睡眠剥夺对大鼠免疫功能的影响

subtotal nephroectom y .Rats wer e randomized as three gr oups :Sham group ,chronic renal failure (CRF )group and treat -ment group .1,25(OH )2D 3was administrated by i .p .injection of 25pmol calcitriol once daily for ten days .After 31days ,ordinary parameters were measured ,and the expression of PCaR mRNA in all groups was investigated by semi -quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT -PCR ).(1)The concentrations of serum creatinine (SCr ),PTH in CRF group were significantly higher than those in sha m gr oup (69.30±11.20vs 21.15±8.20μmol L ,P <0.05;256±72vs 41±7pg mL ,P <0.05),PTH levels in treatment group were significantly lower than that in CRF group (112±47vs 256±72pg mL ,P <0.05).(2)There was no difference in levels of PCaR mR NA between CRF group and sham group (1.100±0.153vs 1.074±0.119),and so did it between CRF group and treatment group (1.131±0.108vs 1.074±0.119).In this model ,2°HPT developed without change of expression of PCa mR NA .The treat -ment of 1,25(OH )2D 3in the 2°HPT induced by subtotal nephroectom y had no effect on the expression of PCaR mRNA .
Key words :
chronic renal failure ;parathyroid gland calciu m -sensing receptor ;secondary hyperparathyroidism 收稿日期:2000-11-06　修回日期:2001-04-25
文章编号:1001-6325(2001)05-0451-02
睡眠剥夺对大鼠免疫功能的影响
袁义强,乔　鹏,章　茜,王书春,张　朝,王雨若
(河南医科大学生理教研室,河南郑州450052)
中图分类号:
Q428;R392 文献标识码:A 已有实验证明,睡眠剥夺或缺失可降低机体的防御能力。

Brown [1]曾发现睡眠剥夺能使小鼠对流感病毒的抵抗力减弱,IL -1或胞壁肽可对抗这一改变。

相继的研究显示白细胞介素与肿瘤坏死因子等细胞因子可不同程度地促进睡眠[2]。

睡眠是否与免疫有关,本文拟通过对睡眠剥夺大鼠T 细胞和B 细胞增殖反应的变化,来探讨睡眠对免疫功能的影响。

1　材料与方法
1.1　主要仪器及药品:刀豆蛋白A (Con A ),北京中山生物公
司;脂多糖(LPS ),Sigma 产品;四甲基偶氮唑盐(MTT ),瑞士FLUKA 产品;十二烷基硫酸钠(SDS ),日本产品;二甲基甲酰胺(DMF ),上海试剂一厂;绵羊红细胞(SRB C )及豚鼠血清,由河南医科大学实验动物中心提供。

酶联免疫检测仪,DG -3022型,华东电子管厂。

1.2　动物及分组:雄性SD 大鼠(河南医科大学实验动物中心提供)94只,体重200～263g 。

实验分2部分:部分睡眠剥夺和持续性睡眠剥夺。

每部分实验又分2阶段进行。

部分睡眠剥夺的第一阶段(观察脾细胞增殖反应及脾细胞分泌抗体功能)用鼠22只,分成2组,即实验组与对照组,每组11
只;第二阶段(观察迟发型超敏反应和免疫器官的变化)动物22只亦分为实验组和对照组,各11只。

持续睡眠剥夺的观察指标同上,第一阶段用鼠26只,实验组及对照组各13只;第二阶段24只,实验组与对照组各12只。

1.3　动物模型的建立:参照Rechtschaffen 睡眠剥夺法加以改良。

持续睡眠剥夺为剥夺24h 睡眠,连续4d 。

部分睡眠剥夺为剥夺12h 睡眠,连续4d 。

1.4　Con A 诱导脾细胞增殖反应[3]:用20%SRBC 致敏实验组和对照组大鼠,继之对实验组大鼠剥夺睡眠,4d 后将两组动物同时处死,无菌操作快速取出脾脏,制备脾细胞悬液,细胞密度为
2.5×106cell mL 。

96孔培养板每孔加细胞悬液0.1mL ,并加10mg L Con A 0.1mL 。

37℃,5%CO 2培养箱中孵育66h 后,取出培养板,加5g L 的MTT 溶液10μL ,继续培养4h 后再次取出,从每孔中吸掉上清液0.1mL ,另加入0.1mL 的20%SDS ～50%D MF ,充分振动30min ,最后用酶联免疫检测仪测定其OD 值,检测波长570nm ,参考波长630nm ,以检测波长测出的OD 值减去参考波长测出的OD 值,这个OD 的差值来反应细胞的活性及其增殖能力。

