原位杂交原理及具体操作
原位杂交技术原理及其应用
原位杂交技术原理及其应用原位杂交是一种分子生物学技术，可以用来检测DNA或RNA序列在细胞或组织中的位置和表达情况。
它的原理是利用一段带有特定标记的DNA或RNA探针与靶标序列结合形成稳定的双链结构，从而可以通过可视化或其他手段来观察探针与靶标的结合情况。
1.样品的制备：收集细胞或组织样品，并进行适当的处理，例如固定、裂解或切片等。
2.探针标记：选择适当的DNA或RNA序列作为探针，并将其标记为可检测的分子，例如荧光染料、放射性同位素或酶等。
3.杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA靶标进行杂交，通过提供适当的温度和盐浓度等条件来促进结合。
4.洗脱：去除未结合的探针，并进行适当的洗脱步骤，以减少非特异性结合。
5.可视化：通过荧光显微镜、放射自显影或酶促成色等方法来观察探针与靶标的结合情况。
1.基因表达和定位：原位杂交可以用来检测特定基因在细胞或组织中的表达情况和位置。
通过使用标记的探针，可以确定基因在染色体上的位置，并了解其表达的细胞类型和数量。
2.染色体异常和重排：原位杂交可以用来研究染色体异常和重排，例如倒位、易位和染色单体等。
通过使用标记的探针，可以检测染色体上的特定序列，并观察异常的染色带和断裂点。
3.病毒和微生物检测：原位杂交可以用于检测病毒和微生物的存在和定位。
通过使用与病毒或微生物特定序列匹配的探针，可以确定它们在感染组织中的位置或数量。
4.基因组分析：原位杂交可以用于研究基因组的结构和功能。
通过探针的杂交，可以确定特定基因在基因组序列中的位置和分布情况，从而揭示基因重复和重组等生物学过程。
总的来说，原位杂交技术是一种强大的分子生物学工具，可以在细胞和组织水平上研究DNA和RNA的分子特性。
它在基因表达、染色体结构、病毒感染和基因组分析等方面具有广泛的应用潜力，对于理解生命过程和疾病机制有重要的意义。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士原位杂交技术是一种重要的遗传学技术，用于研究基因组的结构、组织和表达。
它可以帮助科学家确定特定基因在染色体上的位置，探索基因在细胞和组织中的活性等信息。
本文将详细介绍原位杂交技术的操作步骤，并分享一些实验中常见的小贴士。
原位杂交的基本原理是将一段与所研究基因序列互补的DNA探针标记上荧光分子等信号物质，然后与待测细胞或组织样品进行杂交反应。
通过观察探针与靶DNA的结合情况，可以确定所研究基因在染色体的位置和组织中的表达情况。
下面是一般的原位杂交实验步骤：1.样品处理：首先，需要准备待测细胞或组织样品。
可以选择直接从动植物或细菌中提取DNA，或采用组织切片的方式。
样品处理的目的是提高探针与靶DNA的结合效率。
2.探针的制备：制备一段与所研究基因互补的DNA探针。
可以通过PCR扩增、化学合成或转录反应等方法制备探针。
为了方便后续观察，可以将探针标记上荧光物质如荧光染料、辣椒素或金纳米颗粒等。
3.免疫组化：为了提高探针与样品中的靶DNA的杂交效率，可以进行免疫组化步骤。
这一步主要是使用特定抗体识别并结合待测物质，如甲醛固定、蛋白酶K处理等。
4.模板DNA的制备：将样品中的DNA固定在载玻片上，通常使用甲基化醛或戊二醛确定DNA在载玻片上的位置。
5.杂交反应：将制备好的探针与固定在载玻片上的DNA进行杂交反应。
这一步通常需要对探针和靶DNA进行变性和再结合等步骤。
6.信号检测：通过显微镜观察杂交产物，在适当的波长下观察荧光信号。
可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备。
接下来，我们来分享一些原位杂交技术的小贴士：1.设计合适的探针：选择合适的探针非常重要。
探针的长度应该足够长，以确保与靶DNA的特异性结合。
此外，为了提高信号强度，可以选择多个标记物如荧光染料标记在同一个探针上。
2.优化杂交条件：杂交时间和温度是影响杂交效率的重要因素。
可以通过调整这些条件来提高杂交效果。
此外，添加高浓度的盐类和保护剂可以提高杂交的特异性和效率。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
简述原位杂交的原理及应用
简述原位杂交的原理及应用1. 原位杂交的原理原位杂交是一种基因组杂交技术，它可以用来研究基因组的组成、结构和功能。
原位杂交的原理是通过将一组标记有探针的DNA片段与目标DNA样品进行杂交反应，然后使用适当的探针检测方法来识别和定位目标DNA序列。
原位杂交的基本原理包括以下几个步骤：1.DNA探针制备：3’-OH末端标记方法和末端标记方法是两种常用的DNA探针标记方法。
常用的标记有生物素、荧光物质等。
2.DNA杂交反应：将标记好的DNA探针与目标DNA样品进行杂交反应。
杂交反应的温度、时间以及混合物的浓度需要根据具体实验目的进行优化。
3.杂交后的探针检测：可以使用放射性同位素标记、荧光染料标记等方法对杂交后的DNA探针进行检测，以确定杂交反应是否成功。
4.观察和分析：通过显微镜等工具观察杂交结果，并对杂交位点进行定位和分析，获取目标DNA序列的位置和数量。
