各种荧光素酶报告基因检测试剂盒解析

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双荧光素酶报告基因实验步骤

双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。

通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。

实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。

选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。

2. 细胞培养。

将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。

注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。

3. 细胞转染。

将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。

注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。

4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。

在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。

5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。

在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。

加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。

6. 数据统计。

按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。

（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。

在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。

（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。

双荧光素酶报告基因检测系统——更亮、更快、更准

双荧光素酶报告基因检测系统——更亮、更快、更准产品背景双荧光素酶报告基因常用于启动子对基因表达影响的研究。

将所研究目的基因的调控序列克隆到含有报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当的细胞系，通过测定报告基因表达的水平来间接评价在调控序列指导下启动子对基因表达的诱导作用。

荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，转录后无需修饰即具有报告基因的功能。

产品原理萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）大小为61KDa，单亚基蛋白，能够催化荧光素（luciferin）氧化，生成氧化荧光素oxyluciferin；海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为36 KDa的单亚基蛋白，能够催化腔肠素（coelenterazine）氧化形成coelenteramide。

二者在翻译后均无需修饰即可发挥作用。

通常情况下，海肾荧光素酶作为内肾，用以减少内在因素的某些变化对实验所造成的影响。

该试剂盒先对转染后的细胞进行裂解，然后以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性；具有检测信号强、线性范围广、无内源活性干扰等特点。

产品特点裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。

信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。

灵敏度更高：可检测低至10‐20摩尔荧光素酶分子。

线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。

操作流程加入海肾荧光素酶反应液的作用1：淬灭萤火虫荧光素酶的发光 2：加入海肾荧光素酶的底物腔肠素产品数据检测试剂和荧光素酶相互作用，可获得最佳的发光强度，加入海肾荧光素酶底物后，萤火虫荧光素发光淬灭情况：基本能够完全淬灭。

产品价格产品订购FAQQ1：双荧光素酶报告基因最适反应温度？A：室温（20-22℃）。

反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

此两种荧光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。

报告基因荧光素酶

报告基因荧光素酶1. 引言报告基因荧光素酶（Reporter gene luciferase）是一种用来研究基因表达的工具。

通过将荧光素酶基因与感兴趣的基因连接，我们可以追踪基因在细胞中的表达情况。

本文将介绍报告基因荧光素酶的原理、应用领域以及常见的实验方法。

2. 原理报告基因荧光素酶的原理基于反应底物荧光素与酶催化产生可见光的机制。

报告基因荧光素酶最常用的类型是火萤荧光素酶（Firefly luciferase）和海洋荧光素酶（Renilla luciferase）。

这两种酶的反应机制类似，都是在反应底物存在的条件下，通过氧化底物产生荧光。

具体而言，火萤荧光素酶催化底物荧光素，在氧气的参与下，荧光素通过氧化反应生成激发态氧化荧光素，并伴随着产生的荧光。

海洋荧光素酶则使用底物海洋荧光素，在氧气存在的条件下被酶催化氧化为产生荧光。

这两种荧光素酶所发出的荧光具有较高的强度和稳定性，因此广泛应用于基因表达研究和生物荧光成像等领域。

3. 应用领域3.1 基因表达分析报告基因荧光素酶通过转染至感兴趣的细胞中，能够随着目标基因的表达而发出荧光信号。

这使得基因表达的量化和动态变化的监测成为可能。

通过测量荧光强度，可以了解基因在不同条件下的表达水平，为基因调控和功能研究提供重要的数据依据。

3.2 药物筛选利用报告基因荧光素酶，可以构建新型的荧光素酶报告系统，用于药物筛选。

这种系统通过将荧光素酶与靶标基因连接，观察不同药物对基因表达的影响。

另外，荧光素酶可以被快速、准确地检测，从而提高药物筛选的效率。

3.3 细胞追踪研究报告基因荧光素酶可以用来追踪特定细胞在动物体内或培养基中的迁移、增殖和转化等过程。

通过将荧光素酶与标记细胞连接，可以观察细胞的迁移情况并实时监测。

4. 实验方法4.1 转染报告基因将报告基因荧光素酶载体构建成合适的质粒，并转染至目标细胞中。

转染方法可以选择常规的化学法、电穿孔法或者病毒载体转染等。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验引言荧光素酶（Luciferase）是一种广泛应用于生物学研究中的酶类，它能够催化荧光素的氧化反应，产生强烈的荧光。

