组织切片制作步骤
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植物组织石蜡切片技术是农学学生需要掌握的基本实验操作技术。
工具/原材料
药物:石蜡,酒精,二甲苯,藏红花/快速绿色染色溶液,胶,明胶,甲醛等
仪器:石蜡切片机,组织脱水器,载玻片台,培养箱,染料桶,载玻片,盖玻片,烧杯,量筒等
方法/步骤
1.取材
确定材料的来源和位置,纵向还是横向;
应尽快取走材料以防止进一步变化,并且材料量应适当。
下图显示了植物芽的实际采样。
石蜡切片的制备步骤(附图)
石蜡切片的制备步骤(附图)
2.固定
(1)固定剂的选择
最常用的固定剂是FAA。
该方法的优点是材料的固定时间不受限制。固定时间可以短至几个小时,也可以长达几个月或几年。(可用作材料保存溶液)
配方:50%或70%酒精90ml
冰醋酸5毫升
福尔马林5毫升
(含50%酒精的软质材料,含70%酒精的硬质材料)
(2)固定后材料的处理
洗涤或漂洗:固定后,应彻底清洗组织以去除固定溶液和残留在组织中的晶体沉淀,否则会影响染色效果。
(如果固定后该材料暂时无法进行下一步操作,则可以将其存储在70%的酒精溶液中或直接用FAA固定溶液在4℃的冰箱中存储。)
下图显示了浸泡在固定液中的组织切片。
石蜡切片的制备步骤(附图)
3.脱水
目的:水和透明剂不能互溶,只有除去水后,透明剂才能进入。
试剂:梯度酒精溶液
工艺:70%--- 85%--- 95%-100%--- 100%。每个步骤约为1h-2h。
注意:确保脱水梯度和脱水时间的每一步,都应将水彻底清除,但不要过度脱水(时间过长会使组织变脆和收缩,这时您可以根据自己的实验进行探索,不需要完全遵循此操作)。
下图显示了适用于大量样品脱水的自动组织脱水器。如果物料体积和样品体积较小,则可以将小烧杯用作逐步脱水的容器。
石蜡切片的制备步骤(附图)
4.透明度
目的:纯酒精不能与石蜡溶解,但需要用能与酒精和石蜡溶解的溶剂代替组织中的酒精。
(二甲苯是最常用的透明剂,可以与石蜡很好地混溶)
工艺:等体积的二甲苯和乙醇的混合物1H ---纯二甲苯1H ---纯二甲苯1H。
5.蜡浸和嵌入
目的:用石蜡代替石蜡。
蜡浸程序:(恒温)
(1)低温浸蜡(36℃):接下来,将碎蜡逐渐与二甲苯和物料一起加入烧杯中,直至其过饱和(石蜡无法溶解),并放置过夜12-24小时。
(2)高温蜡浸(55-60℃,比石蜡熔点高3℃)
倒出二甲苯和石蜡的混合物,不要倒出材料,将纯石蜡加入烧杯中5-24h。纯石蜡需要更换三次。
关于石蜡熔点的选择:
对于硬质材料,使用熔点较高的石蜡包埋;
当切片较薄时(低于8μm),选择包埋的熔点更高的石蜡。
夏季应使用熔点较高(56.58℃)的石蜡,冬季应使用熔点较低(52.54℃)的石蜡。
石蜡切片的制备步骤(附图)
石蜡切片的制备步骤(附图)
石蜡切片的制备步骤(附图)
6.切片
传统的切片方法是用刀片将嵌入的蜡块切成规则的梯形,将其粘在小木块上,然后在机器上切割。
新的切片方法是用嵌入框架(参见下图)代替木块的支撑作用,然后在机器上切片。
切片的厚度可以根据我们自己的实验要求确定,通常在8μm-20μM的范围内。
(下图显示了传统的切片机和新的自动切片机)
石蜡切片的制备步骤(附图)
石蜡切片的制备步骤(附图)
石蜡切片的制备步骤(附图)
7.粘贴和烘烤
粘着:蜡片通过粘片牢固地固定在载玻片上,以防止材料掉入随后的操作。
在载玻片上涂抹粘性片剂(液体a),然后滴入蒸馏水(液体B),放在蜡载玻片上,并用滤纸吸收过量的水。
烘烤载玻片:将载玻片放在40℃的载玻片桌上干燥。
常用的粘合片是Haupt配方
液体A:明胶1g;溶液B:甲醛4毫升
蒸馏水100ml蒸馏水100ml
甘油15毫升
苯酚2G
石蜡切片的制备步骤(附图)
8.脱蜡,补水和染色
脱蜡的目的:干燥后的切片需要在水溶性染料染色之前进行脱蜡和补水。
补水的目的:脱蜡后的物料,如果不补水,直接进入染料中,会使物料严重变形,甚至难以染色。
染色目的:使细胞组织中的不同结构呈现出不同的颜色和足够强的差异,以便于观察。
整个过程:二甲苯→1/2二甲苯+ 1/2纯酒精→100%酒精→95%酒精→85%酒精→藏红花(4小时以上)→95%酒精→坚牢绿色(快)→95%酒精(快速)→100%酒精→1/2二甲苯+ 1/2纯酒精→二甲苯→二甲苯。以上水平大约需要5-10分钟