2. 原位杂交的应用2.1. 基因组结构研究原位杂交技术可以用来研究基因组的结构，包括基因的数量、排列、序列和重组等信息。
通过特定的探针标记和杂交反应，可以对基因组进行定位和分析，帮助了解基因组的组成和结构。
2.2. 染色体显带分析原位杂交被广泛应用于染色体显带分析领域。
通过核酸探针的杂交，可以识别和鉴定染色体上的特定DNA序列，从而确定染色体的结构和功能。
这对于检测染色体异常和疾病的相关基因有着重要意义。
2.3. 基因定位和图谱构建原位杂交可用于基因定位和构建基因图谱。
通过使用特定的探针标记和杂交方法，可以将目标基因定位到染色体上的特定区域，并确定其在染色体上的位置。
这为进一步研究基因的功能和相互作用提供了基础。
2.4. 个体识别和物种鉴定原位杂交技术可用于个体识别和物种鉴定。
通过探针的杂交反应，可以确定个体或物种特定基因的存在与否，从而进行个体识别和物种鉴定的工作。
2.5. 植物杂交育种原位杂交可以应用于植物杂交育种领域。
通过对目标植物基因组的杂交分析，可以鉴定合适的亲本植物并进行精确的杂交操作。
原位杂交的原理及应用
原位杂交的原理及应用
原位杂交是分子生物学领域中的一种技术，主要用于检测和定位特定DNA或RNA序列的存在和位置。
这种技术通常使用放射性或非放射性标记的探针来与特定的DNA或RNA序列进行杂交。
原理：原位杂交的基本原理是利用互补配对的原则，将标记探针与被检测的DNA 或RNA样本的靶分子进行杂交反应。
这种技术通常利用一些特定的标记，如放射性同位素或非放射性荧光染料，来标记探针，使其可以在杂交后被检测到。
应用：原位杂交广泛应用于分子生物学和医学领域。
以下是一些具体的应用：
1、检测基因突变。
原位杂交可以检测基因突变或缺失，从而确定某些病理状态的原因。
比如，原位杂交技术可以用于检测肿瘤细胞中激活的癌基因或缺失的肿瘤抑制基因，帮助医生诊断和治疗肿瘤。
2、检测病毒感染。
原位杂交技术可用于检测病毒感染。
例如，在临床诊断中，原位杂交技术可以用于检测人乳头瘤病毒（HPV）感染，从而帮助预防宫颈癌的发生。
3、研究分子发育和进化。
原位杂交也可用于研究分子进化和发育。
例如，在分子系统学领域，原位杂交技术可以用来确定不同物种之间的亲缘关系，并研究其进化历史。
4、研究基因表达模式。
原位杂交还可用于研究基因表达模式，了解基因在生物体中如何发挥作用。
例如，在神经科学领域，原位杂交技术可用于研究神经元中活性基因的表达模式。
总之，原位杂交技术是一种重要的检测和研究分子生物学的方法，具有广泛的应用前景。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于检测和定位特定的DNA或RNA序列在细胞或组织中的存在和表达。
它通过将标记有特定标记物的探针与待检测的样品进行杂交反应，然后利用显微镜观察探针的位置和数量来确定目标序列的存在和表达水平。
原位杂交技术主要利用探针与目标序列间的互补配对来实现检测和定位，具有高灵敏度、高特异性和显微分辨率较高的优点，因此在生命科学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
1.制备探针：探针是一段具有目标序列的DNA或RNA，通常通过聚合酶链式反应（PCR）或转录反应合成。
探针可以标记上荧光染料、放射性同位素或酶等标记物，用于在杂交反应后的检测。
2.样品制备：待检测的细胞或组织样品需要进行预处理，包括固定、脱水、解冻等步骤。
固定样品有利于保持细胞和组织的形态结构，使得探针能够与目标序列发生杂交。
3.杂交反应：将探针与样品进行杂交反应。
反应条件和时间需要根据探针的特性和样品的要求进行优化，包括温度、盐浓度等因素。
4.洗涤：在反应后，需要对样品进行洗涤来去除未杂交的或杂交不牢固的探针，以减少背景信号。
洗涤的条件需要严格控制，以保证背景信号的最小化。
5.检测和观察：使用适当的检测方法，如荧光显微镜、原子力显微镜等，来观察和记录探针的位置和数量。
原位杂交技术的应用广泛，主要包括以下几个方面：1.基因表达：原位杂交可以定位和观察特定基因的表达模式和水平。
通过检测RNA在组织或细胞中的存在和定位，可以研究基因的表达调控机制，揭示转录因子机制、信号通路等重要过程。
2.染色体定位：原位杂交可以在染色体水平上定位特定序列。
通过探针与染色体特定区域的杂交，可以确定染色体的结构和功能，并研究染色体异常与疾病的关系。
3.突变检测：原位杂交可以检测和定位基因突变或基因缺失。
通过使用特异性探针，可以检测DNA序列的缺失、插入或突变，从而提供有关遗传疾病的诊断和研究。
原位杂交的原理和应用
原位杂交的原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织中检测特定的核酸序列。
它的原理是通过标记的探针与待检测样品中的靶序列发生互补配对，然后通过适当的方法进行可视化。
原位杂交技术广泛应用于基因表达定位、染色体结构与功能研究、细胞分化和发育过程等领域。
1. 探针的选择：根据待检测的靶序列，可以设计相应的DNA或RNA 探针。
DNA探针一般选择长度为100-1000bp的片段，而RNA探针则通常为全长或部分序列。
探针可通过放射性标记或非放射性标记进行标记。
2.可视化标记：常用的标记技术有放射性标记（如32P或35S）和非放射性标记（如荧光染料、酶标记或生物素-亲和素标记）。
