牛膝多糖衍生物的几种取代度测定方法的探讨

天然产物研究与开发　2004　Vol.16　No.6NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEV ELOPMEN T 收稿日期:2004208206 接受日期:2004209221　3通讯作者Tel :86221264163300;E 2mail :tiangy @牛膝多糖衍生物的几种取代度测定方法的探讨胡礼勇1,2　张　健1　郑　波1　敬应春1,2　田庚元13(11中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室　上海　200032;21浙江京新药业股份有限公司研究一所　新昌　312500)摘　要　在研究多糖的结构与功能关系时,多糖经化学修饰后,其取代基的多少和取代位置均对活性有重要的影响,因此对于离子型牛膝多糖衍生物和非离子型牛膝多糖衍生物,如何准确测定其取代度非常重要。

通过运用酸碱滴定法(AB T )、原子吸收光谱法(AAS )、傅立叶变换红外光谱法(FTIR )和高效液相色谱法(HPLC )相对照分别对羧甲基牛膝多糖(CM 2Abps )和羟乙基牛膝多糖(HE 2Abps )的取代度进行测定,实验结果发现在DS <1.0范围内,测得CM 2Abps 的几组数值均比较接近,且线性关系较好;在DS <2.0范围内,测得HE 2Abps 的几组数值均比较接近,线性关系也较好。

研究表明,运用AB T 、AAS 、FTIR 和FTIR 相对照测定CM 2Abps 和HE 2Abps 的取代度是切实可行的,而且方法快速简捷,精确度和重现性较好。

关键词　牛膝多糖;衍生物;取代度;红外光谱;高效液相色谱MEASUREMENT ON THE DEGREE OF SUBSTITUTION OF POLYSACCH 2ARIDE DERIVATIVES FROM AC H YRAN TH ES B ID EN TA TAHU Li 2yong 1,2,ZHAN G Jian 1,ZHEN G Bo 1,J IN G Y ing 2chun 1,2,TIAN G eng 2yuan 13(1.S hanghai Institute of Organic Chemist ry ,Chinese Academic of Sciences ,Shanghai 200032,China ;2.Research and Development Center of New Drugs ,Zhejiang Jingxin Pharm aceutical Co.,L td .,Xinchang 312500,China )Abstract It is important to determine the degree of substitution (DS )of both ionic A chy ranthesbi dentata polysaccharide derivatives and nonionic A chy ranthes bi dentata polysaccharide deriva 2tives.The degree of substitution of carboxymethylated A chy ranthes bi dentata polysaccharides (CM 2Abps )and hydroxyethylated A chy ranthes bi dentata polysaccharides (HE 2Abps )were stud 2ied using acid 2base titration (AB T ),atomic absorption spectroscopy (AAS ),Fourier transform in 2frared spectroscopy (F TIR )and HPLC analysis.For CM 2Abps ,linear relationships in the range of DS <1.0were obtained by AB T ,AAS and IR.And for HE 2Abps ,linear relationships in the range of DS <2.0were also obtained by IR and HPLC.The methods are feasible ,rapid and concise.Their precision and repeatability are excellent.K ey w ords A chy ranthes bi dentata ;polysaccharides ;derivative ;degree of substitution ;IR ;HPLC 牛膝多糖(Abps )是从苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)的干燥根中提取分离得到的一种平均分子量为1400Da 的杂多糖,其分子结构已被测定(图1)[1,2]。

它具有增强机体免疫、抑制肿瘤细胞转移、增强天然杀伤细胞活性、升高白细胞数、保护肝细胞膜和激活人胸腔巨噬细胞等生物活性[1,327]。

为了研究其结构与功能的关系,我们运用化学方法分别合成了离子型牛膝多糖衍生物(如牛膝多糖硫酸酯[8]、羧甲基牛膝多糖[9]、牛膝多糖磷酸酯[10]等)和非离子型牛膝多糖衍生物(如羟乙基牛膝多糖[11]等)。

研究发现,其取代度不仅会影响其理化性质及生物活性,还对化学合成反应条件的选择具有指导意义,因此,如何准确测定其取代度是一个很重要的问题。

通常测定多糖衍生物取代度的方法有灼烧194法[12]、可见分光光度法[13]、紫外光谱法[14]、红外光谱法[15]、电化学法[16]、1H NMR 法[17]、13C NMR 法[18]、GC 2MS 法[11]等,但这些方法中,有的误差较大或重现性不理想,有的测定费用昂贵,而有的测定步骤又较繁,使其应用受到了限制。

