牛膝多糖衍生物的几种取代度测定方法的探讨

天然产物研究与开发　

2004　Vol.16　No.6

NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEV ELOPMEN T

收稿日期:2004208206 接受日期:2004209221

　3通讯作者Tel :86221264163300;E 2mail :tiangy @

牛膝多糖衍生物的几种取代度测定方法的探讨

胡礼勇1,2　张　健1　郑　波1　敬应春1,2　田庚元13

(11中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室　上海　200032;

21浙江京新药业股份有限公司研究一所　新昌　312500)

摘　要　在研究多糖的结构与功能关系时,多糖经化学修饰后,其取代基的多少和取代位置均对活性有重要的影响,因此对于离子型牛膝多糖衍生物和非离子型牛膝多糖衍生物,如何准确测定其取代度非常重要。通过运用酸碱滴定法(AB T )、原子吸收光谱法(AAS )、傅立叶变换红外光谱法(FTIR )和高效液相色谱法

(HPLC )相对照分别对羧甲基牛膝多糖(CM 2Abps )和羟乙基牛膝多糖(HE 2Abps )的取代度进行测定,实验结

果发现在DS <1.0范围内,测得CM 2Abps 的几组数值均比较接近,且线性关系较好;在DS <2.0范围内,测得HE 2Abps 的几组数值均比较接近,线性关系也较好。研究表明,运用AB T 、AAS 、FTIR 和FTIR 相对照测定

CM 2Abps 和HE 2Abps 的取代度是切实可行的,而且方法快速简捷,精确度和重现性较好。

关键词　牛膝多糖;衍生物;取代度;红外光谱;高效液相色谱

MEASUREMENT ON THE DEGREE OF SUBSTITUTION OF POLYSACCH 2ARIDE DERIVATIVES FROM AC H YRAN TH ES B ID EN TA TA

HU Li 2yong 1,2,ZHAN G Jian 1,ZHEN G Bo 1,J IN G Y ing 2chun 1,2,TIAN G eng 2yuan 13

(1.S hanghai Institute of Organic Chemist ry ,Chinese Academic of Sciences ,Shanghai 200032,China ;

2.Research and Development Center of New Drugs ,Zhejiang Jingxin Pharm aceutical Co.,L td .,Xinchang 312500,China )

Abstract It is important to determine the degree of substitution (DS )of both ionic A chy ranthes

bi dentata polysaccharide derivatives and nonionic A chy ranthes bi dentata polysaccharide deriva 2

tives.The degree of substitution of carboxymethylated A chy ranthes bi dentata polysaccharides (CM 2Abps )and hydroxyethylated A chy ranthes bi dentata polysaccharides (HE 2Abps )were stud 2ied using acid 2base titration (AB T ),atomic absorption spectroscopy (AAS ),Fourier transform in 2frared spectroscopy (F TIR )and HPLC analysis.For CM 2Abps ,linear relationships in the range of DS <1.0were obtained by AB T ,AAS and IR.And for HE 2Abps ,linear relationships in the range of DS <2.0were also obtained by IR and HPLC.The methods are feasible ,rapid and concise.Their precision and repeatability are excellent.

K ey w ords A chy ranthes bi dentata ;polysaccharides ;derivative ;degree of substitution ;IR ;HPLC

牛膝多糖(Abps )是从苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata Blume.)的干燥根中提取分离得到的一种平均分子量为1400Da 的杂多糖,其分子结构已被测定(图1)[1,2]。它具有增强机体免疫、抑制肿瘤细胞转移、增强天然杀伤细胞活性、升高白细胞数、保护肝细胞膜和激活人胸腔巨噬细胞等生物活

性[1,327]。为了研究其结构与功能的关系,我们运用化学方法分别合成了离子型牛膝多糖衍生物(如牛膝多糖硫酸酯[8]、羧甲基牛膝多糖[9]、牛膝多糖磷酸酯[10]等)和非离子型牛膝多糖衍生物(如羟乙基牛膝多糖[11]等)。研究发现,其取代度不仅会影响其理化性质及生物活性,还对化学合成反应条件的选择具有指导意义,因此,如何准确测定其取代度是一个很重要的问题。

通常测定多糖衍生物取代度的方法有灼烧

1

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法[12]、可见分光光度法[13]、紫外光谱法[14]、红外光

