流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理

流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型 散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC)； 侧向散射光(side scatter, SSC)。
Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方 式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分 析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈 橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上 的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA 定量染料。
标记抗体的荧光素
激发光波长 （nm）
490
发射光波长 （nm）
520
488
575
490
675
650
660
496/546
670
496/546
767
495
519
650
665
中文名
异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 多甲藻叶绿素蛋白 别藻青蛋白 藻红蛋白-花青素5 藻红蛋白-花青素7
核酸荧光染料
PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用 于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不 能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
4、 流式图和流式结果
流式数据的存储：列表模式（list mode），记录了每个细 胞的所有参数的信息。
Event # FSC
SSC
FL1பைடு நூலகம்FITC
FL2 PE
FL3 APC
1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 700 6
3
90 480 720 670 10
4
95 490 15 720 15
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
550-584nm：黄色荧光（Yellow）； 585-615nm：橙色荧光（Orange）；
616-700nm：红色荧光（Red）；
≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。
荧光素分子
FITC PE PerCP APC PE-Cy5 PE-Cy7 Alexa Flour 488 Alexa Flour 647
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
散点图(Dot Plot) 伪彩图(Pseudo-color Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图(Density Plot) 假三维图(Pseudo 3D Plot)
• 三维图(3D Plot)
直方图 Histogram
细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号 或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细 胞数。
死细胞 或碎片
粘连 细胞
死细胞
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图
阈值：Threshold/Trigger
阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必 须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。
FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
FL1
FL2
散点图和伪彩图
等高图和密度图
等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里 面的曲线代表细胞数目越多。
……
每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为 5×10000（字或双字）。
流式数据的显示方式
• 常用分析软件
– MACSQuantify – CellQuest – Diva – FlowJo – WinMDI – FCS Express
• 单参数直方图(Histogram) • 双参数数据显示：
Counts
Event #
FL1 FITC
1
10
2 700
3 720
4
15
……
0…………10…………100…………1000 FITC荧光强度
直方图 Histogram
横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。
DNA倍体分析
抗原表达分析
Overlay图
散点图 Dot Plot
散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参 数，优点是比直方图直观。
荧光信号
自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）； 特异荧光：荧光素分子发出的的荧
光比自发荧光强很多倍。
前向散射光FSC
激光器正前方1 -6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射 光，FSC强度是d/λ的函数( λ表示波长，d指细胞大小)， 所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。
侧向散射光SSC
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光： 荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态， 再回到低能态时释放出的光。
＜ 激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
500-549nm：绿色荧光（Green）；