第19章药物研究的生物化学基础

超速离心法
凝胶层析法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
3. 蛋白质的定量测定
（1） 物理性质：紫外分光光度法，折射率法， 比浊法。 （2） 化学性质：凯氏定氮法，双缩脲比色法， Folin-酚法，BCA法。 （3） 染色性质：考马斯亮兰G-250结合法、银染、
金染。
（4） 其他：荧光激发。
4.胶体金比色法 胶体金是一种带负电荷的疏水性胶体， 加入蛋白质后，红色转变为蓝色，595nm处 测定样品的吸收值，计算含量。
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG

半合成药物是指一个药物其部分结构由 天然资源得到，然后用化学合成法制得最终 产品或应用微生物转化将化学合成的中间产 物，通过某些生物合成步骤来解决药物合成 中难于进行的化学反应，从而获得最终有效
化合物。
三、生物技术
生物技术（biotechnology）又称生物 工程（bioengineering），是利用生物有机
溶液提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法
④根据配基特异性不同 亲和层析法
二、生物合成技术
生物合成是利用生物细胞的代谢反应
（更多的是利用微生物转化反应）来合成化
学方法难于合成的药物或药物中间体。

微生物转化反应: 是利用微生物的代谢作用来进行某些化 学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程 中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需 要的活性物质。
（六）细胞生长调节因子
1.细胞生长刺激因子类
2.细胞生长抑制因子类
（七）细胞凋亡的生物化学

细胞凋亡是某些生理或病理条件下，细胞接受 到某种信号所触发的并按一定程序进行的主动、缓 慢的死亡过程。 生化特征： （1）DNA片段化
（2）谷氨酰胺转移酶、钙蛋白酶激活：
如磷脂酰丝氨酸显露
（3）一些特殊蛋白质、RNA的产生和合成
二、新药筛选的生物化学方法
（一）放射配基受体结合法（RRA）
（二）酶学实验法
肝脏细胞色素P450系统
（三）膜功能研究方法
1.钙调蛋白-红细胞膜的制备及钙调蛋白功能测定 2.心肌细胞膜的制备与功能测定
（四）生化代谢功能分析法 1.降血糖药物实验法 2.调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验法
3.凝血药和抗凝血药实验法 （五）逆向药理学 基因→受体→药物
5. 生物质谱法：
多肽和蛋白质的分子量可用MALDI/MS
（基质辅助激光解吸离子化质谱法）或
ESI/MS（电喷雾离子化质谱法）直接测定，
用质谱法测定蛋白质的分子量简便，快速、
灵敏、准确。
（二） 核酸类药物的主要分析方法
1. 紫外分光光度法 ： 测定RNA与DNA含量260nm 2. 地衣酚显色法测定RNA含量
二、生物药物质量控制的生化分析方法
（一） 多肽与蛋白质类药物的主要分析方法 1. 蛋白质药物的纯度分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) SDS-PAGE 毛细管电泳(CE) 等电聚焦(IEF) 高效液相色谱法 (HPLC)
2. 多肽与蛋白质分子量的测定
使Hale Waihona Puke Baidu较多的是超速离心法，凝胶层析法和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。
T4 DNA连接酶 15º C
载体自连
重组体
目的基因自连
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
2. 平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
目的基因 自连
3. 同聚物加尾连接
体（动物、植物和微生物）或其组成部分
（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展
新产品或新工艺的一种技术体系。
基因工程
生物技术 细胞工程
酶工程 发酵工程
重组DNA技术（基因工程）基本原理：
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 重组DNA导入受体细胞
目的基因与载体的拼接
重组体的筛选
工程菌（或细胞）的大量培养
3，5-二羟甲苯
3. 二苯胺法测定DNA含量
（三） 酶类药物的分析
酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。 （四） 重组DNA药物中的可能杂质检查 1. 外源性DNA 2. 宿主细胞蛋白质 3. 二聚体或多聚体的测定 4. 降解产物的测定
第三节 药理学研究的生物化学基础
一、药物作用的生物化学基础 （一）神经传导与神经递质
第十九章 药物研究的生物化学基础
第一节 生物药物制造的生物化学基础
一、生物药物制备方法的特点
（1）目的物存在于组成非常复杂的生物材料中 （2）目的物在生物材料中含量极微 （3）生物活性成分离开生物体后，易变性破坏 （4）生物药物制造工艺设计理论性不强 （5）生物制药工艺多采用“逐级分离”法 （6）生物药物的均一性检测与化学上纯度概念不完 全相同。
第四节 与药物设计有关的生物化学原理
一、酶与药物设计 二、受体与药物设计 （一）受体介导的靶向药物设计
（二）药物与受体结合的构象分析
1．同源分子法 2．归纳法 3．演绎法 4．比较分子力场分析法
三、药物代谢转化与前体药物设计
研究药物代谢的主要目的是确定药物在
体内转化的途径，并定量地确定每一代谢途
2．基于生物大分子的结构知识进行的药物设计。
五、药物基因组学与药物研究
药物基因组学（Pharmacogenomics） 是研究影响药物作用，药物吸收、转运、代
谢、清除等基因差异的学科即决定药物作用
行为和作用敏感性的相关基因组科学，它是
以提高药物疗效与安全性为目的，对临床用
药具有重要指导作用。
药物基因组学在药学的应用：
分 切 接 转 筛 分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体菌 筛选重组体
DNA重组技术的主要应用：

