次将样品移入100mL 容量瓶中，80℃水浴提取30min ，冷却后定容、过滤，滤液待上机分析。
5.2 色谱条件a) Agilent 高效液相色谱仪；b) 色谱柱：C 18柱，250mm ×4.6mm ，5μm ；c) 流动相：0.02mol/L 乙酸铵溶液+甲醇（90+10）； d) 流速：1mL/min ； e) 检测波长：230nm ； f) 进样量：20μL ； g) 柱温：25℃。
5.3 测定取处理液和混合标准使用液各20μL 注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中被测物质含量。
6 结果计算样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量按下式计算： X =式中：X ——样品中待测组分含量，g/kg ；c ×Vm ×1000c ——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，μg /mL ； V ——样品定容体积，mL ； m ——样品质量，g 。
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/，糖精钠的检测参照GB/T，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2样品前处理的注意事项GB/和GB/在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。
如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
具体操作步骤如下：取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L) ml，加入%亚铁氰化钾溶液，20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物,初滤液过μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL 测定。
用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。
3检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。
原因如下：液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的液相色谱法是一种常用的分析方法，由于其操作简便、分离效果好以及分析结果准确可靠而得到广泛应用。
下面将详细介绍该方法的原理、仪器设备、操作步骤以及常见问题及解决方法。
一、方法原理：该方法采用液相色谱法进行分析，根据待测样品中的目标化合物与色谱柱之间的相互作用来实现物质的分离和定量。
主要包括样品的预处理、色谱分离、定量检测和数据分析等步骤。
二、仪器设备：液相色谱仪是该方法的主要仪器设备，其中包括色谱柱、检测器和数据处理系统等，常用的色谱柱有C18反相色谱柱、正相色谱柱等。
常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器等。
三、操作步骤：1. 样品的预处理：将待测食品样品取适量加入提取溶剂中，超声或搅拌混合，静置一段时间使目标化合物溶解。
然后通过滤膜过滤，以获取纯净的样品溶液。
2. 色谱分离：将样品溶液注入色谱柱中，通过不同组分在色谱固定相和流动相之间的相互作用来实现分离。
可以调整流动相的组成和流速等条件来优化分离效果。
3. 定量检测：分离后的组分进入检测器，根据目标化合物的特性进行定量检测。
常用的方法是通过比较待测样品和已知浓度的标准溶液的峰面积或峰高来确定目标化合物的含量。
4. 数据处理：将检测到的信号转化为对应的色谱图，并通过计算机数据处理系统进行数据分析和结果计算。
四、常见问题及解决方法：1. 色谱柱选择：根据目标化合物的特性选择合适的色谱柱，如苯甲酸和山梨酸可以选择C18反相色谱柱，糖精钠可以选择离子交换色谱柱。
2. 流动相的选择：合理选择流动相的组成和流速，以实现目标化合物的高效分离。
这需要根据不同化合物的极性和溶解度等参数进行优化。
3. 检测器的选择：根据不同化合物的特性选择合适的检测器，如苯甲酸和山梨酸可以选择紫外检测器进行检测，糖精钠可以选择荧光检测器进行检测。
4. 样品的提取：提取过程要注意样品的充分溶解和提取溶剂的选择，以获得准确的分析结果。
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/，糖精钠的检测参照GB/T ，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2 样品前处理的注意事项GB/和GB/ 在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。
如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
具体操作步骤如下：取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L) ml，加入%亚铁氰化钾溶液， 20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。
用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。
3 检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。
高效液相色谱法测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠
将 上 述 混 合 标 准 溶 液 进 行 测 定，
根据待测物质峰面积和浓度关系绘图，
得到标准曲线回归方程。苯甲酸、山
梨酸和糖精钠在 0.2 ～ 200 mg/L 范围
内线性关系良好，苯甲酸在 0.25 mg/L
时，线性方式 y=31 991.7x，相关系数
r=0.999 7，检出限为 0.006 g/kg；山
1.2.1 配制混合标准溶液 精密称取苯甲酸、山梨酸和糖精钠 标准物质各 4.0 mL 于 20 mL 容量瓶中，
用水配制成 200 μg/mL 的标准混合储备 液，再用水稀释成 100 μg/mL、50 μg/ mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、2.5 μg/ mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL 的 系 列 标 准工作液，由低浓度到高浓度依次进样。