不同的标记方式适用于不同的应用领域。
3.杂交条件：为了使探针与靶序列完全匹配，必须优化杂交条件，包括温度、盐浓度、杂交液成分和时间等。
适当的杂交条件可以提高探针与靶序列的互补配对效率。
4.可视化和检测：杂交后，可以根据探针的标记方式选择不同的可视化方法。
放射性标记的探针可以通过暗室放射自显影或闪烁计数等方法进行检测，而非放射性标记的探针则需要使用适当的染色剂或显微镜观察。
1.基因表达定位：通过原位杂交技术，可以在组织或细胞水平上确定特定基因的表达位置。
这对于研究细胞分化、发育和疾病机理等方面具有重要意义。
例如，在肿瘤组织中，可以使用特定的探针定位癌基因的表达位置，从而帮助了解癌症的发生和发展过程。
2.核型分析：原位杂交可以用于染色体结构与功能的研究。
通过将特定探针与染色体的特定区域进行杂交，可以准确地确定染色体的位置和结构，进而了解染色体的功能和相关疾病。
3.细胞分化与发育研究：原位杂交可以用于研究细胞分化和发育过程中的基因表达变化。
通过将探针与分化或发育相关的基因进行杂交，可以确定这些基因在特定阶段的表达模式，从而揭示细胞分化和发育的机制。
4.检测病毒或微生物感染：原位杂交可以被用来检测病毒或其他微生物在细胞或组织中的感染。
rna原位杂交的原理及应用
RNA原位杂交的原理及应用概述RNA原位杂交（RNA in situ Hybridization）是一种常用的生物学技术，用于研究细胞和组织中特定RNA序列的存在和分布情况。
该技术通过将标记有合适探针的RNA与待检测样品中的互补RNA序列进行杂交，并利用探针的标记信号进行可视化，从而实现对特定RNA的检测和定位。
原理RNA原位杂交技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1. 制备探针首先，需要制备用于杂交的RNA探针。
探针可以通过合成DNA或RNA，然后标记上荧光染料、辣根过氧化物酶（HRP）等信号源。
这些标记物的选择要根据具体实验需求和信号检测方法来确定。
2. 样品固定待检测的细胞或组织样品需要进行固定处理，以保持其形态和RNA分子的空间分布。
通常使用化学固定剂（如乙醛、甲醛）对样品进行固定。
3. 样品预处理为了提高杂交效率和信号强度，样品需要进行一定的预处理。
通常包括脱水、脱脂、蛋白酶消化等步骤，以去除样品中的干扰物质，提高标记物与目标RNA的结合。
4. 杂交将步骤1中标记的RNA探针与样品中的互补RNA序列进行杂交。
通常杂交反应在适当的温度下进行，可以使用特定的杂交缓冲液来提供合适的反应条件。
5. 信号检测与可视化通过标记物的信号来检测并可视化目标RNA的存在位置和数量。
常用的信号检测方法包括荧光显微镜观察、酶标法等。
对于荧光显微镜观察，可以利用荧光染料的特异性标记来检测目标RNA的存在。
应用RNA原位杂交技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下列举几个主要应用领域：1. 基因表达和调控研究通过RNA原位杂交可以定位和检测特定基因在不同组织和器官中的表达情况，从而了解基因的空间和时间表达模式，探究基因调控机制。
2. 肿瘤研究RNA原位杂交可用于对肿瘤标志物基因的检测，帮助早期诊断和预测肿瘤发展的趋势。
此外，RNA原位杂交技术还可用于研究肿瘤相关基因的表达和定位。
3. 发育生物学研究通过RNA原位杂交可以跟踪特定基因在胚胎发育过程中的表达及细胞定位，揭示基因在发育和器官形成中的作用机制。
原位杂交原理和应用
原位杂交原理和应用原位杂交（in situ hybridization）是一种用于研究生物体（如细胞或组织）中特定核酸序列的定位和检测的技术。
它利用了DNA和RNA分子的互补性，使我们能够确定这些分子在细胞中的位置和表达情况。
原位杂交在遗传学、分子生物学和医学研究中有着广泛的应用。
原位杂交的原理可以简要概括为以下几个步骤：1. 表征目标序列：首先，需要确定要检测的目标DNA或RNA序列的特定片段。
这一步可以通过已知序列的引物（probe）引导进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，或通过分子克隆等技术获得目标序列的标记。
2.杂交：目标序列的标记探针与待检测的样本的DNA或RNA进行杂交。
标记探针通常通过标记物（如荧光染料或放射性同位素）标记，以便于检测。
3.条件选择：杂交后，需要通过选择性条件，将未杂交的探针从样本中去除。
这个步骤可以通过洗涤样本，以去除杂交失败的探针。
4.可视化：通过适当的检测方法，可以观察到成功杂交的探针。
这可以通过显微镜观察样本，或通过特定仪器检测标记物的信号来实现。
原位杂交技术有着广泛的应用，在遗传学、分子生物学和医学研究中发挥着重要的作用。
以下是一些原位杂交技术的应用：1.基因定位和映射：原位杂交可以帮助研究人员定位和映射特定的基因序列。
通过将标记探针与目标基因的DNA序列杂交，可以确定该基因在染色体上的具体位置。
2.基因表达分析：原位杂交可以用于研究基因在细胞或组织中的表达情况。
通过将标记探针与目标基因的RNA序列杂交，可以观察到基因在细胞中的表达水平和模式。
3.癌症诊断：原位杂交技术在癌症诊断中有着重要的应用。