本文报道了利用酸碱滴定法(AB T )、原子吸收光谱法(AAS )、傅立叶变换红外光谱法(F TIR )和高效液相色谱法(HPLC )等方法对离子型牛膝多糖衍生物(以羧甲基牛膝多糖为例)和非离子型牛膝多糖衍生物(以羟乙基牛膝多糖为例)的取代度的测定进行了研究,取得了较为满意的结果,而且其方法快速简捷,精确度和重现性较好,因此,更易于在生产监控和质量检验中应用、推广。

图1　牛膝多糖结构式Fig.1　Structure of Achyranthes bidentata polysaccharide1　实验部分111　试剂及仪器牛膝多糖精品(纯度>98%),从中药牛膝中提取、分离、纯化而得;羧甲基牛膝多糖[9]、羟乙基牛膝多糖[11]均由本实验室制备;NaOH 、HCl 、H 2SO 4、BaCO 3、Dowex 50×8、果糖、葡萄糖均为分析纯;Sepectr AA 220原子吸收分光光度计;Bio 2Rad F TS 2185傅立叶变换红外光谱仪;Shimadzu (LC 210AD ,RID 26A ,SCL 210A VP )高效液相色谱仪。

112　羧甲基牛膝多糖(CM 2Abps )取代度的测定1.2.1　酸碱滴定法[18220]　首先将CM 2Abps (50mg )溶于水中,加入Dowex 50×8(H +型)至p H ≈3.0,过滤,冷冻干燥,得白色固体(CM 2Abps 2H ),如此反复操作,直至红外光谱检测(图2)CM 2Abps 中2COONa 已完全转化为2COOH 。

然后取CM 2Abps 2H(20mg ),精密称定,向其加入0.01mol/L NaOH 溶液过量,滴加1滴酚酞指示液,接着用0.01mol/L HCl 溶液滴至粉红色突然消失,记录NaOH 溶液和HCl 溶液的用量。

根据下述计算式,即可计算出样品的取代度(DS 1)。

DS 1=(M NaOH ×V NaOH -M HCl ×V HCl )×162/W 样品(1)注:M NaOH 、M HCl 分别为NaOH 和HCl 的摩尔浓度(mol/L );V NaOH 、V HCl 分别为NaOH 和HCl 的标定体积(L );W 样品为样品重量(g)图2　CM 2Abps 经离子交换后的红外光谱图Fig.2　IR spectrogram of CM 2Abps by ion exchange1.2.2　原子吸收光谱法[21]　将CM 2Abps 于105℃下干燥6h ,进行钠原子吸收光谱分析,测得样品中钠元素的质量分数(ωNa %)。

将所测得的钠元素质量分数代入下述计算式,即可计算出样品的取代度(DS 2)。

DS 2=162×ωNa /(2300-80×ωNa )(2)1.2.3　傅立叶变换红外光谱法[21225]　将CM 2Abps固体于105℃下干燥6h ,通过K Br 压片法制得薄片,用Bio 2Rad F TS 2185傅立叶变换红外光谱仪检测。

在其红外吸收光谱图上,利用G aussian 法分别测定表征2OCH 2COONa 中2COO 2反对称伸缩振动的～1600cm -1的吸收峰面积和表征葡萄糖环骨架振动的～930cm -1的吸收峰面积,以～930cm -1的吸收峰面积为内标用于定量计算,即可求出样品的取代度(DS 3)。

113　羟乙基牛膝多糖(HE 2Abps )取代度的测定1.3.1　高效液相色谱法[18]　将HE 2Abps (3mg )溶于0.2mol/L H 2SO 4(3mL )中,50℃下密闭水解1h ,BaCO 3中和至中性,反应液经Dowex 50×8(H +)除盐后,进行HPLC 分析得到四个主要峰(图3),将所测得的四个峰的峰面积代入下述计算式,即294 天然产物研究与开发2004　Vol.16　No.6可计算出样品的取代度(DS 4)。

DS 4=(S 1×2+S 2)/(S 1+S 2+S 3+S 4)(3)式中,S 1代表多取代的果糖的峰面积,S 2代表单取代的果糖的峰面积,S 3代表未取代的果糖的峰面积,S 4代表未取代的葡萄糖的峰面积。

图3　HE 2Abps 完全酸水解产物的HPLC 图谱Fig.3　HPLC chromatogram of hydrolysate of HE 2Abps1.3.2　傅立叶变换红外光谱法[24227]　将HE 2Abps固体于105℃下干燥6h ,通过K Br 压片法制得薄片,用Bio 2Rad F TS 2185傅立叶变换红外光谱仪检测。