1.5　LPS 诱导脾细胞增殖反应[3]:按上述方法制备脾细胞悬
液,细胞浓度同上。

在96孔培养板中加入0.1mL细胞悬液及0.1mL LPS(20mg L),置37℃,5%C O2培养箱中培养72h,酶联免疫检测仪测定其OD值(方法同上)。

1.6　脾细胞抗体分泌功能观察[3]:脾细胞悬液制备同4。

将脾细胞释稀成1.0×107cell mL。

取1mL,加20%SRBC0.1mL、PBS0.9mL、1:10补体1mL,混匀,37℃水浴1h,离心(3000r min)。

721分光光度计,波长413nm,测OD值反映上清液中红细胞释放的Hb量。

1.7　免疫器官的形态观察:睡眠剥夺4d后,将实验和对照鼠同时处死,迅速取出脾和胸腺,分别称重。

以脾脏或胸腺重量(mg100gB W)分别表示脾脏和胸腺的大小。

取上述脾和胸腺一部分,10%甲醛溶液固定48h,乙醇逐级脱水,石蜡包埋,切片,HE染色。

1.8　统计学处理:全部数据以x—±s表示,组间差异性比较采用t检验。

2　结果与讨论
2.1　睡眠剥夺对脾细胞免疫功能的影响:睡眠剥夺大鼠精神萎靡、虚弱、消瘦、皮毛无光泽。

表1示部分睡眠剥夺4d: LPS诱导的脾细胞增殖反应降低,OD值下降38.3%(P< 0.05);Con A诱导的脾细胞增殖反应亦有降低趋势,OD值降低16.9%,但与对照组相比差异无显著性;脾细胞分泌抗体的功能明显降低,其OD值降低约55.6%(P<0.001)。

表1　部分睡眠剥夺对脾细胞功能的影响
Table1　Effect of partial sleep deprivation
on spleen cell function(x—±s,n=22)
Con A-induced proliferation L PS-induced
proliferation
antibody s ecretion
Control group0.69±0.260.69±0.171.42±0.63 Test group0.57±0.250.43±0.26＊0.63±0.34＊＊ ＊P<0.05;＊＊P<0.001vs control group
表2　持续睡眠剥夺对脾细胞功能的影响
Table2　Effect of sustained sleep deprivation
on spleen cell function(x—±s,n=24)
Con A-induced
proliferation
L PS-induced
proliferation
antibody s ecretion Control group0.54±0.110.53±0.110.68±0.08
Test group0.40±0.10＊0.41±0.11＊＊0.27±0.16＊＊ ＊P<0.01;＊＊P<0.001vs control group
表2示持续睡眠剥夺4d:Con A及LPS诱导的脾细胞增殖反应明显降低,其OD值分别下降25.7%及23.2%,各组间差异有显著性,均P<0.01。

脾细胞产生抗体的量明显减少,其OD值下降59.8%,实验组与对照组相比P<0.001。

2.2　睡眠剥夺对免疫器官的影响:部分睡眠剥夺使大鼠胸腺重量和脾重量分别减低了52.5%和14%,由对照组的134.63±47.68和307.04±65.19下降为63.96±24.88和264.05±82.32,分别P<0.001和P>0.05。

持续睡眠剥夺可见胸腺和脾脏明显缩小,胸腺重量和脾重量分别从100.89±28.99和299.28±34.06下降为61.20±7.67和233.79±30.22,分别降低了39.4%、21.9%,均P<0.001。

胸腺和脾脏组织学未见明显变化。

参考文献:
[1]Brown R,Husband AJ,Pang G,et al.Suppress ion of immunity
to influenza virus infection in the respiratory tract following sleep deprivation[J].Reg Immunol1989,2:321-325.
[2]Lancel M,Mathias S,Faulhaber J,et al.Effect of interleukin-1
beta on EEG power density during sleep depends on circadian phase[J].Am J Physiol,1996,270:R830-910.
[3]郑永唐,彭昆龙.测定细胞存活和增殖的MTT方法的建
立[J].免疫学杂志,1992,8:95-97.。