通过检测癌细胞中特定基因的表达情况，可以确定肿瘤的类型和严重程度，并帮助制定相应的治疗方案。
4.病毒检测：原位杂交也可以用于病毒的检测和诊断。
通过检测感染细胞中病毒基因组的特定序列，可以确定病毒是否存在以及感染的程度。
5.基因组分析：原位杂交可以帮助研究人员对整个基因组进行分析。
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比
荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。
本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。
一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。
该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。
（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。
（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。
2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。
（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。
（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。
（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。
3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。
（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。
（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。
而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。
（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。
二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。
具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。
（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。
（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。
（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。
（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。
（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。
原位杂交介绍与步骤
原位杂交介绍与步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。
2. 固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测。
FISH的实验流程主要包括以下步骤：
1. 探针标记：将荧光素直接或间接标记到探针DNA上。
2. 变性：将探针DNA和染色体或细胞核靶DNA分别变性成单链。
3. 杂交：将变性后的探针DNA与变性后的染色体或细胞核靶DNA按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸。
4. 观察记录：在荧光显微镜下观察并记录结果。
荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交技术的原理及应用
原位杂交技术的原理及应用1. 原位杂交技术的概述原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要工具。
它基于两个主要原理：互补配对和探针标记。
通过互补配对，可以使DNA探针与目标DNA的特定序列发生结合。
探针通常被标记为荧光染料或放射性同位素，以便检测和定位。
2. 原位杂交技术的工作原理原位杂交技术的工作原理可以分为以下几个步骤：2.1 产生探针首先，需要产生特定序列的DNA探针。
这可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和合成等方法来实现。
探针的选择应根据研究需求和目标DNA的序列来确定。
2.2 标记探针为了使探针可视化和定位，需要对其进行标记。
常用的标记方法包括荧光标记和放射性同位素标记。
荧光标记通过使用特定的荧光染料，使探针在显微镜下可见。
放射性同位素标记则通过使用放射性同位素来标记探针，然后通过放射性计数器来检测和定位。