梨酸在 0.20 mg/L 时，线性方式 y=60
861.2x，相关系数 r=0.999 8，检出限
为 0.005 g/kg； 糖 精 钠 在 0.50 mg/L
时，线性方式 y=21521.4x，相关系数
r=0.999 7，检出限为 0.012 5 g/kg。
（下转 132 页）
123 Jan. 2019 CHINA FOOD SAFETY Copyright©博看网 . All Rights Reserved.
1.2.2 样品处理 称 取 2.0 g 果 酱 样 品 于 50 mL 比 色 管 中， 加 30 mL 水 和 0.5 mol/L 的 氢氧化钠溶液 1.0 mL，摇匀后置于超 声清洗器中提取 15 ～ 20 min，直至 被测组分完全溶解。然后再添加 0.42 mol/L 的硫酸锌溶液和 0.5 mol/L 的氢 氧化铵溶液各 1.5 mL，加水定容到 50 mL 后摇匀，静置，然后用双层滤纸过 滤上层清液，将最初过滤的 5 mL 液体 丢弃，并采用 0.45 μm 的滤膜对滤液 再次过滤，进样 5 μL 开展色谱分析。 如果液体样品不包含蛋白质，则不需 要蛋白质沉淀过程，直接取样后用水 定容，超声提取后过滤进样即可；如 果是固体样品，则需要将固体样品研 磨粉碎，然后进行样品处理 [2]。 1.2.3 检测 精确称取处理液和混合标准溶液 各 20 μL 放置于高效液相色谱仪中进 行分离，以标准溶液的固定峰值为依 据，根据峰面积计算样液中的被测物 质含量，计算公式为：，其中 X 表示 样 品 中 待 测 组 分 的 含 量， 单 位 为 g/ kg；C 表示由标准曲线得出的样液中 待测物质的量浓度，单位为 mg/mL， V 表示样品定容的体积，单位 mL；m 表示样品的质量，单位为 g。
高效液相色谱法测定食品中山梨酸
高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠样品前处理方法探讨高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的样品前处理方法。
方法不同样品用不同前处理方法，用二极管阵列管检测品(HPLC-DAD）分析测定，外标法定量。
结果该前处理方法线性关系良好，相对标准偏差分别为山梨酸3.18%、苯甲酸2.74%、糖精钠2.15%，加标回收率均在90%~100%之间。
结论该方法稳定性好、准确可靠、简单快速，适用于食品添加剂的测定。
高效液相色谱法可以同时测定山梨酸、苯甲酸、糖精钠，方便简单快捷。
各类食品的前处理方法方面虽然有了新规定，但是还不够便捷。
因此对部分不同种类的食品前处理方法进行摸索，主要改善是在各类样品处理之前加入适量氢氧化钠，在碱性条件下提取钾盐或者钠盐更为简单，其方法准确可靠，简便快速，便于推广。
并对南充市内3区的市场、超市中部分产品中防腐剂和糖精钠进行检测。
1 材料与方法1.1仪器与试剂1.1.1 仪器戴安U-3000高效液相色谱仪，水浴锅，超声清洗器。
1.1.2 试剂色谱纯甲醇；超纯水；分析纯正己烷；分析纯乙醚；分析纯乙酸铵；0.1mol/L氢氧化钠；10.6％亚铁氰化钾；22％乙酸锌；pH7.2磷酸盐缓冲溶液。
1.0 mg/m1山梨酸、苯甲酸、糖精钠标准溶液(国家标准物质中心)。
1.1.3 色谱条件色谱柱：Agela-Cl8柱(250 mm×4.6mm×5um)；柱温：30℃；紫外检测波长：230 nm；流动相：甲醇：0.02 mol/L乙酸铵(5:95)；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL 。
1.2 前处理方法汽水、果汁、风味饮料类液体样品取样10.0 g于50ml容量瓶中，加入20～30ml纯水后超声脱气10 min，用1+1氨水调pH=7，稀释至刻度，经0.45μm滤膜过滤后上机。
[1，2]配制酒、葡萄酒、果酒类称取10.00g样品，放入小烧杯中，水浴加热出去乙醇，用氨水（1+1）调pH约7，加水定容至50.0ml，经0.45μm滤膜过滤后上机。
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华_复习课程
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华_液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解-不能不看的精华_.txt16生活，就是面对现实微笑，就是越过障碍注视未来；生活，就是用心灵之剪，在人生之路上裁出叶绿的枝头；生活，就是面对困惑或黑暗时，灵魂深处燃起豆大却明亮且微笑的灯展。
17过去与未来，都离自己很遥远，关键是抓住现在，抓住当前。
液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解－不能不看的精华液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2003，糖精钠的检测参照GB/T 5009.28-2003，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2 样品前处理的注意事项GB/T5009.28-2003和GB/T5009.29-2003 在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/T5009.29-2003使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。
如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
国家预制菜中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准-概念解析以及定义
国家预制菜中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述国家预制菜是一种方便快捷的食品，广泛应用于各种场合，如家庭、餐厅和快餐店等。
然而，近年来，一些国家预制菜中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠等物质引起了人们的关注和担忧。