荧光素酶报告实验是利用荧光素酶作为报告基因，通过其荧光产生的强度来检测目标基因的表达水平或者蛋白质相互作用等生物学过程。

本实验旨在通过荧光素酶报告实验的方法和步骤，探究其在生物学研究中的应用及意义。

材料与方法1. 荧光素酶基因表达载体2. 荧光素底物3. 细胞培养基4. 转染试剂5. 荧光素酶检测试剂盒6. 培养皿7. 显微镜8. 阅读器实验步骤：1. 将目标基因的cDNA克隆至荧光素酶基因表达载体中。

2. 将构建好的表达载体转染至目标细胞中。

3. 收集转染后的细胞，加入荧光素底物，观察荧光产生情况。

4. 使用荧光素酶检测试剂盒进行荧光强度的检测。

5. 利用阅读器对荧光强度进行定量分析。

结果与讨论通过荧光素酶报告实验，我们成功地检测到了目标基因的表达水平。

荧光素酶报告实验的结果显示，目标基因在转染细胞中产生了较强的荧光信号，表明该基因在该细胞中得到了高水平的表达。

这为我们进一步研究该基因在生物学过程中的功能提供了重要的实验依据。

荧光素酶报告实验的优点在于其灵敏度高、操作简单、结果可定量化，适用于多种细胞类型和生物学研究领域。

在基因表达调控、蛋白质相互作用、药物筛选等方面都有着重要的应用价值。

同时，荧光素酶报告实验也存在一些局限性，如荧光素底物的稳定性、荧光素酶在体内的半衰期等问题需要进一步研究和改进。

结论荧光素酶报告实验是一种重要的生物学实验技术，通过利用荧光素酶作为报告基因，可以快速、准确地检测目标基因的表达水平和蛋白质相互作用等生物学过程。

荧光素酶报告实验在基础科研和药物研发领域有着广泛的应用前景，对于揭示生物学过程的机制、发现新的药物靶点等具有重要意义。

希望本实验的结果能够为相关研究提供参考，并促进荧光素酶报告实验技术的进一步发展和应用。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

注意事项：
1) Fassay Buffer I和Fassay Substrate I应避免反复冻熔，可分装成合适体积分次使用。 Rassay Substrate II溶液应盖严存放，避免蒸发。配制好未用完的Fassay Reagent I和 Rassay Reagent II可在-20℃保存1月左右。
自动发光测定：
配制好的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II置于测定仪内并连接好对应管道，Fassay Reagent I接第一注射管道，Rassay Reagent II接第二注射管道。各待测样品20 μl分别加入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。记录Firefly luciferase和Ranilla luciferase的发光单位(RLU)。
测定前，在室温待Fassay Buffer I、Fassay Substrate I和Rassay Buffer II溶化，混匀（注意避光）。按20/1比例用Fassay Buffer I稀释Fassay Substrate I，按50/1比例用Rassay Buffer II 稀释Rassay Substrate II，分别配制所需体积的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II（注意避光）。
2) 细胞裂解液一般在当天测定。如需隔日测定，应将样品于-20℃保存。长期保存应在-80℃。测定样品量可为10~30μl个样品的两种试剂加入时间间隔一致。
4) Rassay Reagent II可用于直接测定样品的Ranilla luciferase。需要注意的是，Rassay Reagent II直接测量的RLU要比双荧光素酶顺序检测获得的RLU高一些（反应体积等因素的影响）。

双荧光素酶报告数据分析(3篇)

第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。

通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。

本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。

一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。

在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。

FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。

二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。

将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。

通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。

三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。

（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。

（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。

3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。

（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。

4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。

（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。

四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。

主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法：1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。

酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-nVector or DNA x Vector mNEB Buffer I或IV 2 DNA nSpe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1Pme I 1 T4 DNA Ligase 1Total voloume 20 Total voloume 101.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。

连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。

Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。

并扩繁阳性克隆。

重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A 液B液pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μlpRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μlMimic/NC 100 nM终浓度OPTI-MEM 25 μl6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。