谱法[15]、电化学法[16]、1H NMR 法[17]、13

C NMR 法[18]、GC 2MS 法[11]等,但这些方法中,有的误差较大或重现性不理想,有的测定费用昂贵,而有的测定步骤又较繁,使其应用受到了限制。本文报道了利用酸碱滴定法(AB T )、原子吸收光谱法(AAS )、傅立叶变换红外光谱法(F TIR )和高效液相色谱法(HPLC )等方法对离子型牛膝多糖衍生物(以羧甲

基牛膝多糖为例)和非离子型牛膝多糖衍生物(以羟

乙基牛膝多糖为例)的取代度的测定进行了研究,取得了较为满意的结果,而且其方法快速简捷,精确度和重现性较好,因此,更易于在生产监控和质量检验中应用、推广

。

图1　牛膝多糖结构式

Fig.1　Structure of Achyranthes bidentata polysaccharide

1　实验部分

111　试剂及仪器

牛膝多糖精品(纯度>98%),从中药牛膝中提取、分离、纯化而得;羧甲基牛膝多糖[9]、羟乙基牛膝多糖[11]均由本实验室制备;

NaOH 、HCl 、H 2SO 4、BaCO 3、Dowex 50×8、果

糖、葡萄糖均为分析纯;

Sepectr AA 220原子吸收分光光度计;Bio 2Rad F TS 2185傅立叶变换红外光谱仪;Shimadzu (LC 210AD ,RID 26A ,SCL 210A VP )高效

液相色谱仪。

112　羧甲基牛膝多糖(CM 2Abps )取代度的测定1.2.1　酸碱滴定法[18220]　首先将CM 2Abps (50mg )溶于水中,加入Dowex 50×8(H +型)至p H ≈3.0,过滤,冷冻干燥,得白色固体(CM 2Abps 2H ),如

此反复操作,直至红外光谱检测(图2)CM 2Abps 中2COONa 已完全转化为2COOH 。然后取CM 2Abps 2H

(20mg ),精密称定,向其加入0.01mol/L NaOH 溶

液过量,滴加1滴酚酞指示液,接着用0.01mol/L HCl 溶液滴至粉红色突然消失,记录NaOH 溶液和HCl 溶液的用量。根据下述计算式,即可计算出样

品的取代度(DS 1)。

DS 1=(M NaOH ×V NaOH -M HCl ×V HCl )×162/W 样品

(1)

注:M NaOH 、M HCl 分别为NaOH 和HCl 的摩尔浓度

(mol/L );V NaOH 、V HCl 分别为NaOH 和HCl 的标定体积(L );W 样品为样品重量(g

)

图2　CM 2Abps 经离子交换后的红外光谱图

Fig.2　IR spectrogram of CM 2Abps by ion exchange

1.2.2　原子吸收光谱法[21]　将CM 2Abps 于105

℃下干燥6h ,进行钠原子吸收光谱分析,测得样品

中钠元素的质量分数(

ωNa %)。将所测得的钠元素质量分数代入下述计算式,即可计算出样品的取代

度(DS 2)。

DS 2=162×

ωNa /(2300-80×ωNa )(2)

1.2.3　傅立叶变换红外光谱法[21225]　将CM 2Abps

固体于105℃下干燥6h ,通过K Br 压片法制得薄

片,用Bio 2Rad F TS 2185傅立叶变换红外光谱仪检测。在其红外吸收光谱图上,利用G aussian 法分别测定表征2OCH 2COONa 中2COO 2反对称伸缩振动的～1600cm -1的吸收峰面积和表征葡萄糖环骨架振动的～930cm -1的吸收峰面积,以～930cm -1的吸收峰面积为内标用于定量计算,即可求出样品的取代度(DS 3)。113　羟乙基牛膝多糖(HE 2Abps )取代度的测定1.3.1　高效液相色谱法[18]　将HE 2Abps (3mg )溶

于0.2mol/L H 2SO 4(3mL )中,50℃下密闭水解1h ,BaCO 3中和至中性,反应液经Dowex 50×8(H +)除盐后,进行HPLC 分析得到四个主要峰(图3),将所测得的四个峰的峰面积代入下述计算式,即

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