苯甲酸是一种常见的食品防腐剂，被广泛应用于食品加工过程中。
然而，长期摄入过多的苯甲酸可能对人体健康造成不良影响，如引发过敏反应、肠胃不适等。
山梨酸是一种常见的食品酸味剂，用于增加食品的口感和保鲜效果。
尽管山梨酸通常被认为是相对安全的食品添加剂，但其过量摄入可能导致胃肠道不适和口腔炎症等问题。
糖精钠是一种人工甜味剂，常用于无糖或低糖食品中。
然而，糖精钠的含量超过标准限制可能对肾脏和神经系统造成损害。
因此，制定国家预制菜中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准变得至关重要。
这些标准将确保国家预制菜的质量和安全性，减少对消费者健康的潜在风险。
此外，标准的制定还可以促进食品行业的合规性和规范化发展。
本文将详细介绍国家预制菜的定义和背景，以及苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准，目的在于提高人们对国家预制菜中这些物质的认识和理解，并为制定相关标准提供一些建议和改进措施。
通过建立科学合理的标准体系，我们可以确保国家预制菜的质量和安全，为消费者提供健康、安全的食品选择。
总之，国家预制菜中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的标准对于保障公众健康至关重要。
本文将深入探讨这些标准的重要性，并提出一些建议和改进措施，以期推动食品行业的可持续发展。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下结构进行阐述：首先，会对国家预制菜的定义和背景进行介绍，以便读者对该领域有一个全面的了解。
其次，会详细探讨国家对苯甲酸、山梨酸和糖精钠在预制菜中的标准制定情况，包括各项标准的依据、限定值以及相关的监测方法。
然后，会总结这些标准在国家预制菜行业中的重要性，并进一步提出对标准的建议和改进措施，以期达到更好的食品安全保障和质量控制。
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法是一种常用的分析方法。
本文将从原理、方法及操作步骤等方面进行详细解析。
首先，液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种基于物质在固定相和移动相的作用下，依据其在两相间分配不同的速度和平衡常数进行分离和测定的方法。
液相色谱法在分析食品中的添加剂，如苯甲酸、山梨酸和糖精钠等方面具有广泛应用。
其次，对于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定，可以通过液相色谱法进行定性和定量分析。
液相色谱法主要分为正相液相色谱法和反相液相色谱法。
正相液相色谱法使用非极性固定相，极性移动相；反相液相色谱法则相反。
由于苯甲酸为非极性物质，山梨酸为极性物质，糖精钠为离子物质，所以在测定食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠时，一般采用反相液相色谱法。
操作步骤如下：1. 准备样品：将待测食品样品称量并取样，可选择适当的提取方法进行提取。
一般采用乙酸乙酯等有机溶剂进行提取。
2. 进样操作：将提取的样品溶液通过滤膜滤过，除去悬浮物和杂质，得到清晰的样品溶液。
将溶液用微量注射器吸取一定体积后，注入进样器中。
3. 色谱条件设置：选择适当的色谱柱，一般使用反相色谱柱。
设置好流速、柱温和检测波长等参数。
常用的固定相可以是C18、C8等，移动相可以是甲醇和水的混合液。
4. 开始分析：通入移动相以开始分离分析过程。
根据样品中目标物的特性，优化流速、温度等参数，使其尽快分离并得到良好的色谱峰。
5. 数据处理：通过检测波长进行测定，根据标准曲线计算出样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量。
总结起来，食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法是一种快速、准确的分析方法。
通过选择适当的色谱柱和优化色谱条件，可以对食品中的目标物进行定性和定量分析。
这种方法在食品安全监测和质量控制中具有重要意义。
然而，需要注意的是，为了获得更准确的结果，实验人员还应定期校准仪器，制备标准品并建立标准曲线，以确保测定结果的准确性和可靠性。
食品中苯甲酸山梨酸和糖精钠的测定-标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。
本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。
第一法液相色谱法2原理样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1氨水（NH3•H2O）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3硫酸（H2SO4）。
3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。
3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。
3.1.6氯化钠（NaCl）。
3.1.7酒石酸（C4H6O6）。
3.1.8硅酮树脂。
3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。
3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.11中性氧化铝。
3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。
3.2 试剂配制3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。
3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。