荧光素酶报告基因检测试剂盒

¾ 萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm (centered around 560nm)。 ¾ 本试剂盒可以测定100个样品。
包装清单：
产品编号
RG005-1 RG005-2
—
产品名称报告基因细胞裂解液
荧光素酶检测试剂说明书
包装 60ml 10ml 1份
保存条件：
报告基因细胞裂解液4℃保存3个月有效，-20℃保存一年有效；荧光素酶检测试剂-20℃避光保存6个月有效，-70℃避光保存一年有效。
4. 每个样品测定时，取样品20-100微升(如果样品量足够，请加入100微升，但每次样品的使用量要保持一致)，加入100微升
荧光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。
使用本产品的文献：
1. Zhou F, Zhang L, Gong K, Lu G, Sheng B, Wang A, Zhao N, Zhang X, Gong Y. LEF-1 activates the transcription of E2F1. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Jan 4;365(1):149-53.
产品编号 RG005
荧光素酶报告基因检测试剂盒
产品名称荧光品简介：
¾ 碧云天生产的荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光 (bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。

双荧光素酶报告基因检测试剂盒( Dual-Lucy Assay Kit )

双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Lucy Assay Kit)货号：D0010规格：100T保存：低温运输，-20℃或-80℃避光保存。

有效期6个月。

产品内容：名称数量保存条件5×Universal Lysis Buffer(通用裂解液)20ml-20℃Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃产品说明：报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。

由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。

荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。

萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。

这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。

本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。

采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。

自备试剂：PBS、双蒸水等。

操作步骤：一、裂解细胞：1)新鲜配制裂解液：临用前，取适量5×Universal Lysis Buffer(ULB)，用双蒸水稀释至1×ULB，混匀。

荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验摘要本实验主要目的是通过荧光素酶报告基因的荧光信号反映基因的表达情况。

在实验中，我们使用了荧光素酶作为报告基因，将其基因序列与感兴趣的基因序列连接，以便观察目标基因的表达水平。

实验结果表明，荧光素酶报告实验是一种简便、快速且高效的方法来研究基因表达。

背景荧光素酶（Luciferase）是一种广泛应用于生物学研究中的报告基因。

荧光素酶通过氧化反应将底物荧光素转化为荧光信号，荧光信号的强度可以反映基因的表达水平。

荧光素酶报告实验可以用于研究各个基因的表达情况，包括代谢调控、信号传导、蛋白质相互作用等。

实验步骤1.构建荧光素酶报告基因载体：首先，将荧光素酶基因的编码序列克隆到一个适当的表达载体中，确保在适当的上下游序列中加入限制酶切位点，方便后续操作。

然后，将感兴趣的基因序列与荧光素酶基因序列连接，形成一个新的报告基因载体。

2.转染细胞系：将构建好的荧光素酶报告基因载体转染到感兴趣的细胞系中，确保细胞可表达荧光素酶。

转染方法可以采用化学转染、电穿孔等常用转染方法。

转染后，将细胞培养在含有适当培养基的培养皿中，以便细胞生长和表达荧光素酶。

3.荧光测量：培养一定时间后，使用荧光素酶检测试剂盒对培养皿中的细胞进行荧光测量。

将测量结果与阴性对照组进行比较，可以得出荧光信号的相对强度，进而推测目标基因的表达水平。

结果与讨论通过荧光素酶报告实验，我们可以获得目标基因的表达水平的相对数据。

实验结果显示，在目标基因兴奋剂处理后，荧光素酶的表达水平明显增加，显示出更强的荧光信号。

而在阴性对照组中，荧光素酶的表达水平较低，荧光信号也相对较弱。

这表明，目标基因的表达水平受到兴奋剂的调控，荧光素酶报告实验的结果是可靠的。

荧光素酶报告实验具有许多优点。

首先，该方法简单、快速，不需要复杂的仪器设备。

其次，荧光素酶的荧光信号非常强，可以很容易地被检测到。

最后，该方法可以应用于各种不同细胞系，适用于多种研究领域。

然而，荧光素酶报告实验也存在一些限制。

双荧光素酶报告基因检测系统-promega

Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。

R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。

3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。

（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。

重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。

pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。

具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。

1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。

萤火虫荧光素酶报告基因的检测

萤火虫荧光素酶报告基因的检测转载请注明来自丁香园发布日期：2010-04-08 10:24 文章来源：北京原平皓生物技术有限公司关键词：荧光素酶报告基因化学发光检测荧光检测光吸收检测点击次数：6801. 应用说明荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。

萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。

萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。

因此可将萤火虫荧光素酶的基因插入不同载体，作为报告基因，在细胞中表达。

Turner BioSystems的ModulusTM单管型多功能检测仪与Promega's Stead y-Glo®的检测试剂盒连用为荧光素酶报告基因系统中的基因表达定量提供了一种非常简便的方法。

同时荧光素酶报告基因系统中的转录调控也常常被用于研究细胞的整个培养过程中的生理情况。

Steady-Glo试剂的发光半衰期大约为5小时，光信号能在加入试剂后5min到数小时之间都能检测到。

同时Steady-Glo试剂应该与哺乳动物细胞培养基（RPMI 164 0, MEMa, DMEM and Ham's F12）相匹配，并且不会受到酚红和有机溶剂的影响。

用具发光检测功能的ModulusTM单管型多功能检测仪检测时，荧光素酶的检测线性范围为1X10-18-1X10-11 mol或几个数量级（图1）。

实验由Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（E2520）来完成，重组的萤火虫荧光素酶纯化，也用Promega产品（E1701）。

图1 用Modulus单管型多功能检测仪与Promega的Steady-Glo试剂盒和重组荧光素酶检测所得结果。

2. 所需器材●具有发光检测模块的ModulusTM单管型多功能检测仪(http://www.yph-bio.co m/equip/modulus/modulus.asp)（货号9200-001或9200-002）●1.5ml 微型离心管●Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（E2520）●p200移液器和匹配枪头3. 实验方案3.1试剂制备Steady-Glo底物：使用所提供的底物，-20°C下可稳定储存6个月；4°C下可储存1个月。

荧光素酶报告基因系统

荧光素酶报告基因系统
课程内容
实验原理实验仪器设备实验试剂及耗材操作步骤应用举例重点内容
Luciferase报告基因系统
以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly
luciferase)活性的一种报告系统。
荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin
转染。如果此miRNA能够抑制靶3’-UTR则荧光素酶基因表达降低，荧光素酶的表达量与miRNA的作用强度呈反比。
（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，
产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断miRNA是否能与此靶3’-UTR片段有作用。
转录因子活性检测实验原理
（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表
达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等
（2）将要检测的转录因子表达质粒，与报告基因质粒
和对照质粒共转染。如果此转录因子能够激活靶启动子则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度呈正比。
3’UTR序列查询
3’UTR序列查询
3’-UTR
生物信息分析
序列插入和质粒构建
质粒转染和细胞培养
仪器使用
应用举例
应用举例
活体动物成像
原理：以荧光素酶标记细胞或动物模型应用优点和缺点
本次课程重点内容
应用荧光素酶报告基因系统检测转录因子活性实验原理应用荧光素酶报告基因系统检测miRNA活性实验原理
粒对照，提纯备用
（5）培养目的细胞，并接种于24孔板中，生长10-24小时
（80%汇合度）。
（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8）加入底物，测定荧光素酶的活性。（9）计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

双荧光酶报告实验报告

一、实验背景双荧光素酶报告基因检测实验是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达调控、蛋白-DNA互作以及非编码RNA的靶向互作等生物学过程。

该实验利用荧光素酶的发光特性，通过检测荧光强度来评估目的基因或蛋白的表达水平以及与DNA的结合情况。

二、实验目的本实验旨在通过双荧光素酶报告基因检测技术，研究特定转录因子对目的基因的调控作用。

三、实验材料与试剂1. 细胞株：HEK293细胞2. 载体：pGL3基本载体（含萤火虫荧光素酶基因）、pCMV- Renilla荧光素酶载体（内参基因）3. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、转染试剂、荧光素酶底物、荧光素酶测定仪、DNA序列分析软件等四、实验方法1. 构建报告基因质粒：将目的基因的启动子序列克隆到pGL3基本载体中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后进行转染。

3. 转染：按照转染试剂说明书，将报告基因质粒和pCMV-Renilla荧光素酶载体共转染细胞。

4. 细胞培养：转染后继续培养细胞，收集细胞并进行裂解。

5. 荧光素酶活性检测：将裂解液加入荧光素酶底物，在荧光素酶测定仪上检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。

6. 数据分析：计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，分析特定转录因子对目的基因的调控作用。