2.3 杂交反应将探针与目标DNA进行杂交，使它们发生互补配对。
杂交条件的选择取决于目标DNA的性质和探针的序列。
通常，在一定温度和盐浓度下，探针与目标DNA可以形成稳定的双链结构。
2.4 洗涤和检测完成杂交后，需要将非特异性的探针从样品中洗涤掉，以减少干扰和背景信号。
然后，使用显微镜观察或放射性计数器检测探针的信号。
荧光标记的探针可以通过荧光显微镜观察到特定位置的信号强度和分布情况，而放射性同位素标记的探针可以通过放射性计数器测量到辐射信号的强度。
3. 原位杂交技术的应用原位杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：3.1 基因定位和染色体映射原位杂交技术可以用于确定基因在染色体上的位置并进行染色体映射。
通过将特定序列的探针与目标DNA进行杂交，可以确定基因在染色体上的位置和分布。
这对于基因组研究、疾病基因的定位以及基因组结构和功能的理解都具有重要意义。
3.2 突变检测和基因表达分析原位杂交技术可以用于检测基因突变并分析基因的表达模式。
通过使用特定的突变探针或转录探针，可以检测到特定基因的突变或表达模式。
原位杂交原理
原位杂交原理原位杂交是一种重要的分子生物学技术，它被广泛应用于基因定位、基因表达和基因功能研究等领域。
原位杂交的原理是利用DNA或RNA探针与靶标分子特异性结合的特性，通过显微镜观察探针与靶标分子的位置关系，从而揭示目标分子在细胞或组织中的位置和数量。
下面将介绍原位杂交的原理及其在生物学研究中的应用。
首先，原位杂交的关键步骤是探针的制备。
探针是一段具有特异性的DNA或RNA序列，可以与靶标DNA或RNA结合。
在原位杂交实验中，通常需要标记探针，常用的标记方法包括放射性同位素标记、荧光标记和酶标记等。
标记后的探针可以用于检测靶标分子在细胞或组织中的位置和数量。
其次，原位杂交的实验步骤包括样本制备、探针杂交、洗脱和检测等。
在样本制备过程中，需要将细胞或组织固定在载玻片上，并进行脱水和脱脂处理。
然后，将标记后的探针加入到样品中，探针与靶标分子结合后，通过洗脱去除未结合的探针。
最后，利用显微镜观察探针与靶标分子的位置关系，从而获得靶标分子在细胞或组织中的分布情况。
原位杂交技术在生物学研究中有着广泛的应用。
首先，原位杂交可以用于基因定位。
通过将特定的探针与目标基因结合，可以确定基因在染色体上的位置，从而帮助研究人员理解基因组的结构和功能。
其次，原位杂交也可以用于研究基因表达。
通过检测靶标RNA在组织中的分布情况，可以揭示基因在不同组织或不同发育阶段的表达模式。
此外，原位杂交还可以用于病理学研究，帮助医学工作者诊断疾病和判断治疗效果。
总之，原位杂交是一种重要的分子生物学技术，它通过探针与靶标分子的特异性结合，揭示了靶标分子在细胞或组织中的位置和数量。
原位杂交在基因定位、基因表达和病理学研究等领域有着广泛的应用前景，为生物学研究提供了重要的技术手段。
随着技术的不断进步，相信原位杂交技术将在生物学研究中发挥越来越重要的作用。
原位杂交原理
原位杂交原理原位杂交是一种重要的分子生物学技术，它可以用来检测细胞或组织中特定的DNA序列的存在和位置。
原位杂交的原理是利用DNA的亲和性，使标记了特定DNA序列的探针与待检测的DNA序列结合，然后通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
首先，进行原位杂交实验需要准备探针。
探针是一段标记了荧光物质或放射性同位素的DNA或RNA序列，它能与待检测的DNA序列特异性结合。
一般来说，探针的选择要根据待检测的DNA序列的特点来确定，可以是全基因组DNA、特定基因的DNA序列或者RNA序列。
其次，待检测的细胞或组织样本需要进行前处理，包括固定、脱水、变性等步骤，以使细胞或组织中的DNA得以裸露并保持在固定的位置。
然后，将标记了探针的DNA序列加入到前处理好的样本中，通过温度控制和亲和作用，使探针与待检测的DNA序列结合。
这一步是原位杂交实验的关键，探针的选择、标记的方式、杂交条件的优化都会影响实验的结果。
最后，通过染色、显微镜观察或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量。
染色方法可以使用荧光染料或酶标记进行标记，通过显微镜观察标记物的位置和强度来判断待检测的DNA序列的存在和数量；而放射自显影则是利用放射性同位素标记的探针在放射底片上自显影的特性来检测探针的位置和数量。
总的来说，原位杂交原理是基于DNA的亲和性和特异性结合的原理，通过标记的探针与待检测的DNA序列结合，再通过染色或放射自显影等方法来检测探针的位置和数量，从而实现对目标DNA序列的定位和分析。
这一技术在细胞生物学、遗传学、病理学等领域有着广泛的应用，为科学研究和临床诊断提供了重要的技术支持。
原位杂交原理和应用
原位杂交原理和应用原位杂交是一种分子生物学技术，用于检测和定位其中一特定DNA序列在细胞或组织中的存在及其分布情况。
其原理是利用DNA的互补配对性，在已知或标记的DNA探针的引导下，与待检测的细胞或组织中的目标DNA序列发生杂交反应，通过杂交信号的强度和位置来确定目标DNA序列的存在性和分布情况。