3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。
3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
3.2.6 酒石酸溶液（15%）：称取15 g酒石酸，用水定容100 mL。
3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：分别称取16.72 g磷酸二氢钠和2.72 g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解
检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解(转自仪器信息网色谱论坛)
苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-1996，糖精钠的检测参照GB/T 5009.28-1996，即可开展实验。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。
笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。
2 样品前处理的注意事项
GB/T5009.28-1996和GB/T5009.29-1996 在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。
食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。
这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。
GB/T5009.29-1996使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。
如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。
具体操作步骤如下：
取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品5.0 克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1m ol/L)1.0 ml，加入9.5mL10%亚铁氰化钾溶液， 9.50mL 20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过0.45μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。
用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。
3 检测仪器的选择
虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。
原因如下：
3.1 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。
尤其对于高油脂样品（如月饼）若采用碱化－排油－酸化－提取－挥干－溶解等步骤，再上气相色谱仪检测，工作量大，试剂毒性也大，且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。
3.2 用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测，而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的检测。
3.3 液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏，可进行更低含量的检测。
如用二极管阵列检测器，还可辅助定性，这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。
4 选用气相色谱仪时的注意事项
GB/T5009.29-1996所用的气相色谱柱为 5％DEGS＋1％磷酸固定液的60－80目 Chromosorb W AW，。
这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点，但同时也有稳定时间较长的缺点。
该柱的适用的样品提取溶剂为石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，则溶剂峰拖尾效应较大，对山梨酸的测定有影响。
如用毛细管柱，能取得更好的峰形和灵敏度，但其稳定性及特异性不如填充柱。
一般可用非极性毛细管柱，0.530mm内径，10－15m长度。
色谱条件可能需用程序升温。
在气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸，后出苯甲酸。
糖精钠不能直接用气相色谱进行检测，必须衍生化后才能汽化进样。
5 选用液相色谱仪的注意事项
按照GB/T5009.29-1996，流动相应为5：95的甲醇：0.02M醋酸铵溶液，但是这个比例仅是个参考值，我们在工作中应根据实际情况进行调节。
为什么用甲醇溶液？甲醇有两个作用，（1）防腐，液相色谱柱最怕流动相长菌，尤其霉菌。
甲醇可使蛋白质变性，有杀菌作用。
（2）调节流动相极性，这是最重要的一点。
甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变，因此可以通过改变流动相中甲醇含量，以调节这几个组分的出峰和分离，以得到较理想的色谱图。
5：95是一个通用的比例，如减少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢，扩散效应增大，峰形较差，但这三组分的分离情况较好。
如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前，扩散效应较小，峰形尖锐，但这三组分的分离情况可能受影响，产生重叠。
在选择条件时，只能通过实验手段，如配制3：97，4：96，5：95，6：96，7：93的流动相，综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。