1.运用DNA重组技术大量生产基因工程药物。
2.定向改造生物的基因结构，构建高产菌株，用
于改造传统制药工业。

3.用于基础研究，用于基因结构与基因组功能的 调节研究，用于分子杂交等。
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
（四）重组体的构建
即外源基因与载体的连接
1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接
配伍末端连接
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
在末端转移酶(terminal transferase)的
作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、
制造出粘性末端，再进行粘端连接。
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dATP A(A)nA 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 5´ 3´
（二）基因载体的选用
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA
噬菌体DNA
病毒DNA
载体的选择标准

能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
4．受体-转录因子型
高度可变区 DNA结合区 激素结合区
位于N端，具有转录活性 含有锌指结构
铰链区
位于C端，结合激素、热休克蛋 白，使受体二聚化，激活转录
（三）跨膜信号转导与细胞内信号转导
（1）不同种类的受体使用由共同组分构成的转导信号 （2）在信号转导通路中不同类型的磷酸化同时起作用
（四）细胞信号转导与药物研究
3´
3´
3´ A(A)nA
5´
3´ T(T)nT
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
（五）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)
导入方式 转化 (transformation) 转导 (transduction)
（六）重组体的筛选
1. 重组体的表型进行筛选
抗药性标记筛选、营养素的依赖筛选
2. 限制酶切图谱分析鉴定
3.利用核酸杂交技术进行鉴定
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择 ( )
目录
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
λDNA
促进组氨酸合成
重组体
组氨酸缺陷 型大肠杆菌
标 志 补 救
无组氨酸 的培养基
小 结
重组DNA技术操作过程可形象归纳为

（五）药物作用的靶酶
药物对靶酶的作用：
调节酶量
调节酶活力
酶抑制剂应用临床的条件：
（1）被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾
病的发生有关，具有治疗作用。 （2）酶抑制剂具有特异性。 （3）具有某种药动学特征，能到达作用部位、具有合 理、可预见的量效关系和作用持续时间。 （4）对人体毒性小，疗效指数高。 （5）应符合药品标准。
径及其中间体的药理活性。
四、生物大分子的结构模拟与药物设计
生物大分子结构模拟的药物设计有两个热点：
1．应用蛋白质工程技术改造具有明显生物功能 的天然蛋白质分子，以蛋白质的结构规律及其生物 功能为基础，通过分子设计和有控制的基因修饰以 及基因合成对现有蛋白质加以定向改造，构建最终 性能比天然蛋白质更加符合人类需要的新型活性蛋 白。
生物药物分离的主要原理：
1. 根据不同组分分配率的差别进行分离 萃取 分配层析 吸附层析 盐析 结晶

2. 根据生物大分子的特性
①根据分子形状和分子大小不同： 差速离心、超离心、膜分离透析、超滤、凝胶过滤 ②根据分子电离性质（带电性）不同： 离子交换法、电泳法、等电聚焦法 ③根据分子极性大小与溶解度不同：

信号转导分子的激动剂和抑制剂是信号 转导药物的研究出发点，尤其是各种蛋白激 酶的抑制剂更是被广泛用做母体药物进行抗 肿瘤新药。
信号转导干扰药物的药效和副作用 取决于：

一、它所干扰的信号转导途径在体内是否广 泛存在，如果广泛存在各细胞内，副作用难 以控制。 二、药物自身的选择性，对信号转导分子的 选择性越高，副作用越小。
与目的蛋白的生产
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)


质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
（三）限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 (restriction
围切割双链DNA的一类内切酶。
endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC + CCTAG G
第二节
药物质量控制的生物化学基础
一、药物质量控制的常用生化分析法
（一） 免疫分析法 1. 免疫扩散法 2. 免疫电泳法 3. 放射免疫测定法（RIA） 4. 酶联免疫测定法（ELISA）
就是让抗体或抗原与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
（二） 电泳分析法
（三） 酶法分析
1.终止反应法 2.连续测定法 3.循环放大分析法
是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜
胞浆面的外周蛋白，由、、 三个亚基组成。 有两种构象：非活化型；活化型
H
腺苷酸环化酶
R Ｒ
β β γ
GTP
α
γ
A A C C
GDP
cAMP
ATP
与配体结合后具有酪氨酸蛋白激酶活性，如胰 岛素受体insulin growth factor receptor, IGF-R 表 皮 生 长 因 子 受 体 (epidermal growth factor receptor, EGF-R)。
神经递质
又称突触分泌信号(synaptic signal) 特点 由神经元细胞分泌； 通过突触间隙到达下一个神经细胞；
作用时间较短。
例如： 乙酰胆碱、去甲肾上腺素等
（二）受体的结构与功能
1.受体-离子 通道型
乙酰胆碱受体功能模式图
2．受体-G蛋白-效应蛋白型
※ G蛋白(guanylate binding protein)