原位杂交技术可以在细胞水平上获取DNA的信息，因此被广泛应用于生物医学和生命科学领域，特别是基因组学研究、疾病诊断和遗传学研究等方面。
原位杂交的关键步骤包括DNA探针标记和杂交反应。
DNA探针是一段已知或标记的DNA序列，用于与待检测样品中的目标DNA序列发生互补配对。
DNA探针可以通过多种方法标记，例如用放射性同位素、荧光染料、酶或金属粒子等。
标记的DNA探针将与目标DNA序列互补配对形成双链DNA，接着通过适当的检测方法来获得和分析杂交信号。
原位杂交技术的应用主要有以下几个方面。
1.基因组定位和显微镜分析：原位杂交可以帮助揭示其中一特定基因或DNA序列在染色体上的位置和数量。
通过杂交信号的位置和强度，可以推断不同染色体上的基因分布情况，并解析染色体结构的异常。
此外，原位杂交还可以用于显微镜分析，通过染色和可视化的技术，观察和研究目标DNA序列在细胞核中的位置和组织中的分布情况。
2.基因表达和功能研究：原位杂交可以用来研究基因的表达和功能。
通过使用特定的DNA探针，可以检测和分析基因在不同组织、不同发育阶段或不同条件下的表达情况。
这种技术可以帮助确定基因的调控机制和功能，以及探索基因与表型之间的关系。
此外，原位杂交还可以用于研究RNA的翻译和核糖体的组装等。
3.癌症诊断和治疗：原位杂交在癌症的诊断和治疗中起着重要的作用。
通过检测和分析肿瘤细胞中特定基因的异常表达或基因组结构的异常，可以帮助确定癌症的类型、分级和预后，并指导相关的治疗方案。
此外，原位杂交还可以用于药物研发和药物治疗的监测，通过观察药物与目标基因的相互作用和效果，评估药物的疗效和安全性。
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原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。
了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。
二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。
原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。
当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。
探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。
目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。
同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。
非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。
探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。
cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。
原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。
将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。
菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。
而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。
（一）探针的选择根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。
在大多数情况下，可以选择克隆的DNA 或cDNA双链探针。
但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。
例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。
长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。
在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。
如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。
但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。
如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。
对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。
这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
（二）探针的标记方法在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。
探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。
但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。
一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。
放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。
在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。
在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
（三）探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。
另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。
依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。
探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
（四）杂交率在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。
（五）杂交最适温度杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。
若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。
若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。
如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。
通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。
温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。
最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃苛刻复性温度：Ts = Tm –（10或15℃）非苛刻复性温度：Tns =Tm –（30或35℃）（六）杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。
一般认为在低于杂交体?（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten 和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。
时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。
一般杂交反应要进行20h左右。
1966年Britten 和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。
Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。
实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。
Cot=0，基本上没有杂交。
例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。
对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。
由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。
对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。
而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。
这是一种多聚胺，平均分子量为500 000。
另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。
在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。
因此，使用促进剂时有必要优化条件。
另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。
与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。
酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。
而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。
此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。
总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。