不同柱的最适比例不同，举例来说，色谱科公司的液相柱最适比例为4：96，而岛津公司液相柱的最佳比例为7：93。
就是同一根柱，一年前和一年后的极性也会有变化，需调节溶液配比。
为什么使用0.02M醋酸铵溶液？加入醋酸铵是为了调节离子强度，使待测物的峰形不致于变坏。
如果单独检测苯甲酸和糖精钠，加不加醋酸铵没有什么关系，都可以得到较好的峰形；但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵，否则得不到一个完整的色谱峰，峰形呈破裂状。
醋酸铵溶液浓度不需严格控制，0.01M、0.02M、0.04M均可。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。
在流动相5：95及以下比例时，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠（注意一下气相的出峰次序），逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前，而糖精钠是出峰时间迅速提前，随着甲醇比例的逐步增大（15％－30％），原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠，并位于最前面，其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。
再提高甲醇浓度，次序不变。
用高甲醇比例条件（甲醇15％以上）做出的三种标准物质色谱图峰形较好，出峰时间也较快，但做实际样品时干扰较大；因此建议尽量使用低甲醇比例条件（甲醇5％左右）。
6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断
苯甲酸、山梨酸超标的样品较多，由于它们往往牵涉到一批货物是否合格，因此责任重大。
由于该方法定量较准确，因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。
如同时有气相色谱仪和液相色谱仪，建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照，如定量结果差不多，即可确认。
如只有气相色谱仪，应利用其在填充柱保留时间稳定的特性，同时进五针标准液和五针样品液（注：峰面积应差不多，否则需对一方按比例稀释），如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒，可认为不是。
（如进针的技术不过关，请不要做此实验）
如用液相色谱仪，当检测器为二极管阵列检测器时，根据保留时间和紫外吸收图结合定性，当只有紫外检测器时，改检测波长为220nm，230nm，250nm，重复进标准和样品液，由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。
如有微生物检测手段，可加样品于有菌培养基中，观察有无抑菌现象，如无抑菌现象则无防腐剂。
不是很推荐用双柱法，因为有时柱极性相差不大，反而会影响最终判断。
7 糖精钠超标时的判断
当检测糖精钠超标时，除了采用二极管阵列检测器或波长验证，还可以利用糖精钠的荧光特性，用荧光检测器进行验证。
荧光条件是激发波长为277nm，荧光波长为410nm。
只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多，才可以判断为是。
还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法，即感官法。
糖精钠是一种甜味剂，用舌头可以感觉到它的甜味，如果含量超标，一定能尝出来。
8 标准溶液的配制贮存问题
苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体，一般几个月后会严重降解，。
如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层，可保持稳定一两年。
因此推荐用甲醇作溶剂。
在配制标准溶液时，初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠，用水溶解苯甲酸，晃了半天才发现怎么也不没溶解。
应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾，用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。
9 苯甲酸、山梨酸的应用范围
首先应注意到，并不是所有食品都需要加入防腐剂，只有那些富含营养物质，且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要，否则对厂家来说会增加不必要的成本。
酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完，月饼等需在货架上摆放，如不加防腐剂很快会发霉变质，有添加防腐剂的必要。
而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕，即在细菌大量繁殖前己被消化了，因而没有添加的必要。
苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。
如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度，有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的，而不是厂家出于防腐目的加入的。
苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。
并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山梨酸，有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂，或自行规定需冷藏（如某些月饼）。
因此有些食品检测不出也属正常。