五、实验结果1. 成功构建了报告基因质粒，并进行了转染。

2. 通过荧光素酶活性检测，获得了萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性值。

3. 计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值，分析了特定转录因子对目的基因的调控作用。

六、实验讨论本实验成功构建了报告基因质粒，并通过双荧光素酶报告基因检测技术，研究了特定转录因子对目的基因的调控作用。

实验结果表明，该转录因子能够显著提高目的基因的表达水平。

七、实验结论本实验通过双荧光素酶报告基因检测技术，成功研究了特定转录因子对目的基因的调控作用，为后续相关研究提供了实验依据。

双萤光素酶检测试剂盒说明书

双萤光素酶检测试剂盒使用前请仔细阅读说明书产品包装和保存条件Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (100 rxns)Luciferase Reaction Buffer10 mlLuciferase Reaction Substrate (Lyophilized) 1 vialLuciferase Reaction Buffer II10 mlLuciferase Reaction Substrate II (125X)80 μlLysis Buffer (5X)10 ml试剂盒于-20o C保存。

Lysis Buffer -20o C可保存一年。

反应试剂（Luciferase Reaction Reagent和Luciferase Reaction Reagent II）加入底物后，分装、避光保存；-70o C可保存一年，-20o C可保存一个月；避免反复冻融。

试剂使用前需平衡至室温。

实验原理萤火虫萤光素酶（firefly luciferase, fluc）和海肾萤光素酶（renilla luciferase, rluc）可分别催化萤光素（luciferin）和腔肠素（coelenterazine）产生生物萤光反应，反应过程如下图所示。

在双萤光素酶反应中，首先用Luciferase Reaction Reagent检测fLuc信号；随后，直接加入Luciferase Reaction Reagent II，将fLuc的信号猝灭，同时产生rLuc信号。

该方法具有操作简单、检测快捷、灵敏度高等优点。

实验步骤1.配制试剂1.1Lysis BufferLysis Buffer (5X) 用水稀释5倍，配制成工作液；1.2Luciferase Reaction Reagent用Luciferase Reaction Buffer（10 ml）溶解Luciferase Reaction Substrate干粉（短暂离心再开盖），混匀后分装、避光保存，避免反复冻融；1.3Luciferase Reaction Reagent II用Luciferase Reaction Buffer II（10 ml）稀释、混合Luciferase Reaction Substrate II（短暂离心再开盖），分装、避光保存，避免反复冻融。

双荧光素酶报告基因实验

双荧光素酶报告基因实验引言。

双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达调控机制。

该实验利用双荧光素酶系统，通过测定荧光素酶和荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。

本文将介绍双荧光素酶报告基因实验的原理、步骤和应用。

原理。

双荧光素酶报告基因实验基于双荧光素酶系统，该系统包括两种荧光素酶，火榴荧光素酶（Firefly Luciferase）和海洋荧光素酶（Renilla Luciferase）。

火榴荧光素酶是一种广泛应用的报告基因，在转录和翻译水平均可用于检测基因表达水平。

海洋荧光素酶则常用作内参基因，用于校正样品中的变异。

在双荧光素酶报告基因实验中，研究者首先将感兴趣的启动子区域或转录因子结合位点克隆到双荧光素酶报告载体中。

然后将该载体转染入目标细胞中，通过测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。

步骤。

双荧光素酶报告基因实验的步骤主要包括载体构建、细胞培养、转染、荧光素酶活性测定和数据分析。

1. 载体构建，将感兴趣的启动子区域或转录因子结合位点克隆到双荧光素酶报告载体中，构建实验所需的报告基因载体。

2. 细胞培养，选取适当的细胞系，进行细胞培养并分装到96孔板中。

3. 转染，将构建好的双荧光素酶报告载体转染入目标细胞中，使其表达双荧光素酶。

4. 荧光素酶活性测定，使用双荧光素酶检测试剂盒，分别测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性。

5. 数据分析，根据荧光素酶活性测定结果，计算目标基因的表达水平，并进行统计学分析。

应用。

双荧光素酶报告基因实验在基因表达调控机制研究中有着广泛的应用。

它可以用于研究转录因子结合位点的功能、筛选miRNA的靶基因、评估药物的影响等。

此外，双荧光素酶报告基因实验还可以用于高通量筛选和药物开发。

结论。

双荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物学实验技术，它通过测定火榴荧光素酶和海洋荧光素酶的活性，来研究基因的转录和翻译水平。

荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测●原则荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。

检测步骤如下：1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。

2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。

3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。

4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。

●特点◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng◆确切的检测限依检测仪器而定。

◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。

不适用于对细菌荧光素酶进行检测。

●器材和试剂◆器材在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。

当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。

◆试剂1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些试剂可以启动酶反应。

这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。

避免反复冻融。

应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。

2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。

●基本操作步骤下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。

提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。

不要反复冻融以避免酶活性的降低。

1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。

2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子）小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。

10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO414.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。

3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。

细胞色素P450酶系总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途

细胞色素P450醮系总活性荧光定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞色素P450酶系（CYP-ECOD）总活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过乙氧基香豆素脱乙基酶反应系统中乙氧基香豆素转化为羟基香豆素后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶系活性的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素P450酶系的总活性检测。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景细胞色素P450陋是肝细胞微粒体复合功能单加氧化酶系统的总称。

其分成五十多个亚酶：CYP1.至CYP51.作用在于体内外源化合物（Xenobiotics）,包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxy1.ation）。

乙氧基香豆素脱乙基酶（7-eihoxycoumarinOdeethy1.ase；ECOD）的活性是细胞色素P450酶系的诊断标记，其基于EeoD广泛性催化细胞色素P450亚酶的活性。

乙轨基香豆素（7-ethoxycoumarin）在乙氧基香豆素脱乙基酶的催化下，转化为羟基香豆素（7-hydroxycoumarin）后荧光峰值的变化（激发波长368nm,散发波长456nm）,来定量测定细胞色素P450酶系的活性。

乙叙基香豆素脱乙基酶反应系统为：ECOD7-ethoxycoumarin+NADPH-*7-hydroxycoumarin+CH J CHO+NADP+产品内容缓冲液(ReagentA) 5毫升反应液(ReagentB) 500微升底物液(ReagentC) 125微升终止液(ReagentD) 2毫升标准液(ReagentE) 100微升产品说明书1份保存方式保存在一20C冰箱里，反应液（ReagenIB）、底物液（Reagen1.C）和标准液（ReagentE）避免光照，终止液（Reagen1.D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器培养箱：用于孵育反应200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器荧光分光光度仪过荧光酶标仪：用于荧光分析实验步骤实验开始前，将一20C冰箱里的试剂置入冰槽里融化。

荧光素酶报告基因检测影响因素及注意事项

荧光素酶报告基因检测影响因素及注意事项1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。

所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。

2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解3．双荧光素酶报告基因的载体选择：a) 萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；b) 海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。

建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。

建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。

5．最适反应温度：室温（20-22℃）。

各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差7．细胞裂解液无需离心去沉淀。

8．被动裂解液存放：5×的裂解液，-20℃存放；1×裂解液，建议现用现配，4℃不能超过1个月9．配好的工作液存放：萤火虫检测工作液，-20℃一个月；-80℃一年；海肾检测工作液，建议现用现配，-20℃不能超过15天，反复冻融6次活性损失≤15%10．细胞裂解产物存放：常温6小时；4℃16小时，-20℃一个月；-80℃半年或更长11．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致12．检测结果：Modulus单管型检测仪的检测范围0-2千万，Modulsu微孔板检测仪的检测范围0-2亿。

荧光素酶报告

荧光素酶报告检测结果：双萤光素酶报告基因检测（miRNA靶基因验证）实验摘要：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证hsa-mir-21对目的基因Tropomyosin 1（TPM1）的抑制作用；通过检测带有TPM1的3‟UTR的luciferase在hsa-mir-21过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位点的3‟UTR的luciferase的表达，进一步确定了hsa-mir-21与TPM1靶基因3‟UTR的作用位点。

关键词：hsa-mir-21，3‟UTR，Tropomyosin 1（TPM1），Dual-Reporter Assay一、实验原理:萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶。

单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。

Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。

得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNA靶基因验证。

由于miRNA主要通过作用于靶基因的3‟UTR起作用，可以将目的基因3‟UTR区域构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3‟UTR 的作用位点。

二、实验目的验证hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3‟UTR是否发生作用并进一步确定hsa-mir-21与靶基因Tropomyosin 1 3‟UTR的作用位点。

三、实验步骤1. 质粒转染细胞：1) 细胞铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。